全 文 ：地锦草有效部位抗真菌作用及其机制研究
安惠霞1，古力娜·达吾提2，李治建3，斯拉甫·艾白2，3
(1．新疆石河子大学药学院，新疆 石河子 832000;2．新疆维吾尔自治区维吾尔医医院，
3．新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆 乌鲁木齐 830049)
收稿日期:2010 － 05 － 17，修回日期:2010 － 06 － 19
基金项目:国家“十一·五”科技支撑计划(No 2007BAI30B03) ;国家
自然科学基金资助项目(No 30760308)
作者简介:安惠霞(1983 －) ，女，硕士生，E-mail:naferan@ sina． com;
斯拉甫·艾白(1960 －) ，男，硕士，研究员，主任药师，教
授，研究方向:药理毒理学及新药开发，通讯作者，Tel /
Fax:0991-2557730
中国图书分类号:R 284． 1;R 379． 9;R 978． 5
文献标识码:A 文章编号:1001 － 1978(2010)09 － 1162 － 04
摘要:目的 初步研究维吾尔药材地锦草有效部位体外抗真
菌作用及其机制。方法 采用透射电镜观察地锦草有效部
位对红色毛癣菌超微结构的影响;高效液相色谱法研究地锦
草有效部位对真菌细胞膜麦角甾醇生物合成的影响。结果
透射电镜下可见，真菌细胞壁不完整，厚薄不均且局部有
缺损，细胞膜轮廓不清，局部有破损，胞内细胞器损伤严重，
多呈空泡化，细胞内成分聚集成电子密度较高的团块;高效
液相色谱法检测，红色毛癣菌中细胞膜中麦角甾醇含量与其
生长对照菌相比，含量降低，差异有显著性，并且有明显的剂
量依赖性。结论 地锦草有效部位作用于红色毛癣菌后，可
使其形态和超微结构发生明显的改变，通过影响真菌细胞膜
麦角甾醇的生物合成发挥抗真菌作用。
关键词:地锦草;有效部位;抗真菌;红色毛癣菌;作用机制;
超微结构;麦角甾醇
地锦草，维吾尔药名为夏塔热其尼(Xiahatereqi-
ni) ，为大戟科植物地锦 Euphorbia humifusa Willd．或
斑地锦 Euphorbia maculata L． 的干燥全草，是中医、
维吾尔医常用药材，临床主要用于治疗手癣、体癣、
足癣、花斑癣、银屑病［1］。红色毛癣菌(Trichophyton
rubrum)是引起皮肤真菌的主要病原菌，占皮肤癣菌
病感染的 69． 5 %，可致手癣、足癣、头癣等，所致癣
菌病病程持久，难治愈，易复发［2］。采用透射电镜
观察地锦草有效部位对红色毛癣菌超微结构的影
响，高效液相色谱法研究地锦草有效部位对真菌细
胞膜麦角甾醇生物合成的影响，以研究其抗真菌作
用的机制。从天然药物中有效地提取、筛选抗真菌
活性部位及其成分，寻找安全性好、抗菌谱广、疗效
高的抗真菌药物已成为一个重要的研究方向，并具
有广阔的应用开发前景［3 － 5］。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 地锦草药材由新疆维吾尔医药研
究所药剂室提供，经生药学鉴定为大戟科植物地锦
草 Euphorbia humifusa Willd。药材醇提取后采用大
孔吸附树脂法洗脱得到 6 个部位，课题组参照美国
临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝
状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》
(M38-A)［6］，对 6 个不同部位的抗真菌敏感性进行
筛选，得出其中部位 6 的体外抗真菌活性最为明显，
对红色毛癣菌的 MIC 达到 149 mg·L －1，定位有效
部位。有效部位参照中国药典一部(附录ⅤA)进行
含量测定，总黄酮含量为 34 mg·g －1。
特比奈芬(TERB) ，纯度 99. 82%，上海诚优有
限公司提供，批号为:20090101。
1． 2 试验菌株与培养基 红色毛癣菌(Trichophy-
ton rubrum) ，菌种编号:XYZ T． r 40013，由新疆医科
大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库(XYZ)提
供，均经过常规的真菌学鉴定，在 PDA培养基上 4℃
保存备用。RPMI 1640 培养基(Gibco 公司) ;三氮
吗啡啉丙磺酸(MOPS，Amresco公司) ;
1． 3 透射电镜观察地锦草有效部位对红色毛癣菌
超微结构的影响 参照 NCCLS 推荐的 M38-A 方
案［6］，将地锦草有效部位(实验浓度为 64 mg·L －1)
和红色毛癣菌菌接种液分别以 1 ∶ 1 的比例稀释到
终浓度，26℃孵育 7 d 后，PBS 漂洗，体积分数为 3
的戊二醛固定，体积分数为 1 的锇酸固定，系列浓度
乙醇脱水，丙酮 +乙醇脱水，包埋剂包埋，烘烤聚合，
超薄切片，染色，日立 H-600型透射电镜(TEM)观察。
1． 4 高效液相色谱法(HPLC)研究地锦草有效部
位对红色毛癣菌麦角甾醇生物合成的影响 药物干
预菌丝操作同电镜样品的制备。挑取各孔菌丝，
PBS(pH =7. 4)洗涤，精密称取各组湿菌 0. 1 g，置于
50 ml圆底烧瓶中，加皂化剂(0. 1 g·ml －1 KOH 的
甲醇溶液)15 ml，混匀，80℃水浴皂化 90 min。加石
油醚(沸程 30℃ ～ 60℃)15 ml 提取 3 次，合并提取
液置于 60 ml 分液漏斗中，加水 15 ml 洗涤，醚层于
60℃水浴挥干，得未皂化脂(nonsaponifiable lipids，
NSLs)［7］，未皂化脂用甲醇溶解，定容至 5 ml，0. 45
·2611· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2010 Sep;26(9) :1162 ～ 5
μm微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法(HPLC)测
定滤液中麦角甾醇含量。
HPLC 色谱条件:色谱柱 Waters symmetry
shieldTMRP(4. 6 mm ×150 mm，5 μm) ，柱温 30℃;流
动相:甲醇;检测波长:282 nm;流速:1. 0 ml·
min －1;进样量:20 μl。
1． 5 统计学分析 麦角甾醇含量测定结果采用
Students t-test检验，结果以 珋x ± s表示。
2 结果
2． 1 透射电镜观察地锦草有效部位对红色毛癣菌
超微结构的影响 未经药物处理的红色毛癣菌透射
电镜下观察，菌丝切面的细胞壁完整、厚薄均匀、质
地致密;细胞基质均匀，密度较大，细胞器丰富，胞质
内清晰可见细胞核、线粒体、脂滴等(Fig 1A)。
地锦草有效部位作用后，红色毛癣菌的透射电
镜观察:当以 64 mg·L －1浓度作用后，细胞壁剥脱、
破裂，细胞膜皱缩、破裂，细胞外表面有明显高电子
致密颗粒聚集，细胞肿胀明显，在细胞内可见较多的
泡状结构，已无完整的细胞器结构(Fig 1B)。
Fig 1 SEM results of active component of Euphorbia humifusa and
TERB against Trichophyton rubrum．
TEM(A，50 000 ×)results of Control Trichophyton rubrum;Active
component of Euphorbia humifusa(B，64 mg·L －1，50 000 ×) ;TEM re-
sults of active component of Euphorbia humifusa and TRBF(C，0. 005 mg
·L －1，35 000 ×)
2． 2 HPLC 研究地锦草有效部位对红色毛癣菌麦
角甾醇生物合成的影响
2． 2． 1 方法学 将麦角甾醇标准品准确配制成
0. 93 ～ 29. 75 mg·L －1 6 个浓度的溶液，进样 20 μl，
以色谱峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标进行回
归，回归方程为:^Y = 39004 X + 2422． 3，r = 0. 9998。
精密度和稳定性良好，麦角甾醇的平均回收率均大
于 93%，RSD小于 3%。
2． 2． 2 高效液相色谱图(Fig 2)
2． 3 麦角甾醇含量测定 由 Tab 1 可知，不同浓度
地锦草有效部位处理后，红色毛癣菌中麦角甾醇含
量与其生长对照菌相比，含量明显降低，差异存在显
著性(P ＜ 0. 01) ，并且有明显的剂量依赖性。
Fig 2 Effect of active component of Euphorbia humifusa on ergos-
terol biosynthesis of Trichophyton rubrum
Liquid chromatogram of active component of Euphorbia humifusa and
TRBF against Trichophyton rubrum:① liquid chromatogram of chromato-
gram standard substance;② liquid chromatogram of Trichophyton rubrum
control;③ liquid chromatogram of active component of Euphorbia humifu-
sa against Trichophyton rubrum;④ Liquid chromatogram of TRBF against
Trichophyton rubrum
Tab 1 Contents of ergosterol in the Trichophyton rubrum
mycelium in the groups treated with active component
of Euphorbia humifusa of different doses and TERB(珋x ± s，n = 3)
Group Dose /mg·L －1
Ergosterol concentration
in NSLs /mg·L －1
Growth control 0 34． 84 ± 0． 02
Low dose 32 23． 42 ± 0． 00＊＊
Middle dose 64 10． 04 ± 0． 02＊＊△△
High dose 128 5． 06 ± 0． 05＊＊△△##
Positive control 0． 0025 15． 81 ± 0． 04＊＊
＊＊P ＜ 0. 01 vs control group;△△P ＜ 0. 01 vs low dose group;##P ＜
0. 01 vs middle dose group
3 讨论
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分［8］，它在确
保膜结构的完整性，与膜结合酶的活性，膜的流动
性，细胞活力及物质运输等方面起着重要作用，一旦
麦角甾醇缺乏，必将引起真菌细胞膜功能异常，甚至
发生细胞破裂［9］。麦角甾醇生物合成途径中的几
个关键酶是抗真菌药物的作用靶位，对其生物合成
的研究将为抗真菌药物的筛选及其作用机制的研究
提供重要的理论基础［8，10 － 13］。
地锦草是中医、维吾尔医常用药材，应用广泛。
维吾尔医理论认为，地锦草具有清除异常粘液质、胆
汁液及败血、消肿止痒之功能，维吾尔医常用其复方
百癣夏塔热治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病等
·3611·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2010 Sep;26(9)
疾病。本课题组参照 NCCLS 推荐的 M38-A 方
案［6］，筛选出对临床常见的真菌具有很强的抗菌作
用的有效部位。透射电镜观察发现，地锦草有效部
位作用后真菌细胞壁、细胞膜出现多处破裂，胞内细
胞器损伤严重;HPLC 结果说明地锦草有效部位主
要作用于红色毛癣菌细胞膜麦角甾醇合成通路，抑
制麦角甾醇的生物合成，从而使真菌细胞膜破坏，通
透性增加，内容物外泄，发挥其抗真菌作用。本研究
用中药化学提取分离手段与药理实验密切结合，方
法快速、简单，结果可靠，初步完成了地锦草有效部
位的筛选，为进一步研究其抗真菌作用机制和分离
有效的先导化合物奠定基础。
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Active component of Euphorbia humifusa antifungal activity and mechanism
AN Hui-xia1，Gulnar·DAWUTI2，LI Zhi-jian3，Silafu·AIBAI2，3
(1． School of Pharmacutical Sciences，Shihezi University，Shihezi Xingjiang 832000，China;2． Uighur Medicine Hospital of
Autonomous Region，Urumqi 830049，China;3． Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine，Urumqi 830049，China)
Abstract:Aim To explore the mechanism of active
component of Euphorbia humifusa． Methods The ul-
trastructure of Trichophyton rubrum treated with Eu-
phorbia humifusa active component was observed with
transmission electron microscopy(TEM)． In addition，
the inhibitory effect of Euphorbia humifusa active com-
ponent on ergosterol biosynthesis in cell membrane was
demonstrated by high performance liquid chromatogra-
phy(HPLC)． Results Analysis of treated cells with
TEM showed that the cell wall was disrupted，the thick-
ness of cell wall became uneven and the density of the
cell wall decreased． Also，the cell membrane became
discontinuous and cellular organelles such as mitochon-
dria and endoplasmic reticulum were damaged． Be-
sides，the cytoplasma was aggregated and some high
density electron light areas as well as vacuoles were
formed． In addition，Euphorbia humifusa active compo-
nent inhibited the ergosterol biosynthesis in cell mem-
·4611· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2010 Sep;26(9)
brane of Trichophyton rubrum in a dose-dependent
manner demonstrated with HPLC． Conclusion Active
component of Euphorbia humifusa has marked antifun-
gal activity，and one mechanism of killing fungi in-
volves inhibiting the ergosterol biosynthesis in fungal
cell membrane．
Key words:Euphorbia humifusa;active component;an-
tifungal;trichophyton rubrum;mechanism;ultrastruc-
ture;ergosterol
氯沙坦抑制内质网特有凋亡途径在糖尿病
大鼠肾脏中的保护作用
曹延萍1，王 建2，李 航1，刘青娟1，段惠军1
(1．河北医科大学病理学教研室，河北 石家庄 050017;2．邯郸市第一医院急诊科，河北 邯郸 056002)
中国图书分类号:R-332;R 329． 25;R 587． 1;R 692． 390． 531
文献标识码:A 文章编号:1001 － 1978(2010)09 － 1165 － 04
摘要:目的 探讨血管紧张素 II受体 1 拮抗剂氯沙坦对糖尿
病大鼠肾脏细胞凋亡及内质网应激标志蛋白的影响。方法
单侧肾切除大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病，每日灌胃
给予氯沙坦(40 mg·kg －1)共 8 周。应用免疫组织化学检测
细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、
GRP78 和 Caspase-12 的表达与定位，TUNEL 染色检测细胞
凋亡部位，流式细胞术检测细胞凋亡程度，并对 GRP78、
Caspase-12 表达水平进行半定量分析，同时观察尿蛋白、
BUN、尿肌酐等反映肾功能的相关指标。结果 建模 8 周，
糖尿病组大鼠较对照组肾小球、肾小管凋亡细胞数明显增
多，GRP78、Caspase-12 表达增强。氯沙坦治疗组较糖尿病组
凋亡细胞数减少，GRP78、Caspase-12 表达减弱，但尚未降至
正常水平。3 组间 PCNA 阳性细胞数无差异。结论 氯沙
坦部分通过影响内质网应激特有凋亡途径减少肾脏细胞凋
亡，从而发挥肾脏保护作用。
关键词:糖尿病肾病;血管紧张素Ⅱ受体 1 拮抗剂;氯沙坦;
内质网应激;凋亡;Caspase-12
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)通过血流及非血流动力
学因素，在糖尿病肾病发生发展过程中起重要作用，
氯沙坦为血管紧张素Ⅱ受体 1 拮抗剂(angiotensinⅡ
receptor 1 antagonosm，AT1RA) ，通过阻断 AngⅡ与
其受体结合，具有肾脏保护作用，研究表明［1］氯沙
收稿日期:2010 － 05 － 04，修回日期:2010 － 06 － 08
基金项目:河北省科技厅资助项目(No 09276187)
作者简介:曹延萍(1978 －) ，女，博士生，主治医师，研究方向:肾脏
病理学，Tel:0311-85990228，E-mail:caoyanpingnihao @
163． com
段惠军(1955 －) ，男，博士，教授，博士生导师，研究方向:
肾脏病理学，通讯作者，Tel:0311-86266942，E-mail:duanhj
@ hebmu． edu． cn
坦可以通过影响凋亡相关基因 bax 和 bcl-2 表达而
抑制肾脏细胞凋亡。本研究观察了氯沙坦对糖尿病
大鼠肾脏细胞增殖、凋亡以及内质网应激(endoplas-
mic reticulum stress，ERS)标志蛋白 GRP78 及其特
有的凋亡途径 Caspase-12 表达的影响，探讨这种保
护作用是否部分通过抑制内质网应激特有凋亡途径
实现，以期对其保护肾脏机制得以更深一步的认识。
1 材料与方法
1． 1 材料 Wistar ♂大鼠由河北省实验动物中心
提供。链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma 公
司) ，小鼠抗大鼠 PCNA 单克隆抗体(武汉博士德生
物工程公司) ，兔抗 GRP78 单克隆抗体(NeoMarkers
公司) ，Caspase-12 单克隆抗体(Abcam 生物制品有
限公司) ，TUNEL 试剂盒(Promega 公司) ，科素亚
(杭州默沙东制药有限公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 动物模型及分组 选取体质量 120 ～ 140 g
♂ Wistar大鼠 30 只，所有大鼠均用戊巴比妥钠(40
mg·kg －1)腹腔注射麻醉，行右肾切除术。2 周后大
鼠切口完全愈合。随机分为右肾切除对照组(A 组
n = 10)、糖尿病组(B组 n = 10)和氯沙坦治疗组(C
组 n = 10)。B组和 C组大鼠腹腔单次注射 STZ(65
mg·kg －1WT，用 pH 4. 5，0. 1 mol·L －1枸橼酸钠缓
冲液配制) ，A 组只注射相同体积的枸橼酸钠缓冲
液。48 ～ 72 h后，血糖≥16. 7 mmol·L －1，尿糖 ～
确认为糖尿病模型。C 组每天用氯沙坦按 40 mg
·kg －1灌胃 56 d，A及 B组只灌等量蒸馏水。实验期
间动物自由进饮食，不使用胰岛素及其他降糖药物。
1． 2． 2 标本收集 DM 模型建成后，每周测血糖 1
次，不符合标准者弃去;于成模 8 周称重后用代谢笼
收集 24 h 尿，乙醚麻醉，股动脉取血，分离血清，用
·5611·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2010 Sep;26(9) :1165 ～ 8