全 文 :吴丽君.高精油互叶白千层组培产业化技术研究 [J].福建农业学报,2014,29 (12):1246-1250.
WU L-J.Commercialization of Tissue Cultivation for Melaleuca altennifolia [J].Fujian Journal of Agricultural Sciences,2014,29
(12):1246-1250.
高精油互叶白千层组培产业化技术研究
吴丽君
(福建省林业科学研究院,福建 福州 350012)
收稿日期:2014-09-01初稿;2014-11-21修改稿
作者简介:吴丽君 (1968-),女,教授级高级工程师,博士,主要从事林木、花卉生物技术研究 (E-mail:wljforest@163.com)
基金项目:福建省科技计划项目———省属公益类科研院所基本科研专项 (2009R10008-3);福建省林业科研项目
摘 要:高精油互叶白千层优良无性系继代苗经多代增殖扩繁后,易出现基部褐化死亡现象,部分无性系生根
率低,严重阻碍了组培苗产业化生产应用。以花宝1号、B5、MS为基本培养基,开展大量元素不同浓度、维生
素组合、生长调节剂对比试验。结果表明:3.0g·L-1花宝1号与 VH、Vc、VB2的组合能有效地抑制继代苗
褐化死亡;继代培养基中添加 GA0.4~0.6mg·L-1,有效芽苗数多,且芽苗粗壮、长势整齐;不同优良无性
系在2.0g·L-1花宝1号生根培养基均获得了较高生根率,平均生根率为95%。花宝1号能有效提高互叶白千
层组培苗产业化效率。
关键词:互叶白千层;高精油;优良无性系;花宝1号;组培;产业化 ;关键技术
中图分类号:S 722.3+7 文献标识码:A
Commercialization of Tissue Cultivation for Melaleuca altennifolia
WU Li-jun
(Fujian Academy of Forestry Science,Fuzhou,Fujian 350012,China)
Abstract:Plantlets from the elite,high essential oil containing Melaleuca altennifoliatended to turn brown and die
after generations of multiplication.In addition,the low rooting rate prohibited the commercialization of the tissue
cultivation.Using Hyponex No.1,B5and MS as the basis,media formulated with varied concentrations of
substrates,vitamins and growth regulators were used in an attempt to improve the cultivation.The results showed
that(a)3.0g·L-1 of Hyponex No.1in combination with VH,Vc and VB2effectively inhibited the browning and
death of the plantlets;(b)a supplementation of 0.4-0.6mg·L-1 GA in the subculture medium increased the
number of effective seedlings,and encouraged a strong and uniform growth of the seedlings;and,(c)the addition
of Hyponex No.1at a rate of 2.0g·L-1 in the rooting medium raised the average rooting rate for different
individuals to 95%.
Key words:Melaleuca altennifolia;high essential oil;elite individual; Hyponex No.1;tissue culture;
commercialization
互叶白千层 Melaleuca altennifolia属桃金娘
科 Myrtaceae白千层属Melaleuac常绿灌木至小乔
木[1],又名茶树,是近年来从澳大利亚成功引进的
短周期、高经济价值香料植物及绿化树种,其树高
可达6m,能耐干旱贫瘠的土壤及渍水地,在气温
高、无霜期长的地区生长迅速。互叶白千层新鲜枝
叶和树干提取的精油,俗称 “茶树油”[2],是一种
强效的抗菌剂及免疫激活剂,是不可多得的天然保
健医药材料,广泛应用于制药、日化、食品、香料
等行业[3-4]。近年来,互叶白千层已在广西、广
东、福建等多个省份得以引种栽培种植[5-6]。为提
高互叶白千层种植、精油提取加工产业经济效益,
吴丽君等筛选出互叶白千层高精油优株[7],并通过
组培快繁技术成功培育出组培苗[8]推广应用于互叶
白千层丰产栽培试验示范基地建设,起到较好的推
广示范作用。互叶白千层组培继代苗基部易黑褐死
福建农业学报29(12):1246~1250,2014
Fujian Journal of Agricultural Sciences
文章编号:1008-0384 (2014)12-1246-05
亡,部分优株生根率低等,严重阻碍了高精油互叶
白千层优株组培苗产业化生产应用。因此,进一步
优化培养基配方,筛选可长期继代增殖、生根的培
养基是互叶白千层组培苗产业化的关键技术。
1 材料与方法
1.1 材料
高精油互叶白千层优良无性系继代12代以上
的增殖苗。高精油优良无性系由吴丽君等[7]筛选。
1.2 增殖培养基对褐化率的影响
以美国进口花宝1号 (微量元素、有机物及铁
盐浓度同 MS)、B5、MS为基本培养基,各培养
基大量元素分别设置3种不同浓度形成9种增殖培
养基,培养基中微量元素、有机物及铁盐浓度未做
调整,即以花宝1号3.0、4.5、6.0g·L-1、1/3B5、
2/3B5、B5、1/3MS、2/3MS、MS为处理。各培
养基均附加0.5mg·L-1 6-BA、0.1mg·L-1
NAA,30g·L-1白糖,5.5~6.0g·L-1琼脂,
pH值均调制为5.7~5.8。每个培养基随机抽取
10瓶 (每瓶5丛芽苗),统计10瓶中芽苗总丛数
和褐化芽苗丛数,褐化率(%)=褐化芽苗丛数/总
丛数×100%。观察统计分析培养基种类和大量元
素浓度对增殖苗褐化率及小苗生长情况的影响。
1.3 抗氧化维生素组合的筛选
以美国进口花宝1号3.0g·L-1为基本培养
基,与 抗 氧 化 维 生 素:生 物 素 (VH)0.05
mg·L-1、抗坏血酸 (VC)0.05mg·L-1、核黄
素 (VB2)0.05mg·L-1组合为6种培养基 (表
3)。观察增殖苗褐化及生长情况。各培养基的微量
元素、有机物及铁盐浓度均同 MS,附加 0.5
mg·L-16-BA、0.1mg·L-1 NAA、30g·L-1白
糖,5.5~6.0g·L-1琼脂,pH值均调制为5.7~
5.8。
1.4 GA3对继代苗生长的影响试验
以美 国 进 口 花 宝 1 号 3.0g·L-1 +0.5
mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1 NAA 为基本培养
基,与0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·L-1赤
霉素 (GA3)组合成6种增殖培养基。芽苗转接
40d,每种培养基随机抽取5瓶继代苗 (每瓶5丛
芽苗),统计各培养基上有效芽苗 (苗高2.0cm以
上、生长健壮、宜转入生根培养的芽苗)数及芽苗
平均高度。各培养基的微量元素、有机物及铁盐浓
度 均 同 MS,另 附 加 VH、VC、VB2 各 0.05
mg·L-1、30g·L-1白糖,5.5~6.0g·L-1琼
脂,pH值均调制为5.7~5.8。
1.5 花宝1号质量浓度对生根率的影响试验
试验以高精油优良无性系 H21、H35、H38[8]
为材料,以1/2MS为对照,设置4种不同浓度的
花宝1号 (1.5、2.0、2.5、3.0g·L-1)生根培
养基,选用最佳生根剂种类浓度[8]组合 ABT0.5
mg·L-1+NAA0.5mg·L-1。各培养基转接有效
芽苗100株,生根培养25d,观察统计各培养基芽
苗生根率。生根培养基附加15g·L-1白糖,5.5
~6.0g·L-1琼脂,pH值为5.7~5.8。
1.6 组培苗培养条件和移栽
培养室白天温度 (27±2)℃,夜间温度 (22±
2)℃。继代培养以光强1 500~2 000lx的日光灯
为辅助光源。生根培养前7d放置在无直接光源
处,培养15d后,以自然散射光为辅助光源,光
强约为3 000lx[8]。
生根培养25d,将生根瓶苗转到玻璃温室炼苗
20~30d[8]、苗高2.0cm以上、2条以上主根的试
管苗即可移栽。移栽基质为100%的黄心土,基质
消毒及组培苗栽后管理参照组培苗常规操作规
程[9]。
2 结果与分析
2.1 增殖培养基的筛选和优化
将增殖12代以上、苗高0.8~1.5cm长的继
代苗,切成含3~4个小芽的丛生芽转入9种培养
基。试验观察到,各培养基中芽苗褐化率及恢复生
长情况均有较大差异。从表1可见,花宝1号、
B5、MS系列培养基中小芽苗均有不同程度的褐化
现象,尤以 MS培养基褐化严重,死亡率高,且小
芽苗难以恢复生长,因此,MS不宜作为长期继代
增殖培养基,这在此前吴丽君[8]开展的相关研究已
有提及;B5培养基平均褐化率较低,但芽苗长势
不佳,说明B5也不适于芽苗增殖培养。
不同浓度的花宝1号、B5、MS培养基中,随
着大量元素浓度降低,小芽苗褐化率降低、褐化程
度有减轻的趋势。通过对表1中芽苗褐化率进行方
差分析 (表2),结果 (大量元素浓度F=13.35,
大于F0.05(2,4)=6.94)也进一步说明大量元素浓
度对芽苗褐化率达显著影响水平。花宝1号培养基
中,花宝1号4.5g·L-1和6.0g·L-1,均有一
定程度的褐化,花宝1号3.0g·L-1小芽苗无褐
化或轻度褐化,增殖生长正常。因此9种参试培养
基,花宝1号3.0g·L-1是互叶白千层组培苗工
厂化育苗增殖培养的首选。
7421第12期 吴丽君:高精油互叶白千层组培产业化技术研究
表1 不同培养基对芽苗褐化与生长的影响
Table 1 Effect of medium on growth and browning of plantlets
培养
基号
增殖培养基 褐化与生长情况
基本培养基
6-BA+NAA
/(mg·L-1)
褐化率
/%
平均褐化率
/%
培养40d小苗生长情况
1 花宝1号3.0g·L-1 0.5+0.1 0
芽苗基部浅褐色、芽苗叶色淡绿、增殖及高生长正常,增殖
培养周期40~45d
2 花宝1号4.5g·L-1 0.5+0.1 23 33.67
基部少量褐化、小芽苗培养15~20d后,小芽苗能恢复生
长,但延长了培养周期
3 花宝1号6.0g·L-1 0.5+0.1 78 基部褐化严重、小芽苗难以恢复生长
4 1/3B5 0.5+0.1 0 芽苗黄化或白化,营养生长不佳
5 2/3B5 0.5+0.1 0 12.33 基部浅褐色、小芽苗恢复生长较慢、增殖生长不佳
6 B5 0.5+0.1 37
基部褐色、小芽苗培养30d后,才逐渐恢复生长,但长势
不佳
7 1/3MS 0.5+0.1 0 50.67 少量小芽丛基部浅褐色、小芽苗增殖及高生长缓慢
8 2/3MS 0.5+0.1 52 基部浅褐至褐色、小芽苗培养30d后,才逐渐恢复生长
9 MS 0.5+0.1 100
基部黑褐、顶梢黄化、小芽苗生长难以恢复,褐化死亡率高
达60%以上
表2 基本培养基种类及大量元素浓度对芽苗褐化率方差分析
Table 2 Variance analysis on plantlet browning rate and medium formulation
离差来源 自由度 离差平方和 均方差 均方比(F) Fa(0.05)
大量元素浓度 2 7938.89 3969.45 13.35 6.94
基本培养基种类 2 2213.56 1106.78 3.72
误差项 4 1189.11 297.28
总计 8 11341.56
2.2 抗氧化维生素组合的筛选
试验结果见表3。在分别添加VC、VH、VB2
的3种培养基中,培养初期,芽苗基部均有一定程
度浅褐色,这与未添加维生素对照组 (表1中的1
号培养基)的芽苗生长较为相似,说明培养基中单
独添加VC、VH、VB2,均未能克服芽苗基部的
轻度褐变。在同时添加VC、VH的4号培养基中,
芽苗基部褐化有所减轻。而在同时添加 VC、VB2
或VH、VC、VB2的培养基中,才取得理想的防
褐效果。
表3 维生素组合对继代苗增殖生长的影响
Table 3 Effect of vitamins on multiplication and growth of subculture seedlings
培养
基号
培养基
维生素种类/(0.05mg·L-1)
Vc VH VB2
褐化情况小苗生长状况
1 花宝1号
3.0g·L
+ - - 培养初期芽苗基部浅褐色、叶色淡绿,芽苗增殖及高生长正常,培养周期40~45d
2 - + -
3 - - +
4 + + - 少量芽苗基部浅褐色至正常色、叶色正常、增殖及高生长正常,培养周期40~45d
5 + - + 芽苗茎段色泽正常、叶色正常、增殖及高生长较快,增殖培养周期可控制在40d
6 + + +
注:“+”表示添加,“-”表示未添加。
8421 福建农业学报 第29卷
2.3 GA3对继代苗有效芽苗的影响
芽苗转接40d,调查继代苗生长情况见表4。
由表4可见,培养基中添加一定浓度的GA3能促进
芽苗茎段的伸长生长,提高每瓶继代苗有效芽苗平
均数;但高浓度 GA3,芽苗细弱,不利于壮苗培养。
本试验中,添加GA3浓度0.4~0.6mg·L-1的培
养基,芽苗整齐、粗壮,且平均每瓶有效芽苗数达
17~22株。
表4 GA3对有效芽苗的影响
Table 4 Effect of hormone,GA3,on number of effective seedlings
培养
基号
培养基
GA3/
(mg·L-1)
高2cm以上芽苗
平均数/瓶(株)
有效芽苗平均
数/(瓶·株-1)
高2cm以上芽苗
平均高/cm
备注
1
花宝1号
3.0mg·L-1
+6-BA 0.5mg·L-1
+0.1NAA mg·L-1
0 0 0 0 芽苗粗壮、节间短小,叶色浓绿
2 0.2 6 6 2.1 芽苗粗壮,叶色浓绿
3 0.4 17 17 2.3 芽苗整齐、粗壮,叶色浓绿
4 0.6 22 22 2.7
5 0.8 29 15 2.9 细弱多、节间偏长、叶色偏淡绿
6 1.0 33 13 3.1
2.4 花宝1号浓度对生根率的影响
由试验结果表5可见,与对照组 (1/2MS)相
比,H21、H35、H38这3个高精油无性系在花宝
1号培养基平均生根率均有大幅度的提高,尤其是
在1/2MS培养基上生根率极低 (61%)的 H21无
性系,在花宝1号培养基上平均生根率达87%。
由此可见花宝1号培养基对互叶白千层组培苗生根
有较好的促进作用。通过对不同浓度花宝1号、不
同无性系的生根率的方差分析结果 (表6)表明,
花宝1号不同质量浓度及不同无性系对生根率的影
响已达极显著水平。本试验中,3个无性系在2.0
g·L-1花宝1号生根培养基均获得了较高生根率,
平均生根率为95%。
表5 培养基对不同无性系生根率的影响
Table 5 Effect of basic medium on rooting rate of individual Melaleuca altennifolia
试验号 基本培养基
ABT+NAA/
(mg·L-1)
生根率/%
H21 H35 H38
平均生根率
/%
CK 1/2MS 0.5+0.5 61 80 88 76.30
1 花宝1号1.5g·L-1 0.5+0.5 83 89 91 87.67
2 花宝1号2.0g·L-1 0.5+0.5 92 97 96 95.00
3 花宝1号2.5g·L-1 0.5+0.5 89 92 93 91.33
4 花宝1号3.0g·L-1 0.5+0.5 84 88 87 86.33
花宝1号 培养基平均生根率 87 91.5 91.75
表6 不同培养基、不同无性系对生根率的方差分析
Table 6 Variance analysis on rooting rate,medium and Melaleuca altennifolia
离差来源 自由度 离差平方和 均方差 均方比(F) Fa(0.01)
花宝1号质量浓度 3 136.91 45.63 31 9.78
无性系 2 57.17 28.58 19.42 10.9
误差项 6 8.83 1.47
总计 11 202.92
9421第12期 吴丽君:高精油互叶白千层组培产业化技术研究
3 讨论与结论
继代芽苗持续稳定增殖是组培苗产业化的关
键。只有适宜的培养基配方才能获得持续增殖的继
代芽苗。周丽华等[5]提及采用高、低浓度激素培养
基交替使用,以培养健壮芽的方法。吴幼媚等[9]、
张兴翠等[10]选用了 MS培养基,获得了再生苗。
List等[11]仅开展过互叶白千层成年树茎段诱导培
养及继代培养等初步研究,未提及获得再生植株。
Yohana de-Oliveira等[12]通过固体和液体培养,建
立了高效的微繁体系。国内外相关报道但均未提及
多代增殖培养所出现的继代芽苗褐化问题,这可能
与本研究所选用的高精油优良单株材料的含油率及
油成分有关。B1[8]培养基不适宜高精油优良无性
系多代 (12代以上)继代苗的增殖培养。参试的
花宝1号、B5、MS系列培养基中,唯有花宝1号
3.0g·L-1才能有效地克服继代苗褐化现象。植物
组培中,VH、VC、VB2是较少被使用的维生素。
在本试验中,VC+VB2或VH+VC+VB2组合在
抑制继代苗褐化上却起到了一定的组合效应。
生根率是组培快繁的重要指标,也是组培苗产
业化的关键技术指标。吴丽君等[8]筛选的生根培养
基上,部分无性系并未获得理想的生根率,个别无
性系平均生根率仅有55%。国内外相关研究未开
展不同高精油无性系的诱导生根差异研究。本研
究,花宝1号2.0g·L-1培养基中,参试无性系
均获得较高生根率,平均生根率达95%。较高的
生根率,一方面与花宝1号培养基有关,另一方面
与继代培养中添加一定浓度的GA3获得高质量的
有效芽苗有一定关系。
组培技术是组培苗产业化的基础。组培技术只
有在生产中得以推广应用,并不断优化、熟化和提
高组培苗的产业化效率,才能实现快繁的目的,才
能真正在生产中产生经济和社会效益。互叶白千层
高精油优良无性组培苗已进入规模化产业化育苗进
程,日前已培育组培苗1 000多万株。在组培苗产
业化生产中,花宝1号、维生素组合及GA3的应
用,大大提高组培苗产业化效率。
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(责任编辑:柯文辉)
0521 福建农业学报 第29卷