全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:720-725
文章编号:1001-6880(2015)4-0720-06
收稿日期:2014-10-08 接受日期:2015-01-06
基金项目:国家自然科学基金(81060261);广西自然科学基金
(2012GXNSFAA053021)
* 通讯作者 Tel:86-771-3272601;E-mail:wxwei@ gxu． edu． cn
响应面法优选双水相萃取分离珠子
草中木脂素 hypophyllanthin的方法
曹 洵，刘 盛，周 敏，林小霞，韦万兴*
广西大学化学化工学院，南宁 530004
摘 要:通过乙醇-硫酸铵双水相体系，以盐浓度(w /w)、醇浓度(w /w)、超声提取时间(min)为响应因素，根据中
心组合(Box-Benhnken)试验设计原理，采用三因素三水平响应面分析法确定木脂素 hypophyllanthin 的最佳分配
体系，并在此基础上用环己烷对上相进行液液选择性萃取纯化 hypophyllanthin。结果表明，双水相体系提取木脂
素 hypophyllanthin的最佳条件为:盐浓度 26． 54%、醇浓度 21%、超声提取时间为 20 min。在此条件下，hypophyl-
lanthin的分配系数可达 75． 82，对上相再次萃取 hypophyllanthin 的产率达 3． 18 mg /g，高于传统柱层析色谱法。
此方法操作简单、绿色环保、成本低廉，为木脂素 hypophyllanthin的分离提供了新的方法。
关键词:双水相;中心组合;木脂素;hypophyllanthin
中图分类号:O629． 9 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 04． 032
Optimization of Aqueous Two -phase Extraction of Lignans
Hypophyllanthin from Phyllanthus niruri Using Ｒesponse Surface Methodology
CAO Xun，LIU Sheng，ZHOU Min，LIN Xiao-xia，WEI Wan-xing*
School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China
Abstract:In this study，an aqueous two-phase system (ATPS) based on ethanol /(NH4) 2 SO4 was evaluated for the ex-
traction of lignans from Phyllanthus niruri． Box-Behnken design (BBD) was used to study the effects of salt concentra-
tion，ethanol concentration and ultrasonic extraction time on the partition behavior of main bioactive components lignans
hypophyllanthin． The results showed 26． 54% (w /w) (NH4) 2 SO4，21% (w /w) ethanol，20 min of ultrasonic extraction
for hypophyllanthin were the optimal conditions with partition coefficient of 76． 62． Furthermore，the cyclohexane was
used for another step extraction on upper phase，under which 3． 18 mg /g hypophyllanthin were obtained． The ATPS was
firstly used to separate and purify hypophyllanthin from P． niruri and higher yields were obtained comparing with tradi-
tional column chromatography． The developed ATPS method was easier，greener and cheaper． It provided a new approach
for the separation of hypophyllanthin．
Key words:aqueous two-phase extraction;Box-Behnken design;lignans;hypophyllanthin
珠子草，别名小返魂、叶下珠，为一年生大戟科
叶下珠属草本植物，全株可用于治疗痢疾、肝炎、黄
疸、肠炎、泌尿系统感染等疾病，具有通经镇痛、祛痰
止咳、抗菌止血、清热解毒、通便利尿等药效［1，2］。
据报道，珠子草主要含有黄酮和黄酮甙、生物碱、木
脂素等物质，而木脂素便是其主要活性成分之
一［3］。目前已分离得到的木脂素有 21 种［4］，其中
hypophyllanthin在抗炎［5，6］、抗乳腺癌［7］、抗肝细胞
损伤［8］上活性显著。传统分离纯化木脂素一般是
用柱层析色谱、大孔树脂、高速逆流色谱制备等方
法，但是大多操作复杂需要耗费大量有机溶剂。而
双水相萃取技术是利用组分在两相间分配的差异而
进行组分的分离与提纯［9］，具有操作简单、条件温
和易于放大等优点。本研究利用响应面法优选双水
相体系富集木脂素 hypophyllanthin 的最佳工艺条
件，并在此条件下通过环己烷对上相进行再次萃取
得到纯净木脂素 hypophyllanthin 化合物。此方法简
单、环保、廉价，产率明显高于传统柱层析色谱
法［10］，为木脂素 hypophyllanthin 的分离提供了新的
方法。
图 1 木脂素 hypophyllanthin的结构式
Fig. 1 Chemical structure of hypophyllanthin
1 材料与方法
1． 1 仪器与材料
高效 液 相 色 谱 仪 ( Thermo Fisher UItiMate
3000)，KQ5200B超声清洗仪(昆山市超声仪器有限
公司)，BSA224S 电子分析天平(赛多利斯科学仪
器)，微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器有限公
司)，乙腈为德国 Merck 色谱纯，其余试剂均为广东
西陇化工股份有限公司分析纯。
珠子草于 2012 年 11 月采自广西隆安县，共 100
kg，由西北大学生命科学学院倪士峰博士鉴定，标本
存放于本实验室，编号 06121。珠子草晾干后粉碎
至半厘米长，在 85 ℃下用乙醇回流 3 h，滤出浸提
液，残渣用乙醇继续回流提取两次。合并乙醇浸提
液，浓缩蒸干，用滴水沉降法除叶绿素，得珠子草浸
膏 416 g。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 双水相体系的制备
根据不同盐类双水相体系相图，利用无机盐在
混合体系中的盐析作用，分别改变盐和醇的浓度得
到不同的双水相体系。准确称取一定量的浸膏加入
其中，使体系总质量为 10 g。
1． 2． 2 木脂素 hypophyllanthin测定方法的建立
1． 2． 2． 1 色谱条件
采用 Acclaim C18 (2． 1 × 150 mm，3 μm，120)
色谱柱，乙腈-水(55:45)为流动相，流速:0． 4 mL /
min，柱温:30 ℃，检测波长:230 nm，进样量:10 μL。
1． 2． 2． 2 精密度试验
按 1． 2． 2． 1 条件取同一标准样品，连续进样 6
次，测定峰面积。结果表明，ＲSD为 0． 3%。
1． 2． 2． 3 稳定性试验
取同一样品，分别于 0、2、4、6、8、10 h 进样分
析，计算木脂素 hypophyllanthin 标准品的 ＲSD 为
1. 16%。
1． 2． 2． 4 标准曲线的绘制
准确称取木脂素 hypophyllanthin 标准品(实验
室自备，经 NMＲ、MS、IＲ、UV 鉴定其结构，HPLC 测
定其质量分数 ＞ 98% )0． 0045 g，用甲醇溶解定容于
25 mL 容量瓶中，按 5 倍浓度梯度稀释、进样，测定
峰面积值。以峰面积值为纵坐标、对照品浓度(mg /
mL)为横坐标作图得木脂素 hypophyllanthin 线性回
归方程:Y = 780． 2X-0． 7585，Ｒ2 = 0． 9998(0． 1800 ～
0． 0008 mg /L)，并在此范围内线性关系良好。
1． 2． 2． 5 样品分析
根据 1． 2． 2． 1 条件，对体系上下相分别用一定
量的甲醇稀释至 50 mL 容量瓶中除去无机盐，进样
检测，样品 HPLC 色谱图见图 2，按以下公式计算分
配系数(K)、回收率(Ｒ)与萃取量(Y)。
K = CtCb Ｒ(% ) =
CtVt
CtVt + CbVb Y(mg /g) =
CtVt
Ms
式中，Ct、Cb 分别为上下相浓度，mg /mL;Vt、Vb
为上下相体积，mL;Ms 为加入珠子草浸膏质量，g。
图 2 样品的 HPLC色谱图
Fig. 2 HPLC chromatogram of P． niruri sample
1． 2． 3 单因素试验
1． 2． 3． 1 盐种类影响
分别 称 取 一 定 量 的 ( NH4 ) 2SO4、K2CO3、
NaH2PO4 分析纯，按 1． 2． 1 方法制备盐浓度为
17%，醇浓度为 25%的双水相体系，木脂素 hypophy-
llanthin的分配系数见图 3。综合溶解与分相速率，
因此选定硫酸铵-乙醇双水相体系。
图 3 不同双水相体系对木脂素分配系数的影响
Fig. 3 Effect of different aqueous two-phase systems on the
partition coefficient (K) of lignans
1． 2． 3． 2 醇浓度影响
准确称取 0． 5 g珠子草浸膏，根据 1． 2． 1 方法，
保持盐浓度一定，乙醇浓度在双水相的形成范围内
递增，结果见图 4。木脂素 hypophyllanthin的分配系
127Vol. 27 曹 洵等:响应面法优选双水相萃取分离珠子草中木脂素 hypophyllanthin的方法
数和回收率呈递增趋势后保持稳定。当体系中醇浓
度增大，上相中乙醇浓度也相应增加，导致疏水性类
木脂素 hypophyllanthin也主要富集在上相。因此选
定乙醇浓度为 22% ～28%为最佳单因素试验范围。
图 4 醇浓度对分配系数与回收率的影响
Fig. 4 Effect of ethanol concentration on the partition coeffi-
cients and recoveries
注:▲表示分配系数，△表示回收率。下同。
Note:▲:partition coefficients，△:recoveries． Same as below．
1． 2． 3． 3 盐浓度影响
准确称取 0． 5 g 珠子草浸膏按 1． 2． 1 方法，使
乙醇浓度保持一定，盐浓度在双水相的形成范围内
依次递增，结果见图 5。木脂素 hypophyllanthin的分
配系数和回收率呈递增趋势。这主要是由于盐浓度
增大后导致的盐析效应使乙醇在上相中浓度也增
大，所以 hypophyllanthin 也主要富集上相。因此选
定盐浓度为 21% ～25%为最佳单因素试验范围。
图 5 盐浓度对分配系数与回收率的影响
Fig. 5 Effect of salt concentration on the partition coeffi-
cients and recoveries
1． 2． 3． 4 温度的影响
根据 1． 2． 1 方法，准确称取 0． 5 g 珠子草浸膏，
加入到盐浓度为 17%，醇浓度为 25%的双水相体系
中。在 25 ～ 50 ℃内，以温度影响对木脂素 hypophy-
llanthin的分配系数与回收率做单因素试验，结果见
图 6。结果表明，温度对木脂素 hypophyllanthin的分
配影响较小，因此选定室温(25 ℃)为最佳单因素试
验温度。
图 6 温度对分配系数与回收率的影响
Fig. 6 Effect of temperature on the partition coefficients and
recoveries
1． 2． 3． 5 超声提取时间的影响
准确称取 0． 5 g珠子草浸膏，根据 1． 2． 1 方法，
加入到盐浓度为 17%，醇浓度为 25%的双水相体系
中，在室温下(25 ℃)超声提取时间逐渐增加，木脂
素 hypophyllanthin的分配系数递增后逐渐减小，结
果见图 7。可能原因是由于超声耦合，体系浑浊，上
相中亲水性物质成小颗粒状由上相分散到下相中。
当时间超过 20 min，部分亲脂性物质也会同时进入，
导致分配系数减小。因此，我们选定超声时间在 5
～ 20 min为最佳单因素试验范围。
图 7 超声提取时间对分配系数与回收率的影响
Fig. 7 Effect of ultrasonic extraction time on the partition
coefficients and recoveries
1． 2． 4 响应面法试验设计
根据响应面法中心组合(Box-Benhnken)试验设
计原理，选用 Design-Expert 8． 0． 5 软件为辅助手段
设计响应面试验，以乙醇浓度(w /w)、盐浓度(w /
w)、超声提取时间(min)为自变量，木脂素 hypophy-
llanthin的分配系数为响应值，用三水平三因素响应
面法确定最佳分配体系。响应面的因素水平见表
1。
1． 2． 5 响应面优化
根据中心组合(Box-Benhnken)试验设计原理，
综合单因素试验影响结果，以乙醇浓度(A)、盐浓度
(B)、超声提取时间(C)为自变量，木脂素 hypophyl-
227 天然产物研究与开发 Vol. 27
lanthin的分配系数为响应值，通过三水平三因素响 应面法确定最佳分配体系。试验设计见表 2。
表 1 响应面实验因素水平表
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
水平
Level
因素 Factor
A醇浓度
Ethanol concentration
(w /w)
B盐浓度
Salt concentration
(w /w)
C超声提取时间
Ultrasonic extraction time
(min)
+ 1 21% 22% 5
0 23% 25% 12． 5
-1 25% 28% 20
表 2 响应面法试验设计及结果
Table 2 Experimental design and results of response surface experiment
试验号
No． A(w /w) B(w /w) C(min)
分配系数
Partition coefficient
(K)
1 25(0) 21(-1) 5(-1) 59． 00
2 22(-1) 23(0) 20(1) 65． 66
3 25(0) 23(0) 12． 5(0) 62． 82
4 28(1) 25(1) 12． 5(0) 65． 92
5 25(0) 23(0) 12． 5(0) 65． 19
6 25(0) 23(0) 12． 5(0) 64． 72
7 22(-1) 21(-1) 12． 5(0) 61． 09
8 28(1) 23(0) 20(1) 72． 38
9 25(0) 21(-1) 20(1) 74． 23
10 25(0) 25(1) 5(-1) 66． 35
11 22(-1) 23(0) 5(-1) 53． 15
12 28(1) 23(0) 5(-1) 57． 16
13 25(0) 25(1) 20(1) 71． 18
14 25(0) 23(0) 12． 5(0) 63． 62
15 25(0) 23(0) 12． 5(0) 64． 83
16 28(1) 21(-1) 12． 5(0) 66． 88
17 22(-1) 25(1) 12． 5(0) 63． 02
2 结果与讨论
2． 1 响应面法试验结果与分析
选用 Design-Expert 8． 0． 5 软件对表 2 数据进行
多元回归拟合，得到二次多项回归方程:Kh = 64． 24
+ 2． 43A + 0． 66B + 5． 97C － 0． 72AB + 0． 68AC －
2. 60BC －2． 81A2 + 2． 82B2 + 0． 66C2。
方差分析与回归系数显著性检验结果见表 3，
模型 P值为 0． 0002，说明所建模型模拟实际的三因
素三水平分析合理可靠、效果显著，各因素间也并不
是简单的线性关系。实验值与二次多项方程预测值
的相关系数 Ｒ2 = 0． 9705，表明 97． 05%的实验数据
可以用此模型来进行解释。由 F 值的大小可以判
断，在所选的试验范围内，三个因素对木脂素 hy-
pophyllanthin分配系数影响的排序为:超声提取时
间(C) ＞醇浓度(A) ＞盐浓度(B)。对二次多项回
归方程去一阶偏导数等于零，得到双水相体系上相
富集木脂素 hypophyllanthin 最佳提取条件:盐浓度
为 26． 54%，醇浓度为 21%，超声提取时间为 20
min。在此条件下，木脂素 hypophyllanthin 的分配系
数为 76． 62。经三次平行实验，分配系数为:75． 16、
74． 37、75． 82，实验值与预测值基本符合。
327Vol. 27 曹 洵等:响应面法优选双水相萃取分离珠子草中木脂素 hypophyllanthin的方法
表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
方差来源
Source
平方和
Sum of Squares
自由度
DF
F值
F value
P值
P value
模型 Model 431． 66 9 25． 55 0． 0002*
A 47． 14 1 25． 11 0． 0015*
B 3． 47 1 1． 85 0． 2161
C 285． 49 1 152． 07 ＜ 0． 0001＊＊
AB 2． 09 1 1． 11 0． 3266
AC 1． 84 1 0． 98 0． 0048*
BC 27． 04 1 14． 40 0． 3556
A2 33． 14 1 17． 65 0． 0040*
B2 32． 94 1 17． 55 0． 0041*
C2 1． 82 1 0． 97 0． 3579
残差 Ｒesidual 13． 14 7
失拟项 Lack of Fit 9． 26 3 3． 18 0． 1465
净误差 Pure error 3． 88 4
总离差 Cor Total 444． 81 16
注:* 差异显著，P ＜ 0． 05;＊＊差异极显著，P ＜ 0． 001。
Note:* means significant difference，P ＜ 0． 05;＊＊ means extremely significant difference，P ＜ 0． 001．
图 8 K = f(A，B)的响应面与等高线图
Fig. 8 Ｒesponse surface and contour plots of K = f(A，B)
2． 2 因素间的交互影响
由图 8 两因素交互作用的等高线图可以直接得
到响应面的最高点，而响应面三维图可以看出参数
范围内的极值大小以及各因素之间交互作用对响应
值的影响。根据方差分析表 3 可知，超声提取时间
与乙醇浓度交互作用影响最显著。当体系中的醇在
浓度范围内增大，疏水性类木脂素在超声耦合的作
用下重新分配，大量富集在上相。但超声时间太长，
体系浑浊，部分木脂素可能进入下相，而下相当中的
一些杂质同时进入上相，导致木脂素 hypophyllanthin
的分配系数反而降低。从总体上看，超声提取时间
对 hypophyllanthin的分配影响最显著，醇浓度与盐
浓度的影响次之。因此，在醇浓度较大、超声提取时
间较长的范围内可以达到响应值的最高点。
2． 3 纯化
根据 2． 1 分析结果，按响应面优化的最佳提取
工艺同时增大双水相体系与珠子草浸膏比例制备混
合体系，取出上相用环己烷选择性萃取两次，浓缩、
重结晶，得到木脂素 hypophyllanthin 白色晶体，产量
为 3． 18 mg /g，萃取液相图见图 9。
图 9 萃取次数的色谱图
Fig. 9 HPLC chromatograms of different extraction processes
427 天然产物研究与开发 Vol. 27
2． 4 讨论
本文研究了以乙醇-硫酸铵构成的双水相体系
用于珠子草中木脂素 hypophyllanthin 的提取分离，
采用综合响应面法优化了双水相体系的提取工艺，
探究了盐浓度、醇浓度、超声提取时间三个单因素变
量对木脂素 hypophyllanthin分配系数的影响。实验
结果表明，盐浓度为 26． 54% (w /w)，醇浓度为 21%
(w /w)，超声提取 20min 时为最佳提取工艺。在此
条件下，hypophyllanthin 的分配系数可达到 75． 82，
对上相再次萃取 hypophyllanthin的产率达 3． 18 mg /
g，高于传统柱层析色谱法。本实验操作简单、绿色
环保、成本低廉，所采用的响应面三维图使各影响因
素的趋势更加直观明了，实验精确度明显提高。该
方法简单高效，为木脂素 hypophyllanthin 的分离提
供了新的方法。
致谢:感谢国家自然科学基金与广西自然科学
基金对本课题的资助!
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