全 文 ：收稿日期:2014-11-13
基金项目:广西科技重大专项(桂科重 1355001-4);广西自然科学基金(2014GXNSFBA118175) ;广西中药质量标准研究重点实验室系统性
研究课题(桂中重系 201302)
作者简介:邱宏聪(1982-)，男，硕士，助理研究员，主要从事中药新药研发;E-mail:qiuhongcong@ 163. com。
* 通讯作者:刘布鸣，Tel:0771-5883405，E-mail:liu_buming@ 163. com。
岗松总黄酮体内外抗炎作用研究
邱宏聪1，2，张 伟3，赵冰冰4，陈明生1，2，王 丽1，刘布鸣1，2*
(1. 广西中医药研究院，广西 南宁 530022;2. 广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022;3.
澳门科技大学，澳门;4. 广西壮族自治区肿瘤医院，广西 南宁 530000)
摘要 目的:从体内外考察岗松总黄酮的抗炎作用。方法:采用脂多糖(LPS)刺激小鼠 ＲAW264. 7 巨噬细胞模
型，酶联免疫法(ELISA)检测岗松总黄酮对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)的影响，蛋白印迹法(West-
ern blot)检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧酶-2(COX-2)蛋白相对表达，考察其体外抗炎活性;采用小
鼠耳廓肿胀、小鼠腹腔毛细血管通透性及大鼠棉球肉芽肿试验，考察其体内抗炎活性。结果:岗松总黄酮预处理能
显著降低 ＲAW264. 7 细胞中 TNF-α及 IL-6 含量及 iNOS、COX-2 蛋白表达，并显著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿
胀、腹腔毛细血管通透性及大鼠棉球肉芽肿增生。结论:体内外试验均表明岗松总黄酮具有较好的抗炎活性，其机
制可能与抑制炎性因子 TNF-α、IL-6 的释放及调控 COX-2 的表达有关。
关键词 岗松总黄酮;抗炎作用;巨噬细胞;体外;体内
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)08-1710-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 08. 037
岗松为桃金娘科植物岗松 Baeckea frutescens L.
带花果的干燥茎叶，在《广西壮药材质量标准汇编》
有收载，有清利湿热、止痒杀虫的功效，主治腹痛、泄
泻、急性胃肠炎等症。广泛分布于我国华南地区及
东南亚各国。经课题组长期研究，发现岗松富含槲
皮素、杨梅素等黄酮类成分〔1-5〕，其中 6，8-二甲基山
奈酚-3-O-α-鼠李糖苷〔2〕为新化合物，并发现岗松提
物具有抗炎等较好的药理活性〔6，7〕，同时完成了岗
松总黄酮的纯化〔8，9〕。在前期研究基础上，本实验
观察岗松总黄酮对离体巨噬细胞及炎症模型动物的
影响，从体内外考察岗松总黄酮的抗炎活性。
1 材料
1. 1 实验动物 清洁级雄性昆明种小白鼠，体质
量 18 ～ 22 g;清洁级雄性 Wistar 大鼠，体质量 200 ～
250 g，均购自广西医科大学，生产许可证号:SCXK
(桂)2003-0003。
1. 2 细胞株 小鼠 ＲAW 264. 7 单核巨噬细胞，购
自中国科学院细胞库，使用含胎牛血清(含量为
10%)、青、链霉素(含量为 100 U /mL)的 DMEM 培
养基，置于 5% CO2，37 ℃培养箱中进行常规培养。
1. 3 药物与试剂 岗松药材采收于广西北海，经
广西中医药研究院姜平川研究员鉴定为桃食娘科植
物岗松 Baeckea frutescens L. 的干燥茎叶;阿司匹林
(批号:100113-201104)、地塞米松(批号:100129-
201105)购自中国食品药品检定研究院;TNF-α(批
号:201402)、IL-6(批号:201312)ELISA 试剂盒，ＲB
公司;二甲亚砜(DMSO)、LPS、Western blot 试剂，
Sigma 公司;iNOS、COX-2、Actin 抗体和二抗，Cell
Signal公司;超纯水。其他试剂均为分析纯。
2 方法
2. 1 岗松总黄酮的制备 将岗松茎叶用 70%乙醇
(固液比 1∶ 16)进行 3 次提取，每次提取时间为 60
min，过滤，合并滤液并浓缩，岗松提取药液的生药浓
度为 0. 3 g /mL。采用 AB-8 型大孔吸附树脂进行总
黄酮富集，1 BV /h 流速，3 BV，用 50%乙醇洗脱，流
速 2 BV /h，5 BV，浓缩、干燥得到岗松总黄酮。岗松
总黄酮 50、100、200 mg /mL(DMSO溶解)，用于细胞
试验。
2. 2 Elisa 法测定细胞中 TNF-α、IL-6 含量 取对
数生长期的 ＲAW264. 7 细胞，0. 25 g /L 胰蛋白酶
EDTA消化，调节适合的细胞密度接种于细胞培养
瓶中，分为 5 组，分别为正常对照组(以无血清
DMEM孵育)、模型组(加入 LPS 100 μg /L 孵育 24
h)及岗松总黄酮 50、100、200 mg /mL(DMSO溶解)3
个剂量组，处理细胞 2 h后，再加入 LPS(100 μg /L)
孵育 24 h，取细胞上清液，进行 TNF-α、IL-6 的含量
测定。
2. 3 Western blot 法检测细胞中 iNOS、COX-2 蛋白
相对表达 分组处理后的细胞用冰 PBS 洗涤，加入
蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂后收集细胞，超声破
碎后进行离心处理 15 min(12 000 r /min，4 ℃)，取
上清液待测定含量。每孔加 25 μg蛋白上清液进行
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上样，采用电泳分离，分离后的蛋白转移到聚偏氟乙
烯膜上，脱脂牛奶封闭，分别用一抗(iNOS、COX-2、
β-actin)过夜进行孵育，洗膜，用二抗进行孵育，再次
洗膜，显影，并进行蛋白含量测定。
2. 4 小鼠耳廓肿胀试验 取雄性昆明小鼠随机分
为 4 组，每组 10 只，分别为对照组及岗松总黄酮高、
低剂量(0. 42、0. 21 g /kg)组，阿司匹林(0. 25 g /kg)
组，灌胃给药 7 d，1 次 /d，对照组灌胃等体积蒸馏
水。末次给药后 1 h 在小鼠的右耳涂抹二甲苯 20
μL，1 h后处死，用 6 mm 打孔器在耳廓相同部位打
孔，称两耳片质量(mg)，求差值并计算肿胀抑制率
(%)。
2. 5 小鼠腹腔毛细血管通透性试验 取雄性昆明
小鼠随机分 4 组，每组 10 只，分别为对照组，地塞米
松(0. 0045 g /kg)组及岗松总黄酮高、低剂量(0. 42、
0. 21 g /kg)组，灌胃给药 7 d，1 次 /d，对照组灌胃等
体积蒸馏水。末次给药 1 h 后用浓度为 1%伊文思
蓝溶液进行尾静脉注射，0. 6%醋酸溶液进行腹腔注
射(10 mL /kg)，30 min后处死，剪开并清洗腹腔，吸
取 5 ～ 6 mL 腹腔洗出液，离心 15 min，在 590 nm 处
测定光密度 D(λ)值。
2. 6 大鼠棉球肉芽肿试验 取雄性 Wistar 大鼠 40
只，3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(30 mg /kg)，
消毒后纵切腹部开口长约 1 cm，从切口向左侧腹股
沟塞入灭菌棉球 1 个，棉球质量约为 50 mg(棉球需
进行高压灭菌，同时加入浓度为 10 mg /mL 氨苄青
霉素溶液)，随即缝合皮肤。术后随机分为 4 组，每
组 10 只，分别为对照组、阿司匹林(0. 25 g /kg)组及
岗松总黄酮高、低剂量(0. 42、0. 21 g /kg)组，从手术
当天开始灌胃给药 7 d，1 次 /d，对照组灌胃等体积
蒸馏水。于第 8 天处死，将棉球取出后剔除脂肪组
织，放置在 70 ℃烘箱，于 12 h 后称量质量，计算肉
芽肿质量、肉芽肿系数、棉球肉芽抑制率(%)。
2. 7 统计学处理 实验数据用 珋x ± s 表示，统计学
处理采用单因素方差检验法。
3 结果
3. 1 岗松总黄酮对 LPS 作用下 ＲAW264. 7 细胞中
TNF-α、IL-6 含量的影响 结果如表 1 所示，与正常
对照组比较，模型组细胞中 TNF-α及 IL-6 含量均显
著升高(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，岗松总黄酮各
剂量组细胞中 TNF-α 及 IL-6 含量均显著降低(P ＜
0. 01)。
3. 2 岗松总黄酮对 LPS 作用下 ＲAW264. 7 细胞
iNOS、COX-2 蛋白表达的影响 结果如图 1 所示，
与正常对照组比较，模型组 iNOS、COX-2 蛋白表达
显著升高(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，岗松总黄酮
各剂量组 iNOS蛋白表达显著降低(P ＜ 0. 01)，岗松
总黄酮 100、200 mg /mL 组 COX-2 蛋白表达显著降
低(P ＜ 0. 01)。
表 1 岗松总黄酮对 LPS作用下 ＲAW264. 7 细胞
中 TNF-α、IL-6 含量的影响(珔x ± s，n =10)
组别
浓度 /
(mg /mL)
TNF-α /
(pg /mL)
IL-6 /
(pg /mL)
正常对照组 － 87. 45 ± 13. 30＊＊ 37. 50 ± 9. 62＊＊
模型组 － 345. 12 ± 29. 78 102. 16 ± 9. 51
岗松总黄酮组 50 175. 54 ± 17. 47＊＊ 68. 21 ± 5. 29＊＊
100 151. 41 ± 12. 64＊＊ 75. 67 ± 10. 13＊＊
200 141. 61 ± 14. 97＊＊ 73. 88 ± 13. 21＊＊
注:与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
图 1 岗松总黄酮对 LPS作用下 ＲAW264. 7
细胞 iNOS、COX-2 蛋白表达的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 岗松总黄酮 50 mg /mL组
D. 岗松总黄酮 100 mg /mL 组 E. 岗松总黄酮 200 mg /mL
组
注:与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
3. 3 岗松总黄酮对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
结果如表 2 所示，与对照组比较，岗松总黄酮高、
低剂量及阿司匹林均能显著抑制二甲苯引起的小鼠
耳廓肿胀(P ＜ 0. 01)。
表 2 岗松总黄酮对二甲苯致小鼠耳廓
肿胀的影响(珔x ± s，n =10)
组别 剂量 /(g /kg) 两耳质量差 /mg 抑制率 /%
对照组 － 22. 6 ± 3. 5 －
岗松总黄酮组 0. 42 13. 2 ± 3. 7## 41. 6
0. 21 15. 4 ± 2. 9## 31. 9
阿司匹林组 0. 25 11. 9 ± 6. 4## 47. 3
注:与对照组比较，##P ＜ 0. 01
3. 4 岗松总黄酮对小鼠腹腔毛细血管通透性的影
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响 结果如表 3 所示，与对照组比较，岗松总黄酮
高、低剂量及地塞米松均能显著降低小鼠腹腔毛细
血管通透性(P ＜ 0. 05)。
3. 5 岗松总黄酮对大鼠棉球肉芽肿的影响 结果
如表 4 所示，岗松总黄酮高、低剂量及阿司匹林均能
显著抑制大鼠棉球肉芽肿增生(P ＜ 0. 05 或 P ＜
0. 01)。
4 讨论
表 3 岗松总黄酮对小鼠腹腔毛细血管
通透性的影响(珔x ± s，n =10)
组别 剂量 /(g /kg) D(λ)值
对照组 － 0. 442 ± 0. 135
岗松总黄酮组 0. 42 0. 315 ± 0. 061#
0. 21 0. 328 ± 0. 087#
地塞米松组 0. 0045 0. 353 ± 0. 072#
注:与对照组比较，#P ＜ 0. 05
表 4 岗松总黄酮对大鼠棉球肉芽肿的影响(珔x ± s，n =10)
组别 剂量 /(g /kg) 肉芽肿质量 /mg 肉芽肿系数 /(mg /100g) 棉球肉芽抑制率 /%
对照组 － 81. 2 ± 8. 7 34. 5 ± 3. 8 －
岗松总黄酮组 0. 42 60. 5 ± 4. 2# 26. 8 ± 2. 6# 25. 5
0. 21 61. 9 ± 7. 8# 28. 4 ± 3. 7# 23. 8
阿司匹林组 0. 25 54. 3 ± 5. 8## 23. 5 ± 2. 4## 33. 1
注:与对照组比较，#P ＜ 0. 05，##P ＜ 0. 01
炎症是机体对伤害性刺激、组织损伤以及感染
等的应激反应。iNOS 是炎症信号通路的重要靶向
因子，其主要受炎症因子及 LPS 刺激，产生大量
NO，并分布于白细胞、巨噬细胞等炎症相关细胞
中〔10〕。而 NO 的激活可上调 COX-2 的表达〔11〕，
COX-2 可在炎症部位诱导产生大量的前列腺素、白
介素 IL-6、IL-1β等，同时 IL-6、TNF-α是两种重要的
参与炎症反应的因子〔12，13〕。研究发现槲皮素、杨梅
素等黄酮类化合物均有较好的抗炎作用，Min YD
等〔14〕发现槲皮素在被刺激产生炎症的 HMC-1 人肥
大细胞系中，可抑制 TNF-α、IL-6 的分泌。Shi Y
等〔15〕发现槲皮素可剂量依赖性抑制 iNOS、COX-2
和促炎细胞因子 IL-6 和 TNF-α 的表达。Fu ＲH
等〔16〕在 LPS刺激小鼠骨癌模型中，发现杨梅素可抑
制 TNF-α、IL-6 的分泌。岗松总黄酮提取物可显著
抑制 LPS刺激后细胞上清中 TNF-α及 IL-6 含量;同
时抑制干预后 iNOS、COX-2 蛋白的表达。抑制 NO
的生成，从而调控炎性反应中的限速酶 COX-2，可能
是其发挥抗炎作用的机制之一。
小鼠耳肿胀模型广泛应用于抗炎活性的评价，
操作简单、模型稳定、价格便宜。二甲苯模型造成耳
部急性渗出性炎症水肿〔17〕，其主要机制是刺激组
胺、激肽和纤维蛋白等炎症介质的释放，从而引起耳
部血管扩张。非特异性炎症反应表现为毛细血管通
透性的增高〔18〕。大鼠棉球肉芽肿属慢性炎症模型，
棉球肉芽肿病变以棉球为中心，通过周围细胞包绕，
形成结节状病灶，引起慢性炎症。岗松总黄酮提取
物能显著抑制小鼠耳廓肿胀、腹腔毛细血管通透性
及大鼠棉球肉芽肿及 LPS 作用下 ＲAW264. 7 细胞
中 TNF-α、IL-6 含量和 iNOS、COX-2 蛋白表达，通过
结合急、慢性炎症模型，表明其具有较好的抗炎作
用。
综上所述，岗松总黄酮体内外实验均表现出较
好的抗炎作用，但其具体的抗炎机制还有待进一步
深入研究。
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