全 文 ：收稿日期:2015-12-02 接受日期:2016-01-26
基金项目:贵州省科学技术基金项目(黔科合 J字 LKZ［2012］19号)
* 通讯作者 E-mail:1012950284@ qq． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2016，28:771-774
文章编号:1001-6880(2016)5-0771-04
黔产毛蒟水提物对急性肝损伤小鼠的保护作用
杨 艳1* ，吴 芹2，龚其海2，石京山2
1遵义医学院附属医院药剂科，遵义 563003;2 遵义医学院药理学教研室，遵义 563002
摘 要:探讨黔产毛蒟水提物(PTE)对四氯化碳(CCl4)诱导小鼠急性肝损伤的保护作用及其作用机制。本研究
中将 50 只昆明种小鼠随机分为 5 组，各组 10 只，分别为空白组、模型组(0． 01 g /kg 的 0． 15% CCl4 菜油溶液造
模)、PTE组(低剂量组 0． 5 g /kg和高剂量组 1． 0 g /kg)和阳性对照组(联苯双酯 0． 15 g /kg)。检测各组小鼠谷
丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肿瘤坏死因子(TNF-α)含量;测定肝组织匀浆中脂质过氧化产物丙二醛
(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;计算肝脏的湿重指数;HE 染色法观察肝脏组织的病理学变化。与
空白对照组相比，模型组血清 ALT、血清 AST、肝脏指数、肝组织 MDA 含量以及血清 TNF-α 明显增高(均 P ＜
0. 01) ，肝组织 SOD活性明显降低(P ＜ 0． 01) ，肝组织病理损伤明显。与模型组相比，PTE高剂量组和阳性对照
组血清 ALT显著降低(P ＜ 0． 01) ，PTE低、高剂量组和阳性对照组血清 AST、肝脏指数、肝组织 MDA含量以及血
清 TNF-α含量均明显降低(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，肝组织 SOD活性明显升高(P ＜ 0． 01) ，并减轻了肝组织病理
损害。PTE可减轻 CCl4 诱导的急性肝损伤，其机制可能与抗氧化、抑制 TNF-α的产生有关。
关键词:毛蒟;抗氧化;自由基;肝损伤;四氯化碳
中图分类号:Ｒ961． 1 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2016． 5． 024
Protective Effect of Water Extracts of Piper puberulum(Benth．)
Maxim from Guizhou Province Against Acute Liver Injury in Mice
YANG Yan1* ，WU Qin2，GONG Qi-hai2，SHI Jing-shan2
1Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China;
2Pharmacy College of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563002，China
Abstract:The aim of this study was to investigate the protective effects of Piper puberulum(Benth．)Maxim water extract
(PTE)on carbon tetrachloride(CCl4)-induced acute liver injury and to explore the possible mechanism． Fifty KM mice
were randomly divided into five groups(n = 10 in each)including blank group，model group(induced by 0． 01 g /kg，
0. 15% CCl4 vegetable oil solution) ，PTE groups(0． 5 g /kg and 1． 0 g /kg)and positive control group(bifendate 0． 15
g /kg)． Alanine aminotransferase(ALT) ，aspartate aminotransferase(AST) ，malondialdehyde(MDA)content，superoxide
dismutase(SOD)activity，tumor necrosis factor(TNF-α) ，liver wet weight index and HE staining of liver tissue patholog-
ical changes were detected in each group． Compared with blank group，the serum ALT，serum AST，liver index，MDA
content and serum TNF-α increased significantly(P ＜ 0． 01) ，SOD decreased significantly(P ＜ 0． 01)and hepatic tissue
pathology injured significantly(P ＜ 0． 01)in model group． Compared with model group，the serum ALT decreased signifi-
cantly in PTE high dose group and positive control group． The serum AST，liver index，MDA content and serum TNF-α
decreased significantly(P ＜ 0． 01 or P ＜ 0． 05) ，SOD increased significantly(P ＜ 0． 01)and hepatic tissue pathology re-
lieved significantly in PTE low dose group，PTE high dose group and positive control group． In conclusion，P． puberulum
water extract attenuated the CCl4-induced acute liver injury and the underlined mechanisms were，at least partly，due to
their anti-oxidant actions and inhibitions of TNF-α production．
Key words:Piper puberulum(Benth．)Maxim;antioxidant;radical;liver injury;carbon tetrachloride
毛蒟为胡椒科胡椒属藤本植物，主要分布在广
东、云南、贵州，生于林下或潮湿谷地，常攀援于石上
或树上，全株药用，传统用于行气止痛、活血祛风、治
胃痛等［1］。同时，毛蒟也具有明显的抗炎、镇痛和
抗血小板聚集等药理作用。毛蒟在贵州民间广泛用
于肝病的治疗，并取得了较好的疗效，其具有来源广
泛，价格便宜，容易采集等特点，但目前关于毛蒟植
物保肝作用的研究笔者未见文献报道。本文拟观察
毛蒟水提物(PTE)对 CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠的肝
保护作用，并探索其作用机制，从而为毛蒟提取物用于
肝损伤治疗的开发研究提供基础药理学参考数据。
1 材料与方法
1． 1 仪器与试剂
仪器:721 型紫外-可见分光光度计(上海申化
仪表自控公司) ，-80 °C 低温冰柜(德国 Forma Sci-
entic公司) ，Milli QA 纯水处理器(Millipore 公司) ，
3K30 型高速冷冻离心机(德国 Sigma公司) ，电子分
析天平(北京赛多利斯电子天平有限公司) ，SHHW
电热恒温三用水浴锅(北京永光明医疗仪器厂) ，
Leica 光学显微镜(德国 Leica Microsystems Ltd) ，
WH-1 微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂) ，
Model 550 型酶标仪(美国 BIO-Tek公司) ，全自动生
化分析仪 au5400(日本 Olympus)。
试剂:菜油(购于普通超市) ，PTE(贵州省基础
药理重点实验室，专利号:201010276394． 5) ，联苯双
酯滴丸(浙江医药股份有限公司，批号 111013) ，
TNF-a(ELISA)试剂盒(Bender MedSystems，CA，
USA，批号 20121009) ，谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨
酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)
和考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所，
批号 20121124)。
1． 2 实验动物
昆明种小鼠，雌雄兼用，清洁级，体重 20 ～ 22 g，
由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，许可
证号:ScxK(渝)2007-0005。饲养环境安静，室温 22
～ 23 ℃，光照 /暗时间为 12 /12 h 循环，各组实验小
鼠自由进食、饮水。
1． 3 实验方法
1． 3． 1 PTE的制备
准确称取 10 g 毛蒟干燥粗粉末放置于圆底烧
瓶中，按一定比例加入蒸馏水(料液比 1∶ 30) ，浸泡
2 h，加热提取 3 h，加热结束后，趁热真空抽滤，收集
滤液。残渣用蒸馏水洗入圆底烧瓶中，再次加热回
流提取，提取 3 次后，同样趁热真空抽滤，合并滤液。
滤液于旋转蒸发仪减压回收溶剂，浓缩至膏状，放置
于冷冻干燥机干燥得毛蒟水提物。平均质量提取率
为 27． 31%。
1． 3． 2 动物分组及处理
小鼠分笼饲养，自由进食饮水。在实验环境下
给予适应性喂养 1 周后，按照体重随机分为 5 组，每
组 1 只。空白组(Control group，C) :每日 ig 生理盐
水(10 mL /kg)一次，ig(7 d;模型组(Model group，
M) :每日 ig生理盐水(10 mL /kg)一次，ig(7 d;联苯
双酯阳性组(Bif group，Bif)每日(0． 15 g /kg)ig 一
次，ig(7 d;PTE 低剂量组(Low dose water extract
group，LTEP)每日(0． 5 g /kg)ig 一次，ig(7 d;PTE
高剂量组(High dose water extract group，HTEP) :每
日(1． 0 g /kg)ig 一次，ig(7 d;在末次 ig 给药后 30
min，除正常组一次性 ip菜油溶液(10 mL /kg)外，其
余各组均一次性 ip 0． 15% CCl4 菜油溶液(10 mL /
kg) ，禁食不禁水。
1． 3． 3 标本的制备
小鼠于腹腔注射 CCl420 h 后，摘除眼球取血，
一部分送检 AST、ALT，一部分置于-80 ℃冰箱保存
备用。小鼠取血完毕，迅速取出肝脏，用预冷的生理
盐水漂洗 3 ～ 4 次去除积血，称重;取小鼠肝组织左
叶相同部位，用 10%中性福尔马林溶液固定，余下
的肝脏留存置于-80 ℃冰箱保存用于后述制备肝匀
浆测定相关指标。
1． 3． 4 指标检测
小鼠肝脏湿重指数的测定［2］:小鼠处死前称
重，处死后取出肝脏，称重，肝脏指数 =肝脏重(g)/
小鼠体重(g)× 100%;血清 ALT、AST 的测定:取
“1． 3． 3”项下制备的血清送至遵义医学院附属医院
检验科用全自动生化分析仪进行 ALT、AST的检测;
肝脏组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶
(SOD)活性、TNF-α含量的测定:根据试剂盒说明书
测定肝组织的 SOD、MDA 活性及血清的 TNF-α 含
量;肝脏组织的病理标本制备:将固定于 10%中性
福尔马林溶液中的肝脏取出，流水冲洗 24 h，酒精逐
级脱水和二甲苯透明。常规石蜡包埋、切片，苏木
素-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色。
1． 4 数据统计分析
实验数据用 SPSS13． 0 统计软件分析，所有数据
以 Mean ± SE 表示，多组间比较采用 One-way ANO-
VA处理，方差齐使用 LSD法，方差不齐 Games-How-
ell法，P ＜ 0． 05 有统计学意义。
2 实验结果
2． 1 PTE 对 CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠血清
ALT、AST及肝脏指数的影响
与空白对照组比较，模型组小鼠血清 ALT、AST
及肝脏指数明显增高(均 P ＜ 0． 01) ，证明小鼠急性
肝损伤模型复制成功;与模型组比较，PTE高剂量组
277 天然产物研究与开发 Vol. 28
和阳性对照组血清 ALT 显著降低(P ＜ 0． 01) ;PTE
低、高剂量组和阳性对照组血清 AST 和肝脏指数均
明显降低(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，结果见表 1。
表 1 PTE对 CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠血清中 ALT和 AST及肝脏指数的影响(Mean ± SE)
Table 1 The effects of PTE on serum ALT，AST and liver index in acute hepatic injury mice induced by CCl4(Mean ± SE)
组别
Group
剂量
Dose(g /kg)
谷丙转氨酶
ALT(U /L)
谷草转氨酶
AST(U /L)
肝脏指数
liver index(g /g)
空白对照组 Control － 35． 29 ± 4． 72 215． 86 ± 24． 98 3． 53 ± 0． 18
模型组 Model － 1459． 29 ± 358． 48 # 1537． 5 ± 337． 11# 5． 14 ± 0． 28 #
PTE低剂量组 PTE － L 0． 5 1143． 29 ± 311． 42 834． 29 ± 99． 82 * 4． 90 ± 0． 17
PTE高剂量组 PTE － H 1 515． 86 ± 155． 20 ＊＊ 657． 71 ± 146． 75 ＊＊ 3． 99 ± 0． 14 ＊＊
阳性对照组 Positive control 0． 15 343． 29 ± 129． 04＊＊ 794． 57 ± 73． 39 * 3． 73 ± 0． 13 ＊＊
注:与空白对照组比较，#P ＜ 0． 01;与模型组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01。
Note:Compared with control group，#P ＜ 0． 01;Compared with model group，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01．
2． 2 PTE 对 CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠肝脏病理
变化的影响
显微镜下可见，正常组小鼠肝细胞排列整齐，无
水肿、坏死、无炎症细胞浸润等病理改变;模型组部
分肝小叶结构欠清、肝细胞弥漫性气球样变，可见散
在小灶性坏死伴炎细胞浸润。PTE低剂量组可见肝
组织中度浑浊肿胀;PTE 高剂量组可见肝细胞排列
基本有序，肝细胞略肿胀;阳性对照组肝小叶轮廓清
晰，肝细胞轻微肿胀，未见明显炎症细胞浸润。结果
见图 1。
A B C D E
图 1 正常组(A)、CCl4 模型组(B)、PTE 1 g /kg组(C)、PTE 0． 5 g /kg组(D)及 Bif 0． 015 g /kg组(E)中急性肝损伤小鼠肝
组织的病理改变(HE染色，200 ×)
Fig. 1 Histologic examination of liver sections in acute liver injury mice of normal group(A) ，CCl4model control group(B) ，PTE 1
g /kg group(C) ，PTE 0． 5g /kg group(D)and Bif 0． 015 g /kg group(E) (HE staining，200 ×)
注:红箭头代表气球样变;黄箭头代表坏死灶伴炎细胞浸润
Note:The red arrow represented ballooning degeneration;yellow arrow represented focal necrosis with inflammatory cells infiltration
2． 3 PTE 对 CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠肝组织中
MDA含量、SOD活性的影响
与空白对照组比较，模型组 MDA 含量明显升
高(P ＜ 0． 01) ，SOD活性明显降低(P ＜ 0． 01) ;与模
型组比较，PTE低、高剂量组和阳性对照组均能显著
降低肝组织 MDA含量(P ＜ 0． 01) ;以及均能显著升
高 SOD活性(P ＜ 0． 01)。结果见表 2。
表 2 PTE对 CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠肝组织中 MDA含量、SOD活性和血清 TNF-α的影响(Mean ± SE)
Table 2 Effects of PTE on liver tissue MDA content，SOD activity and serum TNF-α in mice subjected to CCl4-induced acute liver in-
jury(Mean ± SE)
组别
Group
剂量
Dose(g /kg)
丙二醛
MDA(nmol /mL)
超氧化物岐化酶
SOD(U /mL)
肿瘤坏死因子-α
TNF-α(ng /mL)
空白对照组 Control － 3． 72 ± 0． 92 10． 00 ± 1． 19 191． 90 ± 94． 33
模型组 Model － 17． 69 ± 3． 32 # 2． 4 ± 0． 74 # 1012． 82 ± 190． 62 #
PTE低剂量组 PTE － L 0． 5 9． 02 ± 1． 84 ＊＊ 6． 06 ± 0． 98 ＊＊ 640． 74 ± 89． 60 ＊＊
PTE高剂量组 PTE － H 1 8． 62 ± 1． 54 ＊＊ 6． 19 ± 0． 89 ＊＊ 595． 14 ± 107． 3 ＊＊
阳性对照组 Positive control 0． 15 8． 58 ± 0． 94 ＊＊ 6． 03 ± 0． 87 ＊＊ 267． 10 ± 97． 08 ＊＊
注:与空白对照组比较，#P ＜ 0． 01;与模型组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01。
Note:Compared with control group，#P ＜ 0． 01;Compared with model group，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01．
377Vol. 28 杨 艳等:黔产毛蒟水提物对急性肝损伤小鼠的保护作用
2． 4 PTE 对 CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠血清中
TNF-α的影响
与空白对照组比较，模型组小鼠血清中 TNF-α
含量显著升高(P ＜ 0． 01) ;与模型组比较，PTE 低、
高剂量组和阳性对照组小鼠血清中 TNF-α 含量均
明显降低(P ＜ 0． 01)。结果见表 2。
3 讨论与结论
目前，动物肝脏疾病模型较多，主要有化学药物
中毒性肝炎动物模型(主要包括 CCl4 急、慢性肝损
伤模型、D-氨基半乳糖胺急性肝损伤模型、硫代乙酰
胺肝损伤模型、扑热息痛肝损伤模型、异硫氰酸苯酯
和硝硫氰胺肝损伤模型、免疫性肝损伤模型和其他
肝损伤模型［3-5］。本实验采用的是 CCl4 诱导急性肝
损伤模型。该模型的优点在于成功率高，试验方法
简便，价格低廉。因此利用 CCl4 构建的急性肝损伤
动物模型是目前研究和开发保肝护肝类药物的首选
实验动物模型之一［6］。CCl4 为经肝微粒体细胞色
素 P450代谢生成的自由基攻击肝细胞膜上磷脂分子
引起脂质过氧化或与肝微粒体脂质和蛋白质发生共
价结合，破坏肝细胞膜结构和功能完整性的破坏，最
终导致肝细胞死亡［7，8］。肝脏病理可见炎性细胞浸
润、混浊肿胀、气球样变和肝细胞坏死。本实验通过
一次性腹腔注射 CCl4 诱导小鼠急性肝损伤，模型组
小鼠血清中 ALT、AST、TNF-α 较空白组明显升高，
其肝脏组织中的 SOD酶活性显著低于空白对照组，
MDA水平明显高于空白对照组;肝重指数显著性高
于空白组;同时，CCl4 诱导的小鼠肝脏组织发生了
明显的病理性改变。以上结果表明，我们成功建立
了急性肝损伤小鼠模型。在此基础上我们观察了
PTE对 CCl4 诱导的急性肝损伤小鼠模型的影响。
实验结果显示 PTE 对四氯化碳引起的小鼠急性肝
损伤有一定的保护作用。
近年研究表明，炎性细胞因子增加也是肝损伤
发生的因素之一。TNF-α被认为可能处于多种病原
致肝损伤时细胞因子网络核心而备受重视［9］。
TNF-α来源广泛，主要由上活化单核吞噬细胞产生。
本实验结果表明，模型组小鼠血清中 TNF-α 含量明
显升高，提示 TNF-α参与了 CCl4 诱导的小鼠急性肝
损伤，而 PTE各剂量组均能显著降低小鼠血清中的
TNF-α含量，提示抑制 TNF-α 的产生也可能是 PTE
对肝脏保护作用的药理作用机制之一。总之，本实
验研究表明 PTE对 CCl4 诱导的急性肝损伤具有保
护作用，其机制与抗氧化，抑制 TNF-α产生有关。
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