全 文 ：收稿日期:2013－04－14．
基金项目:湖北省教育厅 B类项目(B20111902)．
作者简介:李伟(1975－ ) ，男，讲师，主要从事生物资源的开发与利用研究．
火棘果黄酮提取工艺优化及其抗氧化作用
李 伟，田 成，汪 满，程 超
( 湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)
摘要:基于单因素实验，用 PB实验对影响火棘果黄酮得率的因素进行评价，筛选出具有显著效应的二个因素—粒
径和提取次数; 用响应面分析法确定了主要影响因素的最佳提取条件，最后得出火棘果黄酮最佳提取工艺为 50%
丙酮，料液比 1 ∶ 60，温度为 70℃，1h，粒径为 100目，提取 2次，在此条件下火棘果总黄酮得率为 65．45mg /g．在不同
抗氧化体系中火棘果黄酮抗氧化效果不同，其中对 ABTS和 DPPH自由基的清除效果远强于 PG，但对·OH的清除
效果弱于 PG．
关键词:火棘果;黄酮; PB实验;中心组合实验;抗氧化
中图分类号:TS201．2 文献标志码:A 文章编号:1008－8423(2013)02－0145－04
Extraction Optimization and its Antioxidant Activities of Flavonoides
from Pyracantha fortuneana (Maxim．)Li Fruits
LI Wei，TIAN Cheng，WANG Man，CHENG Chao
(School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)
Abstract:The factors，which mostly influenced the flavonoides extracting rate were evaluated by PB ex-
periment based on single－factor experiment，the two notable factors were selected，and the extracting con-
ditions were optimized by response surface analysis．The optimal extracting conditions of Pyracantha fortu-
neana (Maxim．)Li fruits were as follows:50% acetone，solid－liquid ratio 1:60，temperature 70℃，1h，
particle size of 100 mesh，extracted twice．The flavonoides rate was 65．45 mg·g－1 in these conditions．The
antioxidant activities of flavonoids of the fruit were different in different antioxidant system，the inhibition
effect on ABTS and DPPH were better than PG，but the inhibition effect on OH was weaker than PG．
Key words:fruit of Pyracantha fortuneana;flavonoides;PB experiment;central component design;antiox-
idant activity
火棘(Pyracantha fortuneana)果实，又叫赤阳子、救军粮，主要分布在我国东南和西南部，也是恩施地区
主要野生植物之一．火棘始载于《滇南本草》，其果实性味干酸，药用具有健脾消积、生津止渴、消热解毒，活血
止血等功效［1］．黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤癌变、抗心血管疾病等广泛的生理活性和药
理活性，越来越受到重视［2］．
前人对火棘果黄酮的报道主要有其清除自由基、降血脂、增强免疫力、促进消化等生理功能，此外还对其
中的黄酮类物质的种类进行了研究，发现其中主要是槲皮素和芦丁等［3－5］．但系统有效地研究影响火棘果黄
酮的得率的因素报道较少．Plackett－burman设计可通过较少的实验次数，从众多影响因素中筛选出主要的影
响因子［6］，因此本文在单因素实验基础上，利用 PB 实验筛选出对火棘果黄酮得率影响最为显著的因素，并
采用中心组合实验对影响最为显著的几个因素进行优化．此外对火棘果的体外抗氧化作用进行试验，以期为
火棘的综合利用提供依据．
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
火棘果:采摘于恩施市龙洞河成熟火棘果，60℃烘干粉碎备用;乙醚、乙醇、丙酮、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧
化钠、硫酸亚铁、双氧水、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、PG(没食子酸丙酯)、芦丁，邻菲罗啉(国药集
第 31卷第 2期 湖北民族学院学报(自然科学版) Vol．31 No．2
2013年 6月 Journal of Hubei University for Nationalities(Natural Science Edition) Jun．2013
团化学试剂有限公司，分析纯) ;2，2－二氮－双(3－乙基苯并噻唑－6－磺酸) (日本东京化成工业株式会社) ;
ＲE－2000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ;HH－4型数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限
公司) ;DL－5型低速大容量离心机(上海安亭) ;756MS紫外可见分光光度计(上海精科)．
1．2 实验方法
1．2．1 黄酮含量测定 参照文献［7］对黄酮含量进行测定．以芦丁为标准品，以其质量(mg)为横坐标，吸光
度 A510nm为纵坐标绘制标准曲线，可得回归方程为 y= 0．3991x－0．0178，Ｒ
2 = 1．
火棘果黄酮含量测定:利用乙醚对火棘果黄酮进行脱脂，而后称取一定量的火棘果粉末，按不同处理进
行黄酮浸提，将火棘果黄酮浸提液 4 000r /min离心 15 min，取上清液定容至 25 mL，取 0．5 mL，按照标准曲线
的方法测定吸光度值，按下式计算黄酮得率．
火棘果黄酮得率(mg·g－1)=
A510+0．0178
0．3991×V×W
×V总
V:测定时取样体积(mL) ;V总:浸提液总体积(mL) ;W:火棘果重量(g)．
1．2．2 火棘果黄酮的浸提工艺优化［8］ 对影响黄酮浸提效果的浸提溶剂进行优化，而后分别对料液比、原
料粉碎粒径、浸提温度、浸提时间、浸提次数进行优化，在此基础上用 PB 实验筛选出影响最为显著的因素，
最后用中心组合实验对最佳浸提工艺进行优化．
1．2．3 火棘果黄酮的抗氧化作用 按照最佳浸提工艺提取脱脂火棘果的黄酮类物质，旋转浓缩后，冷冻干
燥备用．分别配制一定浓度的火棘果黄酮溶液和 PG 溶液，按文献［9－10］的方法测定对 DPPH、ABTS、·OH
的清除作用．
1．2．4 数据分析 采用 SPSS16．0软件和 minitab软件进行统计分析．
2 结果与分析
2．1 单因素实验
对影响黄酮得率的主要参数如浸提溶剂、浸提溶剂浓度、料液比、温度、粒径、浸提时间和浸提次数分别
进行单因素实验，结果见图 1．
A．浸提溶剂及溶剂浓度;B．料液比;C．粉碎目数;D．浸提温度;E．浸提时间;F．浸提次数
图 1 单因素对火棘果黄酮得率的影响
Fig．1 The effect of single－factor on extracting rate of flavonoides from Pyracantha fortuneana (Maxim．)Li Fruits
由图 1可见，丙酮浸提效果优于乙醇，随丙酮浓度增加，黄酮得率增加，当丙酮浓度为 80%时达到最高值，
641 湖北民族学院学报(自然科学版) 第 31卷
表 1 Plackett－burman试验参数与水平
Tab．1 Factors and levels of Plackett－burman experiment
代码 因素 －1 1 代码 因素 －1 1
A 丙酮 50 80 D 温度 55 70
B 料液比 1 ∶ 30 1 ∶ 60 E 时间 1 3
C 粒径 60 100 F 次数 1 3
表 4 中心组合实验设计因素水平
Tab．4 Factors and levels of central composite design
代码 因素 －1．414 －1 0 1 1．414 Δj
A 粒径 60 80 100 120 140 20
B 次数 0．5 1 2 3 3．5 1
注:0．5次:以浸提时间为 0．5 h表示;3．5次:以浸提 3次，在浸提
0．5 h表示．
表 6 中心组合实验的回归方程的方差分析
Tab．6 The variance analysis of central composite design
来源 自由度 AdjSS AdjMS F P
回归 5 2860．66 572．13 26．36 0．000
线性 2 476．51 238．25 10．98 0．007
平方 2 2302．52 1151．26 53．04 0．000
交互作用 1 81．63 81．63 3．76 0．094
失拟 3 134．56 44．85 10．31 0．024
之后开始下降．料液比增加，黄酮得率增加，考虑生产成本，实验选择 1:60料液比;火棘果黄酮得率随粉碎目
数增加而增加，当粉碎目数为 100目时，黄酮得率达最高值，随后下降;黄酮得率随浸提温度升高而增加，当
温度为 70℃，80%丙酮达沸腾黄酮得率最高;浸提时间越长，黄酮得率有所增加，但当浸提时间超过 1 h 时，
黄酮得率反而下降．浸提次数越多，黄酮得率越高，但第
二次和第三次黄酮得率差异不显著(sig． = 0．455)．
2．2 主因素筛选实验
在单因素实验的基础上，确定 PB 实验的因素与水
平，具体见表 1和表 2．
利用 minitab 软件对 PB 实验结果进行分析，回归模
型系数的显著性分析见表 3．
表 2 Plackett－burman 试验设计及结果
Tab．2 Design and results of Plackett－burman experiment
序号 A B C D E F 黄酮得率 /(mg·g－1) 序号 A B C D E F
黄酮得率 /
(mg·g－1)
1 1 －1 1 －1 －1 －1 21．65 7 1 －1 1 1 －1 1 19．40
2 －1 1 1 －1 1 －1 29．70 8 1 1 －1 1 －1 －1 24．84
3 －1 －1 1 1 1 －1 20．10 9 1 1 －1 1 1 －1 24．38
4 －1 －1 －1 －1 －1 －1 14．45 10 －1 1 1 1 －1 1 36．78
5 －1 －1 －1 1 1 1 24．00 11 1 －1 －1 －1 1 1 16．30
6 －1 1 －1 －1 －1 1 26．26 12 1 1 1 －1 1 1 37．46
表 3 Plackett－burman试验显著性检验
Tab．3 Significant analysis of Plackett－burman experiment
项 效应 系数 T P 项 效应 系数 T P
常数 39．145 29．21 0．000 D 4．263 2．132 1．59 0．173
A 0．304 0．152 0．11 0．914 E 3．172 1．586 1．18 0．290
B 2．622 1．311 0．98 0．373 F 9．690 4．854 3．62 0．015＊＊
C －16．059 －0．8030 －5．99 0．002＊＊
由表 3的结果分析可以看出，粒径和浸提次数对黄酮得率的影响达到了极显著水平(P＜0．05) ，因此选
择这两个因素进行中心组合实验．
2．3 中心组合实验
在 50%丙酮，料液比 1 ∶ 60，温度为 70℃，1 h 条
件下，对影响火棘果黄酮浸提的粒径和提取次数进
行中心组合实验，结果见表 4和表 5．
回归方程为 y= 64．80+1．482A+8．628B－12．41A2
－2．737B2－4．518AB．
表 5 中心组合实验设计结果
Tab．5 Ｒesults of central composite design
序号 A B 黄酮得率 /(mg·g－1)序号 A B
黄酮得率 /
(mg·g－1)
1 1 1 40．11 8 0 0 65．45
2 0 0 65．43 9 －1．414 0 26．46
3 －1 1 52．55 10 0 0 63．59
4 0 0 61．73 11 0 －1．414 42．33
5 1 －1 31．69 12 0 0 56．77
6 0 1．414 55．49 13 －1 －1 26．06
7 1．414 0 39．66
通过 minitab软件分析得出，火棘果黄酮的最优工艺为:粒径 100 目，提取次数 2 次，在此条件下火棘果
黄酮得率的预测值为 64．80 mg /g，实测值为 65. 45 mg /g．
741第 2期 李 伟等:火棘果黄酮提取工艺优化及其抗氧化作用
图 2 黄酮得率与粒径和提取次数的响应面
Fig．2 The response surface of flavonoid rate
and extracting times and particle
图 4 火棘果黄酮对·OH的清除作用
Fig4 The elimination effect on OH of flavonoid
from Pyracantha fortuneana (Maxim．)Li Fruit
2．4 火棘果黄酮的抗氧化作用
2．4．1 对 ABTS和 DPPH自由基的清除作用 根据图 3火棘果黄酮和
PG对 ABTS和 DPPH自由基清除率的回归方程可分别计算出，火棘果
黄酮对 ABTS和 DPPH的 IC50为 5．874和 1．413μg /mL，而 PG对 ABTS
和 DPPH 的 IC50为 89．395 和 10．956 μg /mL．由此可见火棘果黄酮对
ABTS和 DPPH自由基的清除效果远远优于 PG．
2．4．2 对·OH的清除作用 由图 4中的回归方程可分别计算出火棘
果黄酮和 PG对·OH 的 IC50分别为 0．2620 和 0．064 1 mg /mL，由此可
见火棘果黄酮对·OH的清除效果弱于 PG．
A．火棘果黄酮;B．PG
图 3 火棘果黄酮和 PG对 ABTS和 DPPH自由基的清除作用
Fig．1 The elimination rate on ABTS and DPPH of PG and
flavonoids from Pyracantha fortuneana (Maxim．)Li Fruits
3 小结
通过 PB实验可以得出，火棘果的粉碎粒径及提取次数对火棘果黄酮得率影响最大，中心组合实验得出
火棘果黄酮的最佳浸提工艺为在 50%丙酮，料液比 1:60，温度为 70℃，1 h，粒径为 100 目，提取两次，在此条
件下火棘果总黄酮得率为 65．45 mg /g．此外火棘果黄酮对 ABTS和 DPPH的自由基清除率高于 PG，但是对·
OH的清除率弱于 PG．
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841 湖北民族学院学报(自然科学版) 第 31卷