全 文 ：分子植物育种，2010年，第 8卷，第 1期，第 139-144页
Molecular Plant Breeding, 2010, Vol.8, No.1, 139-144
研究资源
A Resource
狼毒大戟 cDNA文库构建及 EST测序
许德荣 1 唐其 2 梁延海 3 曹海波 3 王雪松 3 赵厚坤 3 李云龙 3 刘光 3 刘官久 3 邱德有 1*
1中国林业科学研究院林业研究所,北京, 100091; 2中国医学科学院,北京协和医学院药用植物研究所,北京, 100193; 3大兴安岭林业集团公
司农林科学研究院,加格达齐, 165000
*通讯作者, qiudy@caf.ac.cn
摘 要 狼毒大戟为大戟科多年生草本植物。本研究以狼毒大戟(Euphorbia fischeriana)为试验材料，构建狼毒
大戟 cDNA文库及 EST测序。研究结果表明，我们成功地构建了狼毒大戟的 cDNA文库，并获得了 2 099个
EST的序列。进一步对这些 ESTs数据进行了 Unigene的拼接、ORF预测和相应的功能注释及分类，发现了一
些可能参与 Prostratin 生物合成的候选结构基因 Transketolase, NADPH-cytochrome P450 reductase,Cy-
tochrome P450, S-adenosylmethionine synthetase, acetyltransferas, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase
(DXP)和候选调节基因 AP2类 ERF转录因子(AP2-like ethylene-responsive transcription factor, AP2-like ERF)，
此研究为今后开展抗 HIV次生代谢物 Prostratin的代谢工程奠定了基础。
关键词 狼毒大戟, Prostratin, cDNA文库,表达序列标签
cDNA Library Construction and EST Sequencing of Euphorbia fischeriana
Xu Derong 1 Tang Qi 2 Liang Yanhai 3 Cao Haibo 3 Wang Xuesong 3 Zhou Houkun 3 Li Yunlong 3 Liu
Guang 3 Liu Guanjiu 3 Qiu Deyou 1*
1TheResearch Institute of Forestry, ChineseAcademyofForestry, Beijing, 100091; 2 Institute ofMedicinal PlantDevelopment, ChineseAcademyofMedi-
cal Sciences&PekingUnionMedical College, Beijing, 100193; 3 TheAcademyofAgricutural and Forestry Sciences, Daxinganling Forest Group Co., Ltd.,
Jiagedaqi, 165000
* Corresponding author, qiudy@caf.ac.cn
DOI: 10.3969/mpb.008.000139
Abstract Euphorbia fischeriana is a perennial herbaceous plant of Euphorbiaceae. In this research, we employed
Euphorbia fischeriana to be as materials for constructing a cDNA library, and then sequencing acquired EST. Here
we presented that we sucessfully constructed a cDNA library of Euphorbia fischeriana with sequenced 2099 ESTs.
Further we analyzed these ESTs datas by Unigene assembly, ORF prediction, funtional annotation and classifica-
tion, we found some candidate structural genes, which might be involved in biosynthesis of Prostratin, such as,
Transketolase, NADPH—cytochrome P450 reductase, Cytochrome P450, S-adenosylmethionine synthetase,
acetyltransferas, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXP), and candidate regulatory genes AP2-like ERF.
This work would provide much more EST information for developing Prostratin metabolic engineering in the fu-
ture.
Keywords Euphorbia fischeriana, Prostratin, cDNA library, Expression sequence tags
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基金项目：本研究由中国林业科学研究院林业研究所重点项目(ZD200902)资助
狼毒大戟(Euphorbia fischeriana)为大戟科多年
生草本植物，分布在我国黑龙江、内蒙古、吉林等部
分省区，已有学者对狼毒大戟的活性成分或作用进
行了研究，研究发现它含有杀虫、杀菌、抗癌及抗
HIV等多种次生代谢物质。刘桂芳等(1988)从狼毒大
戟中分离到抗癌活性成分二萜内酯 Jolkinolide B、
Jolkinolide A 和 17-hydroxyjolkinolide B；王玉玲等
(1992,中成药, 14(4): 34-35)对狼毒大戟抗癌活性成
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分 D (Jolkinolide B)的含量进行了测定，旨在为控制
药材的质量提供依据；孙志刚等(1999, 山东中医杂
志, 18(6): 246-248)对狼毒大戟蛋煎剂对消化道腺癌
术后患者的长期缓解作用进行了临床研究，发现此
制剂可显著抑制肿瘤生长，明显延长腺癌术后的缓
解期，防止转移和复发，并使部分患者达到完全缓
解；赵奎君等(2000)对 5种狼毒大戟提取物对结核杆
菌抗菌作用进行了比较研究，结果发现 5种提取物
都有不同程度的抑菌作用，其中以石油醚部分抑菌
的效果最强；刘文粢等(2000)从狠毒大戟中分得的两
个二萜内酯化合物：16-hydroxypseudojolkinolide B
和 jolkinolide B，并发现它们对人红白血病 K562细
胞及人鼻咽癌 CNE2细胞的抑制作用呈现出明显的
量效关系，16-hydroxypseudojolkinollde B的 IC50与
阿霉素相当；徐德昌等 (2005,中国林副特产, 76 (3):
7-9)采用气相色谱-质谱联机方法对狠毒大戟化学成
分进行了定性分析，初步确定其主要的化学成分及杀
虫活性成分；马承惠等 (2005, 中国科技信息, 12:
65,89)对从白屈菜、狼毒大戟这两种有毒植物提取的
活性物防治油松毛虫的效果进行了研究，发现狼毒大
戟提取物配制的杀虫剂防治油松毛虫死亡率为 10%。
二萜类化合物 Prostratin 最早由 Cashmore 等
(1976)从新西兰植物稻花一种(Pimelea prostrata)中分
离得到。近年来，人们在太平洋岛国萨摩亚的 Ma-
mala树 Homalanthus nutans中也分离到了该二萜类
化合物并且发现 Prostratin能够激活潜伏的 HIV病
毒，表现出良好的抗 HIV的活性(Gustafson et al.,1992;
Gulakowski et al.,1997; Hezareh, 2005)，有望开发成
一种新药, 但人们经研究发现 Mamala树资源很少，
其中的 Prostratin的含量很低(Johnson et al., 2008)。我
国的学者在狼毒大戟(Euphorbia fischeriana)的根中
发现它含有 Prostratin，但其 Prostratin的含量也很低
(Ma et al., 1997; Wang et al., 2006)。去年 Prostratin的
半合成在美国获得成功(Wender et al., 2008)，但人们
普遍认为此实验室的方法离大规模工业化生产
Prostratin还有一定的距离。尽管人们对该种植物具
有杀虫、杀菌及抗癌生物活性物质进行了研究，但如
何提高狼毒大戟中 Prostratin 的产量这个重要问题
还未见有研究报道。
近年来，美国华盛顿州立大学的 Croteau教授实
验室对二萜类化合物紫杉醇生物合成进行了较深入
的研究，已经克隆了 20个紫杉醇生物合成基因中的
14个基因和一个分支途径中的基因 (Walker et al.,
2000; Schoendorf et al., 2001; Jennewein et al., 2001;
2003; Walker and Croteau, 2000a; 2000b; Walker et al.,
2002a; 2002b; Croteau et al., 2006)。在他们的工作中，
大部分紫杉醇生物合成相关基因是通过构建 cDNA
文库和大规模 EST测序来获得的 (Jennewein et al.,
2004)。受他们工作的启发，我们也尝试利用类似的方
法开展 Prostratin生物合成基因的克隆工作，准备为
今后获得 Prostratin产量得到显著提高的细胞系或植
物株系提供理论依据和技术支撑。基于此目的，本研
究开展了狼毒大戟 cDNA文库构建及表达序列标签
(expression sequence tags, ESTs)测序的研究工作。
1结果与分析
1.1 RNA的提取和 cDNA的合成
狼毒大戟根总 RNA 提取后进行电泳检测，
RNA比较完整(图 1A)。紫外分光光度计测定结果
表明，狼毒大戟根总 RNAOD260/OD280的比值为 1.86，
OD260/OD230的比值为 2.51，RNA 的浓度 559 ng/μL，
纯度高、完整性好，符合 cDNA合成的需要，可用于后
续建库实验。cDNA合成反应结束后，取 5 μL合成产
物于 10%含 EB的胶上电泳检测 cDNA合成结果(图
1B)。结果显示 Smear条带在 0.1~3.0 kb之间，包括了
大多数全长的 cDNA片段。
1.2菌落 PCR鉴定
计算平板上的库容数，约 400个，所以菌液滴度
是 400÷2×1 000=2×105，以整个连接体系计算库容为
400÷2×1 500×8/2=1.2×106个克隆。挑取 30个克隆进
行菌落 PCR鉴定。待 PCR反应进入 4℃后，取下
PCR薄壁管，取 7 μL PCR产物加入 3 μL溴芬兰跑
图 1狼毒大戟根总 RNA及 cDNA合成产物凝胶电泳图
注: A: 1:总 RNA; B: cDNA合成产物; M: DL2000 plus marker;
1: cDNA二链
Figure1 Gel electrohporesis of total RNA isolated from Euphor－
bia fischeriana root and cDNA synthesis product
Note: A: Total RNA; B: cDNA synthesis product; M: DL2000
plus marker; 1: cDNA Second-strand
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电泳，半小时后照相，获得胶图(图 2)，左侧上的是
DL2000 plus marker。根据胶图可知插入片段大部分
分布在 1~2 kb之间，平均大于 1 kb，小片段率不高，
达到了建库要求。
acetyltransferas、1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate syn-
thase (DXP)等这些可能参与 Prostratin生物合成的候
选结构基因很可能不是 Prostratin生物合成的全部候
选基因，今后我们将扩大 EST的测序数量或通过全
基因转录组测序来解决此问题。Keasling教授和我们
现在正在做的工作，将有望为今后获得 Prostratin产
量得到显著提高的细胞系或植物株系提供技术支撑
和物质保障。
3结论
本试验开展了狼毒大戟 cDNA文库构建及表达
序列标签(expression sequence tags, ESTs)测序的研究
图 2菌落 PCR鉴定
Figure 2 Identification of colony PCR
1.3 EST测序
首先，我们抽样检测了 198个克隆，测序结果比
对正常，有 0.52%比对上了拟南芥；有 1.56%比对上了
乳浆大戟；有 0.52%比对上了野生大豆；有 0.52%比对
上了巴西橡胶树；有 6.76%比对上了欧洲山杨；有
0.52%比对上了蓖麻，共 29.69%，无同源序列 70.31%。
根据测序结果：重组率为 91%。接着，我们再保菌 26
板，提质粒 26板，3730Bigdye测序 26板，成功获得了
平均读长 783 bp(去除载体序列后为 653 bp)、最小读
长 109 bp的 EST数据 2 099条，其中高质量的 EST
数据 1884条。我们对所有测序数据进行了去低质
量，去载体，给出基本的数据。对数据进行 Unigene
拼接，获得了 1 582个 Unigene，Unigene的平均长度
为 690 bp,它们的冗余率为 16.03%。这些 Unigene的
ORF预测后功能注释及分类结果见图 3。我们从中发
现了 Transketolase、NADPH—cytochrome P450 reduc-
tase、Cytochrome P450、S-adenosylmethionine synthe-
tase、acetyltransferas、1-deoxy-D-xylulose-5-phophate
synthase (DXP)等一些可能参与 Prostratin 生物合成
的候选结构基因。另外，我们也发现了可能参与
Prostratin生物合成的候选调节基因 AP2类 ERF转
录因子(AP2-like ERF, AP2-like ethylene-responsive
transcription factor)。
2讨论
二萜类化合物 Prostratin生物合成及其基因克隆
的工作还未见有正式的刊物报道，仅网上有加州大学
的 Keasling教授正在开展 Mamala树 Prostratin生物
合成基因研究工作的信息。很显然，我们发现的
Transketolase、NADPH—cytochrome P450 reductase、
Cytochrome P450、S-adenosylmethionine synthetase 、
图 3狼毒大戟 Unigene COG分类结果
注: A:细胞骨架; B:预测的通用功能; C: 翻译后修饰,蛋白质
周转代谢,分子伴侣; D:翻译,核糖体结构和生物合成; E:能量
产生和转换; F:碳水化合物运输和代谢; G:氨基酸运输和代
谢; H:无机离子运输和代谢; I:脂类运输和代谢; J:复制,重组
和修复; K:信号转导; L:细胞壁 /膜 /外壳生物合成; M:未知
功能; N:辅酶运输和代谢; O:转录; P:核苷酸运输和代谢; Q:
胞内运输,分泌和囊泡运输; R: RNA的加工和修饰; S:细胞周
期控制，细胞分裂和染色体的分开; T:次生代谢物的生物合
成,运输和代谢; U:染色质结构和动力学; V:防御机制
Figure 3 Classification of Unigene COG of Euphorbia fischeria
Note: A: Cytoskeleton; B: General funtion prediction only; C:
Posttranslational modifiction, protien turnover, chaperones; D:
Translation, ribosomal structure and biogenesis; E: Energy pro-
duction and conversion; F: Carbohydrate transport and metabi-
olism; G: Amino acid transport and metabiolism; H: Inorganic
ion transport and metabiolism; I: Lipid transport and metabi-
olism; J: Replication, recombination and repair; K: Signal trans-
duction metabiolism; L: Cell wall/membrane/envelope biogene-
sis; M: Funtion unknown; N: Coenzyme transport and metabi-
olism; O: Transcription; P: Nucleotide transport and metabiolism;
Q: Intracelluar trafficking, secretion, and vesicular transport; R:
RNA processing and modifiction; S: Cell cycle control celldivi-
sion, chromsome partitioning; T: Secondary metabiolites biosyn-
thesis, transport and catabolism; U: Chromatin structure and dy-
namics; V: Defense mechanisms
狼毒大戟 cDNA文库构建及 EST测序
cDNA Library Construction and EST Sequencing of Euphorbia fischeriana 141
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工作，成功地构建了狼毒大戟的 cDNA文库并获得
了 2 099个 EST的序列。接着我们对这些 ESTs数据
进行了拼接，并对拼接后的 Unigene进行了 ORF预
测和相应的功能注释及分类。我们从中发现了
Transketolase、NADPH—cytochrome P450 reductase、
Cytochrome P450、S-adenosylmethionine synthetase、
acetyltransferas、1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate syn-
thase (DXP)等一些可能参与 Prostratin生物合成的候
选结构基因。另外，我们也发现了可能参与 Prostratin
生物合成的候选调节基因 AP2 类 ERF 转录因子
(AP2-like ERF, AP2-like ethylene-responsive tran-
scription factor)。今后我们将通过传统的生物化学的
方法对这些基因的功能进行一一地验证，一旦利用
合适的底物使它们的功能得到的验证，我们就可以
开展 Prostratin代谢工程的工作，从而为解决其药源
问题作出我们的贡献。
4材料与方法
4.1 实验材料及试剂
本研究所用材料狼毒大戟(Euphorbia fischeriana )
的植株采自黑龙江大兴安岭。于 2009年 3月选取多
年生植株的新鲜老根，用水洗干净后切成小块马上
冻入液氮中，之后把材料放在-80℃超低温冰箱中保
存备用。
Creator Smart cDNA Library Construction Kit 和
Advantage 2 PCR Kit购自 Clonetech公司，QIAquick
Gel Purification Kit 购自 QIAgene 公司，而 DH10B
感受态细胞购自 Invitrogen公司。
4.2 总 RNA的提取
参照棉花高质量总 RNA提取的 CTAB方法提
取狼毒大戟样品 LD 的总 RNA (窦道龙等, 2003)。
RNA 抽提液：2% CTAB (w/v)，2% PVP K25 (w/v)，
100mmol/LTris-HC1 (pH8.0)，25mmo/Lsodium-EDTA
(pH 8.0)，2.0 mol/L NaC1，混匀灭菌，用前加入终体
积为 2%的 β-巯基乙醇；氯仿:异丙醇(24:1)；10 mol/L
LiC1；95%乙醇；3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)。总 RNA提
取的过程：将 700 μL Buffer 加入 2% 终体积的巯
基乙醇后，65℃温育。接着，把 100 mg组织放入含液
氮的研钵中研磨，将研磨的粉末置于 65℃抽提液中，
剧烈震荡。再加入等体积氯仿:异丙醇抽提 1~2次，
10 000 r/min、4℃离心 10 min。在上清中加入 1/4体积
的 10 mol/L LiCL，混匀，4℃过夜沉淀。10 000 r/min、
4℃离心 10 min，将沉淀溶于 50ul RNase-free 水；加
入 1/10体积的 3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)，2.5倍体积
的乙醇，-70℃，沉淀 10~30 min；10 000 r/min 离心
10 min)，并 70%乙醇洗沉淀，最后把沉淀溶于 15 μL
水中，-70℃保存。
4.3 cDNA一链和二链的合成
我们采用 Creator Smart cDNA Library Construc-
tion Kit(Cat.No.634903)进行建库，SMART 是 switch
mechanism at 5 end of mRNA template 的缩写，具体
原理请参阅相关使用说明书。狼毒大戟 cDNA一链
的合成步骤如下：在预冷的 0.5 mL无菌离心管中
依次加入如下试剂：2 μL LD总 RNA样品(约 1 μg)、
1 μL SMARTⅣ Oligonucleotide、1 μL CDSⅢ/3 PCR
primer、1 μL RNase-free water。上述混合物混匀后，
在小型离心机中稍作离心使混合物集中到管底，72℃
温育 2 min，冰上冷却 2 min，稍进行离心使管中内容
物集中到管底。接着向每一个管中依次加入 2.0μL 5×
First-Strand Buffer、1.0 μL DTT (20 mmol/L)、1.0 μL
dNTP Mix (10 mmol/L)、1.0 μL PowerScriptTM Reverse
Transcriptase，使总体积为 10 μL。轻轻吹吸使之混合
均匀，并稍进行离心。在 42℃气浴中温育 1 h。如果在
水浴或 PCR仪中完成这个一步，最好在盖盖前加入
少许的矿物油以避免由于水分的蒸发而造成体积减
少。将离心管放置于冰上以终止第一链的合成反应。
如果立刻进行 PCR扩增反应，则可取 2 μL反转录
产物到已预冷的新的 0.5 mL离心管中，并将离心管
置于冰上，进行下一步的操作。
采用 LD PCR(long distance PCR)扩增 cDNA第
一链以获得双链 cDNA。具体步骤如下：启动 PCR扩
增仪，先预热到 95℃。在 0.5 mL PCR反应管中依次加
入下列试剂：2 μL First-strand cDNA、80 μLDeionized
H2O、10 μL 10 ×Advantage 2 PCR Buffer、2 μL 50 ×
dNTP Mixture、4 μL mL PCR Primer、2 μLl 50×Ad-
vantage 2 Polymerase Mix，总体积为 100 μL。轻弹几
下离心管，并稍作离心，使内容物集中到管底部。将
离心管放入预热到 95℃的 PCR仪中。根据 PCR仪
的类型及初始反应中 RNA 的量设定循环参数：先
95℃ 1 min，然后 95℃ 15 s，68℃ 6 min共 19 cycles。
反应结束后，取 5 μL产物于 10%含 EB的胶上电泳
检测 cDNA合成结果。设置 DL2000 PLUS MARK-
ER。进行下一步操作或将产物保存于-20℃。
4.4目的片段回收
使用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN
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Cat.No.28104)将双链 cDNA的纯化,操作参照说明书
进行，终体积用 80 μL ddH2O溶解。加入下列组分进
行酶切：79 μL cDNA (Purified cDNA)、10 μL 10×SfiⅠ
Buffer、10 μL SfiⅠ Enzyme、1 μL 100×BSA，总体积
为 100 μL，50℃温浴 2 h。将酶切产物用 1%琼脂糖凝
胶电泳，60V，2 h，同时加 DL2000 plus marker。将
Marker用 EB染色，在紫外下标出 1~5 kb区域。将酶
切产物的 1~3 kb区域切下，用 QIAquick Gel Extrac-
tion Kit (QIAGEN Cat.No.28704)进行回收，操作过程
见有关说明书，最后测定浓度。
4.5连接转化
将下列组分加入 0.2 mL PCR管中：50 ng cDNA、
1.0 μL Vector(100 ng/μL)、1.0 μL 10×Ligation Buffer、
1.0 μL ATP (10 mmol/L)、1.0 μL T4 DNA Ligation，添
加 Deionized H2O使总体积达到 10 μL。16℃，连接过
夜。70℃，变性 10 min。冰上放置 5 min。短暂离心。
将连接产物加到 0.25 μm Millipore纯化膜上脱盐纯
化 1 h。取 2 μL电击转化到大肠杆菌 DH10B中，电
压 2.1 kV，放入 37℃摇床，120 rpm复苏 1 h。加入
50%体积的 80%甘油。取 2 μL菌液涂于氯霉素平板
上，37℃培养过夜。
4.6菌落 PCR鉴定
挑取 30 个克隆进行菌落 PCR 鉴定：取适量
PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入 17.3 μL的灭菌
水。用灭过菌的 10 μL小枪头挑取单克隆白斑至灭菌
水中，振荡混匀。依次加入：2.5 μL 10xbuffer、1.8 μL
MgCl2 (25 mmol/L)、1 μL DNTP (2.5 mmol/L)、1 μL
M13+引物(10 pmol)、1 μLM13-引物(10 pmol)、0.4 μL
Taq酶，总体积 25 μL。各试剂均加好后，在离心机上
甩一下，使之沉到管底，置于 PCR仪上。94℃，2 min。
94℃ 4 min。35个循环(94℃ 40 s、53.6℃ 40 s、72℃
4 min、72℃ 10 min)，4℃保存。待 PCR反应进入 4℃
后，取下 PCR薄壁管，取 7 μL PCR产物加入 3 μL
溴芬兰跑电泳，0.5 h后照相，观察胶图，根据胶图粗
略鉴定插入片段的大小及小片段率。
4.7 EST测序
挑取单菌落，提质粒，用 3730 Bigdye技术测序，
具体的方法按照 3730的说明书来进行。
4.8 EST信息分析
对所有测序数据进行了去低质量，去载体，给出
基本的数据情况统计表格；对数据进行拼接，并且对
拼接后的 Unigene，进行 ORF预测、相应的功能注释
及分类，并且给出注释分析统计表格。
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