全 文 ：华西药学杂志
W C J P S　2007, 22(4):380 ～ 382 　　
为 5：30时 ,粒径最小 ,包封率最高;当比例为20：30
时 ,载药量最高 ,但粒径较大 ,包封率较低 。因此 ,选
择有机相与水相比例为 5：30进行纳米粒制备 。卵
磷脂作为助乳化剂可以提高微粒体系的稳定性 ,对
不同用量的卵磷脂进行考察 ,结果见表 1 ,结果表明
加入卵磷脂可以减小粒径以及提高包封率 ,当卵磷
脂与硬脂酸的比例为 50：200时的粒径最小 ,载药量
最高 ,因此选择该比例进行制备 。
表 1　不同制备工艺下 Pue - SLN的有关性质
Table 1　P roperties of Pue - SLN under d ifferent form ula tions
Item s S ize /nm PDI
D rug
load ing /%
Entrapm ent
efficiency /%
Lip id A 276 0. 138 2. 36 84.97
B 250 0. 100 1. 73 62.25
C 204 0. 142 1. 88 67.53
Po l- 188 /% 0. 2 285 0. 018 2. 82 76.13
0. 5 276 0. 138 2. 36 84.97
1. 0 489 0. 221 1. 63 83.05
D rug - lip id 10：200 276 0. 138 2. 36 84.97
(W W/ ) 20：200 493 0. 222 3. 67 67.81
30：200 216 0. 097 5. 31 67.28
O il- w ater 5：30 249 0. 079 5. 00 88.42
(V /V) 10：30 216 0. 097 5. 31 67.28
20：30 713 0. 649 7. 79 79.15
Lecith in-lip id 0：200 493 0. 222 3. 67 67.81
(W W/ ) 50：200 201 0. 152 4. 07 85.50
100：200252 0. 204 3. 72 87.35
　　取优化处方制得的 Pue - SLN ,稀释 20倍后用
激光粒度分析仪测定粒径及 Zeta电位 (图 1)。结
果表明 , Pue - SLN的平均粒径为 166.6 nm , PI值为
0.326, Ze ta电位为 - 35.43±-5.19mV。按照优化
后的制备工艺对所制得 Pue - SLN于透射电镜下观
察 ,纳米粒呈球形或近球形 (图 2), 粒径约为 160
nm ,分布较均匀。
2　讨论
固体脂质纳米粒的制备方法有多种[ 1] ,曾选择
薄膜 -超声分散法 、微乳稀释法 、溶剂扩散法对制备
方法进行了考察。其中薄膜 -超声分散法的成膜较
困难 ,并且耗时较长;微乳稀释法制备初乳较困难 ,
因此 ,采用溶剂扩散法制备固体脂质纳米粒。曾用
高速离心 、调节胶体溶液 pH后高速离心 、反透析 、
葡聚糖凝胶过滤[ 4, 5]等方法对固体脂质纳米粒的包
封率进行测定 。但因存在高速离心无法将纳米粒与
游离药物分开 ,反透析费时 ,药物难以释放 ,过滤的
步骤较多 ,对结果的影响较大等问题 ,最终选择超滤
法对包封率进行测定。
参考文献:
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收稿日期:2006 - 10
作者简介:罗静(1981 -),女 ,四川大邑 ,正攻读生药学专业的硕士学位。 E -m ai l:luo jing131421@163. com
*通讯作者(Corresponden t au thor), E -m ail:cdtcm yan@126. com
大狼毒内生真菌的分离 、鉴定与抑菌活性研究
罗　静 ,严铸云* ,郭晓恒 ,汪杨丽
(成都中医药大学药学院 , 四川 成都 610075)
摘要:目的　分离和鉴定大狼毒根中的内生真菌 ,并检测其抑菌活性。方法　用组织块法分离 , 点植法对分离菌株进行分类
鉴定;选择 3种人类病原细菌作为指示菌进行体外抑菌试验。结果　分离获得内生真菌 41株 ,鉴定为 1纲 、4目 、6科 、15属;
其中 9株有稳定的抑菌活性 , 尤其对大肠杆菌有显著抑制作用。结论　大狼毒根中存在丰富的内生真菌 ,其代谢产物具有一
定的抑菌作用 , 可作为筛选抑菌活性物质的新资源。
关键词:大狼毒;内生真菌;分离鉴定;抑菌活性
中图分类号:R282.71　 文献标识码:A　 　文章编号:1006 - 0103(2007)04 -0380 - 03
Isolation, identification and the antibacterial activity of endophytic fungi inEuphorbia nema-
tocypha Hand. -M azz.
LUO Jing, YAN Zhu - yun* , GUO X iao - heng,WANG Yang - li
DOI牶牨牥牣牨牫牫牱牭牤j牣cnki牣wcjps牣牪牥牥牱牣牥牬牣牥牨牥
(S chool of Ch ineseMateriaMed ica, Chengdu Un iversity of Trad itiona l ChineseM edicine, Chengdu 610075, China)
Abstrac t:OBJECTIVE　To iso la te and iden tify the endophy tic fung i in roo ts o fEuphorbia nematocypha H and. -M azz. and detec t
the antibacteria l activ ity o f these stra ins.METHODS　Endophy tes we re iso lated by issue - cu ltu re m ethod and iden tified by spo t -
p lantingm ethod;three pathogenic bac te ria re lated to hum an diseases we re used as indicators to do them icrobia l inhibition experiment.
RESULTS　41 strains o f endophy tic fung iw ere iso lated and theyw erem orpho log ically identified be longing to 15 genera, 6 fam ilies, 4
o rders and 1 c lass;9 strains o f 41 showed the steady an tibac te rial ac tivity, and exp ressed ev iden t inh ibition activ ity aga instE scherich ia
coli. CONCLUSION　TheE uphorbia nem atocypha H and. -M azz. containing abundant endophy tic fungi, whose seconda ry m etabo-
lites have antibacteria l activ itie s, could be a new resource to sc reen ac tive substance w ith an tibac te rial ac tivity.
K ey words:Euphorbia nema tocypha H and. -M azz.;Endophy tic fungi;Iso lation and identifica tion;An tibac te rial ac tivity
CLC num ber:R282.71　 D ocum ent code:A　 A rtic le ID:1006 - 0103(2007)04 - 0380 -03
　　大狼毒为大戟科大戟属植物大狼毒 Euphorbia
nematocypha Hand. -M azz.的干燥根 ,具有泻下逐
水的功效 ,用于治疗水肿 、肝硬化腹水 、皮肤搔痒及
疥癣等症[ 1] 。大戟属植物具有抗肿瘤 、抗结核杆菌
等作用 [ 2] 。依据植物的内生菌与宿主之间的内共
生理论 ,作者分离并鉴定了大狼毒内生真菌 ,探讨其
内生真菌的种类和组成 ,并筛选了其具有抑菌活性
的菌株 。
1　实验部分
1.1　材料
大狼毒采自河南省淅川县 ,经成都中医药大学
严铸云副教授鉴定为大狼毒 E . nema tocypha Hand.-
M azz.;马铃薯葡萄糖培养基 (PDA培养基 ) +青链
霉素混合液 (用于分离 );PDA培养基及促孢培养基
(KH2 PO 4 、KNO 3、MgSO4 7H2O、KC l、葡萄糖 、蔗糖 ,
用于鉴别);牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏 、蛋白胨 、
N aC l,用于指示菌的培养);金黄色葡萄球菌 S taphy-
lococcus aureus、大肠杆菌 E scherichia coli、绿脓杆菌
P seudomonas aeruginosa人类病原细菌 (成都中医药
大学微生物教研室)。
1.2　方法与结果
1.2.1　内生真菌的分离　用自来水将新鲜植物表
面洗净 ,稍干后切成适宜长度的小段 ,在 75%酒精
中浸泡 5 m in,用无菌水冲洗 3 ～ 4次 ,无菌滤纸吸
干 。然后用无菌刀片将表皮削去 ,分别取韧皮部 、木
质部切成 5 mm ×5 mm ×1 mm的小块贴于分离培
养基上 ,置 28℃恒温箱中培养 3 ～ 15 d。待培养基
上各植物组织块周围长出菌丝后 ,采用尖端菌丝挑
取法对所分离的内生真菌进行纯化 ,即得内生真菌 。
1.2.2　内生真菌的鉴定　采用插片培养和点植法 ,
对分离获得的银杏内生真菌进行显微形态特征的观
察 、分类鉴定 。分类检索参照文献[ 3] 。
1.2.3　抗菌菌株的培养　将已活化的内生真菌分
别接入 PDA液体培养基中 ,置 28℃、120 r m in-1发
酵 7 d,无菌条件下过滤除去菌丝体 ,取发酵液备用。
1.2.4　指示菌的培养　将已活化的 3种指示菌接
入 10 m l牛肉膏蛋白胨液体培养基中 ,置 37℃水浴
振荡器中 120 r m in-1培养 18 h ,备用 。
1.2.5　抑菌试验　抑菌初筛采用滤纸片法 ,复筛采
用钢圈法 [ 4] 。分别吸取 0.6 m l指示菌菌液于制好
的牛肉膏蛋白胨平板中 ,用无菌玻璃推棒涂布均匀 ,
待菌液稍吸收后 ,用无菌滤纸片沾取大狼毒内生真
菌菌株的代谢液 ,贴于涂布了菌液的平板中 (纸片
法);或置无菌牛津杯中 , 杯内加入代谢液 (钢圈
法),将此平板置 37℃恒温箱中培养 24 h,测量抑菌
圈直径(以相应无菌液体培养基作为空白对照 ,结
果均无抑菌效果 ,不影响真菌抑菌结果 )。
1.2.6　大狼毒内生真菌种群的组成　从大狼毒中
共分离到 41株内生真菌 ,经显微形态观察 ,鉴定为
1纲 、4目 、6科 、15属 (表 1)。由表 1可知 ,内生真
菌在大狼毒体内分布广泛 ,存在丰富的多样性 ,其中
26.8%暗指孢属 (D ictyosporium )、 14.6%青霉属
(Penicillium )、 14.6%小壳囊孢属 (Cytosporella)、
12.2%镰孢属 (Fusarium )为优势种群 ,部分属的显
微特征见图 1。
表 1　大狼毒内生真菌种群组成
Tab le 1　C om pos ition of endophytic fung i in Euphorb ia nemato-
cypha H and. -M azz.
Cla ss O rde r F am ily G enera N umber
Fung i imperfecti Monilia le s Tube rcu lar iaceae Fusarium 5
M oniliaceae Aspergillus 1
Penicillium 6
Paecilomyces 1
Geotrichum 1
Dema tiaceae C ladosporium 1
Dictyosporium 11
N igrospora 1
Haplographium 2
M elanconia les M e lanconiaceae Gloeosporium 1
Sphae ropsida les Sphae ropsidaceae Cy tosporella 6
Dendrophoma 2
Aposphaeria 1
Mycelia S ter ilia Phacod ium 1
Rhizoctonia 1
381第 4期 罗　静 ,等。大狼毒内生真菌的分离 、鉴定与抑菌活性研究 　　　
图 1　暗指孢(A)、青霉(B)、黑孢(C)和地霉(D)的显微特征 (×100)
F ig 1　M icrographs o fD ic tyosporium sp.(A), P enici llium sp.(B),
N ig ro spora sp.(C) and G eo trichum sp.(D)(×100)
1.2.7　抑菌试验的结果　从大狼毒中分离出的 41
株内生真菌 ,通过对 3种人类病原细菌进行滤纸片
法初筛试验 , 发现其中的 9株对金黄色葡萄球菌 、
大肠杆菌这两种病原菌都有较强的抑制作用;钢圈
法复筛试验再次验证了 9株内生菌的抑菌稳定性
(表 2)。抑菌圈为 2次重复试验的平均值。表 2显
示 , Lr7、Lr24、Lr25、Lr28对 3种病原菌都有较强的
抑制作用 (抑菌圈直径 >11mm);对金葡菌有高抗
性的菌株为 Lr13(抑菌圈直径 >15 mm);对大肠杆
菌有高抗性的菌株为 Lr1、 Lr7、 Lr24、 Lr28、 Lm4、
Lm14(抑菌圈直径 >15 mm);对绿脓杆菌有高抗性
表 2　大狼毒内生真菌的抑菌试验(mm)
Table 2　Antiba cteria l experim ent of endophy tic fungi in Euphorb ia
nematocypha Hand. -M azz.(mm)
S trains
Indicated bacteria
S taphy lococcu s
aureu s
E scherich ia coli
P seudomonas
a eruginosa
Lr1 15 17 7
Lr7 15 17 16
Lr13 16 14 7
Lr15 15 15 0
Lr24 13 19 12
Lr25 12 14 12
Lr28 11 17 13
Lm 4 13 16 6
Lm 14 7 19 8
的菌株为 Lr7。 9株活性菌对金葡菌大多数为中等
活性菌株 (抑菌圈直径 11 ～ 15 mm),占 77.8%,对
大肠杆菌大多数为高活性菌株 (抑菌圈直径 >15
mm),占 66.7%,对绿脓杆菌表现出中等抑菌活性
的占 33.3%。
1.2.8　抑菌活性菌株的分布　具有抑菌活性的 9
株分布于 3目 、3科 、6属 。由表 3可知 ,大多分布于
暗指孢属 、小壳囊孢属 、树孢霉属这些常见种类 ,其
他常见种类如青霉属 、拟青霉属也有分布。
表 3　大狼毒内生真菌抑菌活性菌株及分布
Tab le 3　Antibacteria l stra ins and d istribution of endophytic fung i
in Euphorbia nema tocypha Hand. -M azz.
Order Fam i ly Gen era
Num ber of actiba-
cteria l strains
Moni liaceae Pen icillium 1 Lm 4
Paecilom yces 1 Lr1
D emat iaceae D ictyosporium 3 Lr13 Lr15 Lr25
Sphaeropsidales Sphaeropsid aceae Cytosporella 2 Lr28 Lm14
D endrophoma 1 Lr24
Mycelia S terilia Rh izocton ia 1 Lr7
2　讨论
实验首次从大狼毒中分离出 41株内生真菌 ,分
布于 1纲 、4目 、6科 、15属 ,具有丰富的多样性;其
中 9株对金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌 、绿脓杆菌具有
稳定的抑菌活性 ,可作为筛选抑菌活性物质的新资
源。抑菌试验中 ,采用了滤纸片法进行体外抗菌初
筛 ,方法操作简便 ,易观察 ,适宜于大量的初筛工作。
在复筛时选用钢圈法进行重复试验较为准确客观 ,
但还应增加指示菌的范围及体内抑菌实验 ,进一步
验证其抗菌活性。
参考文献:
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收稿日期:2006 - 09
382 　 华 西 药 学 杂 志　　　 第 22卷