全 文 ：基金项目:国家自然科学基金项目(No． 81360522);甘肃省自然科学基金项目(No． 1310ＲJZA091)
作者简介:卢年华，男，研究方向:中药新剂型研究，E － mail:910966042@ qq． com
通信作者:景明，男，教授，研究方向:中藏药新制剂研究，Tel:0931 － 8765398，E － mail:1339512509@ qq． com
藏药湿生扁蕾提取物通过 NF － κB通路诱导结肠癌
细胞凋亡的机制研究
卢年华，赵慧巧，陈正君，景明，张艳霞
(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)
摘要:目的 探讨藏药湿生扁蕾提取物通过 NF － κB信号通路诱导结肠癌 SW480 细胞凋亡的作用及其机制。
方法 本研究用不同浓度的藏药湿生扁蕾提取物处理结肠癌 SW480 细胞，通过 JC － 1 染色检测 SW480 细胞线粒
体膜电位的变化，通过 Hoechst染色以判断藏药湿生扁蕾提取物是否具有诱导结肠癌细胞 SW480 细胞凋亡效应。
同时检测 NF － κB蛋白的表达，用以明确 NF － κB信号通路在结肠癌发生中的作用机制。结果 经一定浓度的湿
生扁蕾提取物处理后的 SW480 细胞内，NF － κB的表达明显下调，染色现象揭示湿生扁蕾提取物具有促进肿瘤细
胞凋亡的作用。结论 湿生扁蕾提取物可以在体外诱导肿瘤细胞凋亡，其抗肿瘤机制是通过 NF － κB 信号通路介
导的。
关键词:湿生扁蕾;结肠癌;细胞凋亡;NF － κB信号通路
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:2095 －5375(2016)03 －0129 －004
doi:10． 13506 / j． cnki． jpr． 2016． 03． 002
Study on mechanism of Tibetan Gentianopsispaludosa(Hook． f．)Ma． extraction(GPE)
inducing colon cancer cells apoptosis by NF － κB signaling pathway
LU Nianhua，ZHAO Huiqiao，CHEN Zhengjun，JING Ming，ZHANG Yanxia
(Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China)
Abstract:Objective To explore the mechanism of GPE inducingapoptosis of colon SW480 cancer cells by NF － κB
signaling pathway．Methods Colon SW480 cancer cells were treated with different concentrations of GPE． JC － 1 staining
was used to detect changes of mitochondrial membrane potential and hoechst staining was used to determine whether the ex-
traction can induce apoptosis in colon SW480 cancer cells or not． Simultaneously，expression of NF － κB protein was detec-
ted to clear the mechanism of NF － κB signaling pathway in coloniccarcinoma． Ｒesults The expression of NF － κB in
SW480 cells became depress with treatment of certain concentration of GPE，and the phenomenons of staining showed that
GPE had a potential ability to result in cancer cell apoptosis． Conclusion GPE can induce apoptosis of tumor cells in
vitro，and the mechanism might be partly related to NF － κB signaling pathway．
Key words:Gentiano psispaludosa(Hook． f．)Ma;Colon cancer;Cell apoptosis;NF － κB signaling pathway
湿生扁蕾［Gentianopsispaludosa(Hook． f．)Ma］
为龙胆科扁蕾属植物的干燥全草，藏药名机合斗，具
有清热解毒、利湿消黄之功效，临床主要用于肝炎、
胆囊炎、胃肠炎、结膜炎、急性肾盂肾炎、疥疮肿毒等
疾病的治疗［1］。近年来，随着对湿生扁蕾有效成分
研究的深入，其功效也不断被发现。有研究表明，湿
生扁蕾提取物(GPE)能够稳定抑制动物体内 S180
肉瘤及其他瘤株的生长［2］。湿生扁蕾中的 1 －羟基
－ 3，7，8 －三甲氧基口山酮和 1，7 －二羟基 － 3，8 －
二甲氧基口山酮对卵巢癌细胞 HO － 8910 具有毒性
作用［3］。GPE可诱导结肠癌 SW480 细胞的凋亡［4］，
调控结肠癌 SW480 细胞 STAT3 信号通路的活
化［5］。但有 GPE 通过 NF － κB 信号通路诱导结肠
癌 SW480 细胞凋亡的作用及其机制的研究尚未见
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文献报道。本试验从调控 NF － κB 信号通路方面研
究藏药 GPE 诱导结肠癌 SW480 细胞凋亡的作用及
其机制，为结肠癌的治疗和新药开发开拓思路。
1 材料与方法
1． 1 细胞株 结肠癌 SW480 细胞株(兰州大学生
命科学学院)。
1． 2 仪器与试剂 APC300 型电泳仪和水平式电
泳槽(美国 Bio － Ｒad 公司);CO2 培养箱(天津市泰
斯特仪器有限公司);5417Ｒ 高速离心机(德国
Heraeus公司);细胞培养板(美国 Costar公司)。
胎牛血清(FBS，Hyclone 公司);DMEM 培养基
(Hyclone公司);抗生素(美国 Gibco 公司);Hoechst
染色试剂(美国 Invitrogen公司);JC － 1 染色试剂盒
(北京泛博生物化学有限公司);二甲基亚砜(DM-
SO，Ameresco公司);湿生扁蕾采自甘肃省甘南藏族
自治州临潭县冶力关镇，经甘肃农业大学陈垣教授
鉴定为 Gentianopsispaludosa(Hook． f．)Ma． 的干燥
全草。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 GPE 的制备 取湿生扁蕾药材，粉碎。用
95%乙醇回流提取，提取液回收乙醇至无醇味，浸膏
加等体积蒸馏水，混匀，用乙酸乙酯萃取至无色，回
收乙酸乙酯，浓缩成浸膏，用 DMSO助溶，配制成 90
μg·mL －1的母液，0． 22 μm 滤膜过滤除菌，即得
GPE，于 4 ℃储存。临用前用培养液稀释至所需浓
度。试验用 DMSO 浓度不超过 0． 2%(V /V)，此浓
度下 DMSO对细胞生长状况无影响，且经培养试验
证明没有微生物生长。
1． 3． 2 SW480 细胞的培养 将冻存于液氮保存罐
中的 SW480 细胞取出后立即放入 37 ℃水浴中，快
速摇晃，直至冻存液完全融化;将细胞悬液移入 15
mL离心管，缓慢加入 4 mL培养液，1 000 rpm离心 5
min，弃上清液后，加培养液，离心，弃上清液。然后
细胞用 DMEM 培养基培养，加入 10% FBS 和
100 U·mL －1抗生素，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中
培养。每天换液 1 次，当细胞融合到 90%左右时，
以 1 ∶ 3 比例细胞传代，数次传代的细胞用于后续
试验。
1． 3． 3 SW480 细胞分组 将处于对数生长期的细
胞分成以下 6 组:空白对照组(加等体积的 PBS)、
GPE 2 μg·mL －1组、GPE 10 μg·mL －1组、GPE 50
μg·mL －1组、GPE 250 μg·mL －1组和阳性对照组
(CCCP)。
1． 3． 4 SW480 细胞药物处理 传代后细胞生长密
度再次达到 90%左右时，加入 0． 25%胰蛋白酶，移
液器吹打细胞，离心收集细胞。将 SW480 细胞接种
于 6 孔板中，调整细胞密度为 1 × 105·mL －1，培养
基为 DMEM培养基，加入 10% PBS 和 100 U·mL －1
抗生素。第二次细胞贴壁后，将 GPE 加入到培养基
中孵育细胞，浓度分别为 0(空白对照)、2、10、50、
250 μg·mL －1、CCCP(阳性对照)，37 ℃孵育 48 h
后，收集细胞用于 JC － 1 染色和 Hoechst染色。
1． 3． 5 JC － 1 染色 取 50 μL JC － 1，加入 8 mL超
纯水，充分溶解，再加入 2 mL JC － l 染色缓冲液，混
匀后即为 JC － 1 染色工作液。把 CCCP 按照 1 ∶ 1
000 的比例加入到细胞培养液中，处理细胞 20 min。
移去 6 孔板中的细胞培养液，PBS洗涤细胞两次，加
入 1 mL细胞培养液，再加入 l mL 的 JC － 1 染色工
作液，充分混匀，细胞培养箱中 37 ℃孵育 20 min，吸
除上清液，用 JC － 1 染色缓冲液洗涤两次。加入 2
mL细胞培养液，荧光显微镜下观察并拍照。
1． 3． 6 Hoechst 染色 Hoechst 储存液用蒸馏水配
成 1 mg·mL －1的浓度，使用时用 PBS 稀释，终浓度
为 10 μg·mL －1。在 6 孔板中加入 0． 5 mL H2O2 固
定 10 min，移去固定液，用 PBS 洗两遍，每次 3 min，
洗涤时用手动晃动数次，加入 0． 5 mL Hoechst 染色
液，染色 5 min，手动晃动数次。再用 PBS 洗两遍，
每次 3 min。加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，
盖上贴有细胞的盖玻片，在荧光显微镜下检测，激发
波长 350 nm左右，发射波长 460 nm左右。
1． 3． 7 Western blot 检测蛋白表达量 取“1． 3． 4”
项下的 SW480 细胞，弃去培养基，离心，弃上清液，
PBS清洗。加入 PBS，刮下细胞，收集 PBS 悬液于
EP 管中，离心，弃上清液，沉淀以 Complete Lysis
Buffer重悬，震荡，摇床孵育。将裂解液高速震荡混
匀，离心。取上清液至新的 EP 管中，依次加入丙烯
酰胺、Tris － Cl、SDS、TEMED、AP 及双蒸水，充分混
匀，将混合液加到双层玻杯中。将无水乙醇加到分
离胶上，孵育。将分离胶灌入浓缩胶内，插入梳子，
放置。安装好电流装置，拔出梳子，分别倒入上槽液
与下槽液，进行电泳，当溴酚兰泳动至分离胶下缘
时，停止电泳。打开双层玻片，弃去浓缩胶，切去分
离胶左右无蛋白的部分，测量胶的大小。按胶的大
小，剪裁 PVDF膜，将其浸泡到甲醇中，将胶、滤纸及
PVDF膜浸入电转液中。按照滤纸、膜、胶、滤纸的
顺序，依次放置于半干电转仪中，电转。转膜之后，
将 PVDF膜置于 TBS /TBS 清洗，放入脱脂奶粉中封
闭。加入一抗，4 ℃冰箱过夜。洗去一抗，孵育二
·031· 药学研究·Journal of Pharmaceutical Ｒesearch 2016 Vol． 35，No． 3
抗，显色反应。用 Bio － Ｒad图像分析仪进行图像扫
描，采用 Quantity One软件进行灰度值测定。
1． 3． 8 统计学分析 所有检测数据以均数 ±标准
差(x ± s)表示，并采用 SPSS 13． 0 统计软件进行分
析，组间数据采用 t检验，组内数据釆用卡方检验，P
＜ 0． 05 为有统计学意义。
2 结果
2． 1 JC － 1 染色结果 各组细胞在荧光显微镜下
观察到不同强度的红绿色荧光。空白对照组中，由
于没有药物处理 SW480 细胞，细胞所发荧光为红色
荧光，几乎没有绿色荧光;在 2 μg·mL －1和 10
μg·mL －1组，部分细胞开始出现绿色荧光，部分细
胞已被诱导凋亡，但大部分细胞仍显示红色荧光，红
色和绿色荧光相互作用，融合为橙色荧光;在
50 μg·mL －1和 250 μg·mL －1组，绿色荧光在整个
视野中处于优势地位，标志着细胞开始大量凋亡，凋
亡最明显的属 250 μg·mL －1组，效果和阳性对照组
相当，结果见图 1。
A．空白对照组孵育细胞 48 h后 JC － 1 染色;B． 2 μg·mL －1 GPE
孵育细胞 48 h后 JC － 1 染色;C． 10 μg·mL －1 GPE 孵育细胞 48
h后 JC － l染色;D． 50 μg·mL －1GPE孵育细胞 48 h后 JC － 1 染
色;E． 250 μg·mL －1GPE孵育细胞 48 h 后 JC － 1 染色;F．阳性
对照 CCCP孵育细胞 48 h后 JC － 1 染色
图 1 SW480 细胞经 GPE处理后 JC － 1 染色图片(× 400)
2． 2 Hoechst染色结果 Hoechst 染色各组细胞中，
蓝色荧光细胞数目均不一致。空白对照组几乎没有
细胞凋亡，蓝色荧光细胞很少，且形态均一完整，染
色质分布均匀;2 μg·mL －1、10 μg·mL －1组与空白
对照组相比，蓝色荧光细胞逐渐增多;在 50
μg·mL －1、250 μg·mL －1组，大量蓝色荧光细胞开
始出现，同时出现典型的凋亡小体，染色质浓缩，核
碎裂成大小不等的圆形小体。这表明 SW480 细胞
在 GPE 剂量增大时逐渐出现凋亡，且药物浓度越
大，凋亡特征越明显，具有正常形态的细胞越少见。
提示 GPE 有强烈的促凋亡效应，可用于抗肿瘤治
疗，结果见图 2。
A．空白对照组孵育细胞 48 h后 Hoechst染色;B． 2 μg·mL －1孵
育细胞 48 h后 Hoechst 染色;C． 10 μg·mL －1孵育细胞 48 h 后
Hoechst 染色;D． 50 μg·mL －1孵育细胞 48 h后 Hoechst染色;E．
250 μg·mL －1孵育细胞 48 h后 Hoechst染色;F．阳性对照 CCCP
孵育细胞 48 h后 Hoechst染色
图 2 SW480 细胞经 GPE处理后 Hoechst染色图片(× 100)
2． 3 NF － κB的表达 试验结果表明，在 SW480 细
胞中，NF － κB 被激活，而经 GPE 处理后，NF － κB
的表达有明显下调，由此证明 NF － κB 与癌症发生
密切相关。即当 NF － κB被激活时，其会调节 NF －
κB信号通路，进行促进肿瘤发生，而 GPE 可以抑制
NF － κB的表达，进而阻断 NF － κB 信号通路，促进
肿瘤细胞凋亡，结果见图 3。
A．空白对照组;B．2 μg·mL －1;C．10 μg·mL －1;D．50 μg·mL －1;
E．250 μg·mL －1;F．阳性对照 CCCP
图 3 免疫印迹检测 SW480 细胞中 NF － κB蛋白的表达，
经 GPE处理后 NF － κB表达下调;GAPDH为内参对照
3 讨论
本试验将 GPE 分为 0(空白对照)、2、10、50、
250 μg·mL －1等 5 个等比浓度梯度，经 JC － 1 染色、
Hochest染色和 Western blot 检测表明，湿生扁蕾提
取物体外能够诱导 SW480 细胞的凋亡，且与 NF －
κB信号通路介导有关。在此浓度范围内，GPE诱导
SW480 细胞凋亡与 GPE 呈现很好的浓度依赖型。
250 μg·mL －1组中 SW480 细胞凋亡最明显，而 2
μg·mL －1组凋亡作用不明显，提示在用 GPE 治疗
肿瘤时可适当加大剂量。
湿生扁蕾 95%的乙醇提取物中主要是木犀草
素等黄酮类化学成分［6 － 7］，之前的研究［8 － 9］表明
GPE 能有效抑制 TNBS 模型诱导的溃疡性结肠炎，
可升高 UC 大鼠 SOD 值，降低 MDA 值，从而清除氧
自由基，减少过氧化脂质生成，降低 MPO活性，减少
中性粒细胞浸润，从而抑制结肠纤维化，改善或减轻
·131·药学研究·Journal of Pharmaceutical Ｒesearch 2016 Vol． 35，No． 3
结肠炎症状。本试验是对上述影响机制的进一步研
究，旨在明确 GPE通过 NF － κB 信号通路在抑制溃
疡性结肠炎向结肠癌转化的机制。此外，应进一步
开展对 GPE中筛选有效化学成分的研究，以推进中
医药抗肿瘤新产品开发方面的发展。
近年来，与 NF － κB 活化有关的信号转导途径
以及相应诱导的基因表达的研究有相应进展，越来
越多的证据显示，NF － κB 活性失控与人类肿瘤发
生相关［10 － 11］。研究表明，在许多恶性肿瘤中检测到
NF － κB的持续活化和过量表达，而在相应的正常
组织中却没有此改变［12］。本试验研究证实，GPE 抑
制 SW480 细胞凋亡的机制是通过 NF － κB 信号通
路介导的，将为临床早期预防肿瘤以及治疗靶点的
选择奠定理论依据。
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