全 文 ：佛甲草对 S180 小鼠肿瘤组织 IL-10、TNF-α、NF-κB表达的影响*
周 青，连磊凡，吴丽珍，曹性玲，麻海娟，黄志华＊＊
(赣南医学院，江西，赣州 341000)
摘 要 目的:观察佛甲草提取物对 S180 小鼠肿瘤组织白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及核转录因子-κB(NF-
κB /P65、NF-κB /P50)蛋白表达的调节作用。方法:建立小鼠肉瘤 S180 移植性肿瘤模型，接种次日，将小鼠随机分为模型组、50 mg /
kg环磷酰胺组、4 g /kg及 8 g /kg佛甲草组，每组 10 只，连续给药 14 天。观察小鼠体重变化，计算肿瘤指数;应用蛋白免疫印迹技术
(Western blot)检测肿瘤组织 IL-10、TNF-α及 NF-κB /P65、NF-κB /P50 的蛋白表达。结果:经佛甲草提取物 4，8 g /kg治疗后，S180 荷
瘤小鼠肿瘤指数明显低于模型组，抑瘤率分别高达 84． 26%，62． 24%;且能显著提高小鼠 S180 肿瘤组织 IL-10、TNF-α 及 NF-κB /
P65、NF-κB /P50 蛋白的相对表达量。结论:佛甲草可能通过激活 NF-κB信号通路，上调 TNF-α的表达发挥抑瘤作用，另外，佛甲草
还可通过提高 IL-10 水平起抗肿瘤作用。
关键词 佛甲草;荷瘤小鼠;IL-10;TNF-α;NF-κB
佛甲草(Sedum lineare Thunb，SLT)是景天科植物佛甲草的
全草［1］。我们在前期研究中发现，佛甲草提取物具有较强的体
内抗肿瘤活性;能显著提高 S180 荷瘤小鼠外周血 CD3 +、CD4 +
T淋巴细胞百分率和 CD4 + /CD8 +比值;显著提高 S180 荷瘤小
鼠血清细胞因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-10(in-
terleukin-10，IL-10)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor al-
pha，TNF-α)水平，证实了佛甲草的免疫调节及抗肿瘤作用［2］。
核转录因子 NF-κB参与细胞生长、分化、炎症及免疫反应、凋亡
等多种表达调控，NF-κB的活化是否参与了佛甲草抗肿瘤过程，
以及在该过程中的作用机制尚未见文献报道。本研究在前期
工作基础上应用蛋白免疫印迹技术检测 S180 小鼠肿瘤组织
TNF-α、IL-10 及及核转录因子-κB(nuclear transcription factor
kappa B，NF-κB)蛋白表达水平，探讨佛甲草抗肿瘤的可能机
制。
1 材料和方法
1． 1 试验药物 佛甲草购于赣州市医药公司。取适量佛甲草
加两倍量的蒸馏水煮沸 30 min后过滤，残渣再用蒸馏水加热提
取 1 次。合并两次滤液，通过旋转蒸发仪浓缩至适量，3 倍量
95%的乙醇放置 48 h，通过旋转蒸发仪和减压抽滤器过滤，回收
滤液中的乙醇至无醇味，并浓缩至 0． 8 g /ml 生药液备实验用。
注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号:
12041125。
1． 2 动物与瘤株 SPF 级昆明小鼠，雄性，6 ～ 8 周龄，体重 18
～ 22 g，由湖南省斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证
号:SCXK(湘)2009-0004，合格证号:HNASLKJ20120217。鼠源
S180 肉瘤细胞，由中国医学科学院医药研究所提供，赣南医学
院科研中心传代培养。
1． 3 试剂 β-actin抗体(Ta-09)、辣根过氧化物酶标记的山羊
抗兔 lgG(ZB-2303)及山羊抗鼠 lgG(ZB-2305)均购自北京中杉
金桥生物技术有限公司;IL-10(sc-365858)和 NF-κB /P50(sc-
114)一抗均购自 Santa Cruz公司;NF-κB /P65(8242S)一抗购自
cell signaling technology 公司;TNF-α(ab66579)一抗购自 abcam
公司;BSA蛋白浓度测定试剂盒购自北京天根生化科技有限公
司(J8830 /M2114);化学发光试剂盒(1856135 /1856136)购自
Thermo Fisher公司。
1． 4 仪器 连续光谱多功能酶标仪，美国热电;Trans-blot 转膜
及小型垂直电泳系统和超高灵敏度化学成像发光系统，美国伯
乐公司。
1． 5 方法 参照文献［3］方法，无菌条件下抽取传第三代后接
种 7 天的 S180 瘤源小鼠的腹水，离心，弃上清，无菌生理盐水调
至细胞浓度为 1 × 107 个 / rnl，每只小鼠右腋皮下接种 0． 2 ml，建
立小鼠实体瘤模型。24 h后，将小鼠称重并随机分为模型组、50
mg /kg环磷酰胺组、4g /kg 及 8g /kg 佛甲草提取物组，每组 10
只。环磷酰胺腹腔注射给药，每 2 天 1 次;其余均灌胃给药，每
日 1 次，连续 14 天。
1． 5． 1 小鼠体重和肿瘤指数的测定 末次给药 24 h 后，颈椎
脱臼处死小鼠，称体重，取出肿瘤，用电子天平称重量，计算肿瘤
指数 = 肿瘤重量(mg)÷体重(g)。
1． 5． 2 Western blot 法检测肿瘤组织 IL-10、TNF-α 及 NF-κB /
P65、NF-κB /P50 的蛋白表达 取 20 mg肿瘤组织于 1． 5 ml离
心管中，加入 200 μl裂解液，捣碎后，再加入 400 μl 裂解液，置
于 4 ℃颠倒混匀 1 h。12000 × g，4℃，离心 5 min。取上清液
BCA法行蛋白定量。取总蛋白 50 μg，加入上样缓冲液，95℃，5
min蛋白变性后，于 10% SDS-PAGE凝胶电泳，分离蛋白。将凝
胶上的蛋白转印到醋酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温封闭至少
1 h。分别加入 IL-10、TNF-α、NF-κB /P65、NF-κB /P50 一抗，4℃
过夜，TBST漂洗液洗膜 5 min，共 3 次;加入辣根过氧化物酶标
记标记的二抗，室温孵育 1 h ;TBST洗膜后，化学荧光法(ECL)
显色，于超高灵敏度化学成像发光仪照相，Image Lab 3． 0 软件
测定灰度值，与相应 β-actin比较后，将模型组值定为 1，计算其
余组相对值。
2 结果
2． 1 佛甲草提取物对 S180 荷瘤小鼠体重及肿瘤指数的影响
与正常对照组比较，模型组及环磷酰胺组小鼠体重下降;与模型
25 中药药理与临床 2015;31(2)
* 基金项目:江西省卫生厅科技项目(NO:2014111) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2015.02.019
组比较，佛甲草提取物 4、8 g /kg均能提高小鼠体重且显著降低
小鼠肿瘤指数;与环磷酰胺组比较，佛甲草提取物 4、8 g /kg 组
小鼠体重明显升高，肿瘤指数显著降低，提示佛甲草提取物对
小鼠 S180 荷瘤的抑制作用优于环磷酰胺，而毒副作用却小于环
磷酰胺，结果见表 1。
表 1 佛甲草提取物对 S180 荷瘤小鼠体重及肿瘤指数的影响(珋x ±
s，n = 10)
组别
剂量
(g /kg)
体重
(g)
瘤重
(mg)
肿瘤指数
(mg /g)
抑瘤率
(%)
正常对照 33． 71 ± 2． 21*
模型对照 28． 50 ± 2． 47 64． 16 ± 18． 50 1． 50 ± 0． 50
环磷酰胺 0． 05 25． 42 ± 1． 92 49． 63 ± 17． 05 1． 11 ± 0． 30* 29． 28
佛甲草 4 31． 62 ± 3． 22 10． 10 ± 3． 83＊＊ 0． 33 ± 0． 13＊＊ 84． 26
佛甲草 8 30． 63 ± 3． 32 24． 23 ± 19． 80＊＊ 0． 45 ± 0． 21＊＊ 62． 24
与模型组比较 * P ＜0． 05，＊＊ P ＜0． 01(下同)
2． 2 佛甲草提取物对 S180 小鼠肿瘤组织 IL-10、TNF-α 及 NF-
κB /P65、NF-κB /P50 蛋白表达的影响 表 2 及图 1-4 所示，与模
型组比较，4，8 g /kg 佛甲草提取物均可不同程度上调 IL-10、
TNF-α和 NF-κB / P65、NF-κB / P50 蛋白的相对表达量，差异有
统计学意义。提示佛甲草提取物可能通过激活 NF-κB 信号通
路上调 IL-10、TNF-α的表达而发挥抑瘤作用。
表 2 佛甲草提取物对 S180 荷瘤小鼠肿瘤组织 IL-10、TNF-α 及
NF-κB / P65、NF-κB / P50 表达的影响(珋x ± s，n = 6)
组别
剂量
(g /kg)
IL － 10 TNF － α NF － κB / P65 NF － κB /P50
模型对照 1． 00 ± 0． 00 1． 00 ± 0． 00 1． 00 ± 0． 00 1． 00 ± 0． 00
环磷酰胺 0． 050． 17 ± 0． 10＊＊3． 92 ± 0． 29＊＊2． 49 ± 0． 10* 4． 24 ± 0． 48＊＊
佛甲草 4 1． 73 ± 0． 44＊＊3． 01 ± 0． 40＊＊2． 81 ± 0． 88＊＊2． 07 ± 0． 78
佛甲草 8 1． 27 ± 0． 35 2． 18 ± 0． 34* 3． 71 ± 0． 68＊＊2． 65 ± 0． 65*
3 讨论
肿瘤的发生、发展和转归与机体的免疫功能，特别是与细
胞免疫功能密切相关。细胞因子是一类具有免疫调节作用的
重要蛋白质物质，在机体免疫应答等诸多方面起着重要作用。
越来越多的研究提示，同一细胞因子在不同微环境下可以发挥
不同的生物学效应。IL-10 因其具有的免疫抑制功能而广为人
知。新近研究报道 IL-10 也具有免疫刺激的作用。实验表明，
IL-10 是诱导细胞毒性酶表达的关键调控因子。IL-10 介导了肿
瘤内 T细胞浸润和 CD8 + T 细胞的细胞毒性作用。研究得出:
①IL-10 协助对内源性皮肤肿瘤发病和进展的高效免疫监视;②
IL-10 在肿瘤中诱导表达 MHC-I和 IFN-γ，二者是抗肿瘤免疫监
视两个关键分子;③IL-10 主要凭借肿瘤浸润 CD8 + T 细胞高表
达的 IL-10 受体和产生 IFN-γ 来诱导细胞毒性酶反应［4，5］。从
长期幸存者和短期幸存者体中培养转移 Thl 细胞发现，长期幸
存者产生显著高水平的 IL-10，推测持续的高水平 IL-10 可诱导
IFN-γ的产生来促进免疫激活作用，引起抗肿瘤反应［6］。
肿瘤坏死因子 TNF-α 是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细
胞因子，具有直接抑制和杀伤肿瘤细胞的功能，且可诱导肿瘤细
胞凋亡并破坏肿瘤组织微血管的形成，发挥其抗肿瘤作用。目
前认为 TNF-α的促凋亡作用主要是由细胞膜上死亡受体的介
导下完成的［7］。TNF-α 可诱导肿瘤细胞凋亡，其凋亡效应是通
过与细胞膜上特异性受体(TNFＲ，主要是 TNFＲl)结合后，触发
细胞内信号转导，激活 NF-κB，诱导细胞凋亡［8，9］。由于 TNF-α
的良好的抗肿瘤效应，目前不但是评价临床治疗效果、机体免疫
机能状态的指标，而且也作为一种评价抗肿瘤药物效价的一个
靶点。
NF-κB是在成熟的 B 淋巴细胞发现的一种重要的核转录
因子。它能与免疫球蛋白 κ 轻链内含增强子的序列特异性的
结合，进而促进了 κ 轻链基因的表达，发挥转录和调控作用。
35中药药理与临床 2015;31(2)
具有生理功能的 NF-κB 通常是由 P50 和 p65 两个亚单位构成
的异源二聚体。静息状态下，NF-κB抑制蛋白(I-κB )与 NF-κB
P65 蛋白结合，覆盖 P50 核定位信号，使 NF-κB以一种非活化的
形式存在于胞质中。当细胞受到某些刺激时，会引发一系列连
锁的酶促反应，诱导 I-κB 磷酸化。磷酸化的 I-κB 被泛素化降
解，进而暴漏出 P50 核定位信号，使 NF-κB 转位进入细胞核上
调多种细胞因子的表达发挥免疫调控等作用［10］。现代研究发
现 NF-κB与靶基因的基因序列上存在的 NF-κB结合位点结合，
促进靶基因转录，包括参与可促进凋亡基因的转录，从而影响
肿瘤细胞的增殖，同时还可以上调抑制细胞生长的基因水
平［11］。据报道，在 5-ALA 介导的光动力治疗口腔癌细胞系
Ca9-22 中，通过 NF-κB /JNK途径引起细胞凋亡［12］;在结肠癌细
胞中则发现 NF-κB 可以通过上调 PUMA 的表达促进细胞凋
亡［13］;选择性抑制表皮细胞中 NF-κB 的活性则会增加皮肤鳞
状细胞癌的发生［14］。另外 NF-κB 还可促进 M1 型活化相关基
因的转录，后者在肿瘤发生发展的早期，发挥免疫监视和抗肿
瘤作用［15］。
本研究结果显示，佛甲草提取物可显著降低 S180 荷瘤小鼠
的肿瘤指数，明显上调小鼠 S180 荷瘤组织 IL-10、TNF-α、NF-
κB / P65 及 NF-κB / P50 的表达。结合上述文献资料及本课题
组前期研究成果［2］，我们推测 NF-κB的活化参与了佛甲草抗肿
瘤过程，且佛甲草可能通过激活 NF-κB 信号通路，上调调节免
疫的细胞因子，继而增强免疫调节功能发挥抗肿瘤作用。
参考文献
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The effects of Sedum lineare Thunb on IL-10，TNF-α and NF-κB protein expression
in tumor tissue of S180-bearing mice
Zhou Qing，Lian Leifan，Wu Lizhen，Cao Xingling，Ma Haijuan，Huang Zhihua
(Gannan Medical University，Ganzhou 341000)
Objective:To study the anti-tumor mechanisms of Sedum lineare Thunb(SLT)alcohol extract by investigate the protein expression of
IL-10，TNF-α and NF-κB in tumor tissue in mice bearing S180 sarcoma． Methods:S180-bearing mice model were established by subcutane-
ously inoculating S180 ascitic tumor into the right armpit． From the second day，the mice were treated with normal saline，cyclophosphamide
(50 mg /kg)or two doses of SLE (4，8 g /kg)through intragastric administration，and the process extent 14 days． After the last administra-
tion，the mice body weight and the index of tumor，the protein expression of IL-10，TNF-α，NF-κB /P65 and NF-κB /P50 in tumor tissue
were measured by western blot method． Ｒesults:The body weight of mice treatmented with SLT was dramaticlly higher than those of the CP．
Compare with the model group，SLT groups showed decreases in tumors index and could significantly improve the protein expression of IL-10，
TNF-α，NF-κB /P65 and NF-κB /P50． Conclusion:Activating NF-κB and then elevating TNF-α level is one of the mechanisms of SLT＇s an-
ti-tumor effect，and enhancing IL-10 content is the other one．
Key words Sedum lineare Thunb(佛甲草);tumor-bearing mice;NF-κB
45 中药药理与临床 2015;31(2)