全 文 ：Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2012年第16期
仿栗（Sloanea hemsleyana（Ito）Rehd. et Wils）系
杜英科猴欢喜属常绿乔木，生长在海拔500～1400m
的山谷林中，国内主要分布于南亚热带至中亚热带
的湘、鄂、川、滇、黔、桂等地区，国外仅越南等部分东
南亚国家有分布[1-2]。湖南省湘西、湘北地区分布有大
面积的野生仿栗混交林和散生林，目前我国一些地
区已建立了一定规模的仿栗人工林基地，仿栗资源
丰富[3]。仿栗籽是仿栗果实脱壳去假种衣后得到的种
仁，其含油率最高可达58%，可以用来制备生物柴油
原料油和高级食用植物油，脱脂后的籽粕还含有丰
富的蛋白质（约为20%~25%），具有较高的开发和利
用价值[2-3]。目前，国内外关于仿栗的研究主要集中在
对其生物学特性及果实油脂的提取与应用等方面，
尚未见相关仿栗籽蛋白的研究报道[3]。本实验以仿栗
籽粕为研究对象，通过响应面分析法对碱溶酸沉法
提取仿栗籽蛋白的工艺条件进行了优化，以期为仿
栗籽的综合开发利用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
仿栗籽粕 2011年10月初采摘于吉首大学新校
区内，常温脱脂后过60目筛，蛋白质21.27%；牛血清
蛋白标准品、考马斯亮蓝（分析纯） 美国AMRESCO
公司；透析袋（分子截留量8000～14000） 美国Sigma
公司；石油醚、盐酸、氢氧化钾、五水硫酸铜、硫酸钾、
硼酸、硫酸、磷酸等 均为国产分析纯。
CDE-220E2多功能食品处理机 佛山市顺德区
欧科电器有限公司；JA5103N高精度电子天平、721分
光光度计 上海民桥精密科学仪器有限公司；GZX-
9146MBE电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公
司；THZ-82A水浴恒温振荡器 金坛市顺华仪器有
限公司；PHS-25数字式pH计 上海伟业仪器厂；
LXJ-ⅡB飞鸽牌离心机 上海安亭科学仪器厂；
FD5-2.5冻干机 西盟生命技术有限公司；凯氏定氮
收稿日期：2012－01－08 * 通讯联系人
作者简介：黄伟（1986-），男，硕士研究生，研究方向：天然产物化学。
基金项目：湖南省高校创新平台开放基金项目（09K089）；吉首大学校
级科研项目（11JDYO43）。
响应面法优化仿栗籽蛋白提取工艺
黄 伟1，2，麻成金1，2，*，黄 群2，苏 超2，冯 磊2
（1.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首 416000；
2.吉首大学食品科学研究所，湖南吉首 416000）
摘 要：研究了仿栗籽蛋白的碱溶酸沉法提取工艺。 在单因素实验的基础上，选定提取温度、pH、提取时间、液料比四
个因素的三个水平进行中心组合实验，建立了仿栗籽蛋白提取率的二次回归方程，通过响应面分析以及岭嵴分析得
到了优化组合条件。 实验结果表明，当提取工艺条件为pH9.6、温度42℃、时间138min、料液比1∶25（g/mL）时，仿栗籽蛋
白提取率为64.97%。
关键词：仿栗籽蛋白，碱提酸沉，响应面法，提取工艺
Optimization of the extraction technology of protein from
sloanea hemsleyana seed by response surface methodology
HUANG Wei1，2，MA Cheng-jin1，2，*，HUANG Qun2，SU Chao2，FENG Lei2
（1. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization，College of Hunan Province，Jishou University，Jishou
416000，China；
2. Institute of Food Science，Jishou University，Jishou 416000，China）
Abstract：The extraction of protein from the sloanea hemsleyana seed by alkaline extraction and acid precipitation
was studied. According to the single-factor experiments，three levels of the factors（extraction temperature，
extraction time，pH and material/liquid ratio） were selected for the central composite design to establish a
quadric regression equation for describing the yield of sloanea hemsleyana seed protein. By response surface
analysis，the optimum extraction conditions were obtained as follows：extraction temperature of 42℃ ，time of
138min，pH9.6 and material/liquid ratio of 1∶25（g/mL），under which the highest yield of sloanea hemsleyana
seed protein reached 64.97%.
Key words：sloanea hemsleyana seed protein； alkaline extraction and acid precipitation ； response surface
methodology；extraction process
中图分类号：TS255.6 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2012）16-0246-05
246
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.16.084
工 艺 技 术
2012年第16期
Vol . 33 , No . 16 , 2012
编码值
因素
X1 pH X2温度（℃）X3时间（min）X4料液比（g/mL）
-1 9.0 40 90 1∶20
0 9.5 50 120 1∶25
+1 10 60 150 1∶30
表1 Box-Behnken中心组合实验因素水平表
Table 1 Experimental variables and levels for the
Box-Behnken experimental design
装置等。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程 仿栗籽→粉碎→过筛→脱脂→干燥→
仿栗籽粕→碱液浸提→离心分离→上清液→酸沉→离心分
离→透析→干燥→仿栗籽粗蛋白粉
1.2.2 操作要点
1.2.2.1 原料预处理 仿栗籽经干燥粉碎后用环己
烷按1∶7的料液比置于水浴恒温振荡器中常温振荡
脱脂4h，抽滤分离后置于通风厨中12h以挥发残余溶
剂，得仿栗籽粕，过60目筛后于冰箱4℃保存备用。
1.2.2.2 仿栗籽蛋白制备 取一定量仿栗籽粕与去
离子水按一定料液比混合，用1mol/L NaOH调至一定
pH，于一定温度下水浴恒温振荡浸提一段时间，
4500r/min离心20min，分离上清液，用1mol/L的HCl调
至等电点（pH4.5），4000r/min离心15min后分离得到
蛋白凝乳，用去离子水透析48h后，进行真空干燥，即
可得到仿栗籽粗蛋白粉。
1.2.3 蛋白质含量的测定 原料中粗蛋白含量测定
采用半微量凯氏定氮法，参照GB5009.5-2003；上清
液中蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[4]，以牛血清蛋
白为标准，标准曲线如图1所示。
1.2.4 蛋白提取率的计算
蛋白提取率（%）=上清液中蛋白含量
原料中蛋白含量
×100
1.2.5 单因素实验 以蛋白提取率为指标，分别对
pH（8、8.5、9、9.5、10、10.5、11）、提取温度（30、40、50、
60、70℃）、提取时间（30、60、90、120、150、180min）、
液料比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL））
进行单因素实验，每组实验重复3次，结果取其平均
值，探讨各因素变化对仿栗籽蛋白提取率的影响。
1.2.6 中心组合实验 在单因素实验基础上，确定
中心组合实验因素与水平（见表1），以蛋白提取率
为响应值，通过SAS8.1软件对实验结果进行响应面
分析及岭嵴分析，对仿栗籽蛋白提取工艺参数进行
优化[5-7]。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果与分析
2.1.1 pH对蛋白提取率的影响 取5g仿栗籽粕，设
定提取温度50℃、料液比1∶20（g/mL）、提取时间120min，
不同浸提pH对仿栗籽蛋白提取率的影响如图2所示。
由图2可知，在碱性环境中仿栗籽蛋白质提取率
随pH升高不断增大，当pH超过9.5后提取率变化不
大。这是因为碱液使仿栗籽蛋白发生酸式解离而带
负电荷，蛋白质分子间互相排斥，分散性好，对蛋白
质分子有增溶作用，这种增溶作用随着pH的升高而
增大；但pH过高会导致蛋白质分子间发生缩合反应，
生成异味物质和有害物质[8-9]。因此，为保证提取的仿
栗籽蛋白的品质，pH控制在9.5左右为宜。
2.1.2 提取温度对蛋白提取率的影响 取5g仿栗籽
粕，设定浸提pH9.0、料液比1 ∶20（g/mL）、提取时间
120min，不同提取温度对仿栗籽蛋白提取率的影响
如图3所示。
由图3可知，仿栗籽蛋白质提取率随温度升高先
增加后减少，50℃时仿栗籽蛋白提取率最大。这是因
为在较低温范围内随着温度的升高，蛋白质分子的
构象发生轻微改变，分子的立体结构变得伸展，有利
于蛋白质分子和水分子的运动及其相互作用，从而
使蛋白提取率增加；但当温度超过50℃后，维持蛋白
质空间构象的次级键被破坏，引起天然构象的解体，
原来在分子内部的一些疏水基团被暴露到分子表
面，导致蛋白质分子间的相互结合而凝结沉淀，蛋白
提取率降低[10-11]。故提取温度宜控制在50℃左右。
2.1.3 提取时间对蛋白提取率的影响 取5g仿栗籽
粕，设定提取温度50℃、浸提pH 9.0、料液比1∶20g/mL，
不同提取时间对仿栗籽蛋白提取率的影响如图4
所示。
图1 牛血清蛋白标准曲线
Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 20 40 60 80 100
牛血清蛋白浓度（μg/mL）
吸
光
值
A
A=0.0067c+0.0128
R2=0.9987
图2 pH对蛋白提取率的影响
Fig.2 Effect of pH on protein yield
65
60
55
50
45
8 8.5 9 9.5 10 10.5 11
pH
蛋
白
提
取
率
（
%）
图3 温度对蛋白提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on protein yield
62
60
58
56
54
52
30 40 50 60 70
温度（℃）
蛋
白
提
取
率
（
%）
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2012年第16期
变异来源 平方和 自由度 均方 比值F 显著水平p 显著性
X1 4.08 1 4.08 4.67 0.0517
X2 9.51 1 9.51 10.86 0.0064 **
X3 0.54 1 0.54 0.61 0.4483
X4 4.97 1 4.97 5.68 0.0346 *
X12 6.18 1 6.18 7.07 0.0209 *
X22 6.62 1 6.62 7.57 0.0176 *
X32 8.39 1 8.39 9.59 0.0093 **
X42 50.16 1 50.16 57.32 <0.0001 **
X1X2 5.90 1 5.90 6.75 0.0233 *
X1X3 3.17 1 3.17 3.62 0.0813
X1X4 0.12 1 0.12 0.14 0.7148
X2X3 61.15 1 61.15 69.88 <0.0001 **
X2X4 1.37 1 1.37 1.56 0.2349
X3X4 3.50 1 3.50 4.00 0.0688
回归 144.79 14 10.34 11.82 <0.0001 **
剩余 10.50 12 0.88
失拟 10.25 10 1.02 8.05 0.1155 不显著
误差 0.25 2 0.13
总和 155.30 26
R2=0.9324 RAdj2=0.8535
表3 方差分析
Table 3 Variance analysis of results
注：**表示极显著（p＜0.01）；*表示显著（0.01＜p＜0.05）。
实验号 X1 X2 X3 X4 Y（%）
1 -1 -1 0 0 61.79
2 -1 1 0 0 63.09
3 1 -1 0 0 62.67
4 1 1 0 0 59.11
5 0 0 -1 -1 61.92
6 0 0 -1 1 58.78
7 0 0 1 -1 58.42
8 0 0 1 1 59.02
9 -1 0 0 -1 60.3
10 -1 0 0 1 59.42
11 1 0 0 -1 58.77
12 1 0 0 1 57.19
13 0 -1 -1 0 58.02
14 0 -1 1 0 64.93
15 0 1 -1 0 64.28
16 0 1 1 0 55.55
17 -1 0 -1 0 61.54
18 -1 0 1 0 61.03
19 1 0 -1 0 59.69
20 1 0 1 0 62.74
21 0 -1 0 -1 60.82
22 0 -1 0 1 60.63
23 0 1 0 -1 59.34
24 0 1 0 1 56.81
25 0 0 0 0 63.81
26 0 0 0 0 63.58
27 0 0 0 0 63.11
表2 Box-Behnken中心组合实验设计方案及结果
Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and
experimental results
图4 时间对蛋白提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on protein yield
65
60
55
50
45
40
30 60 90 120 150 180
时间（min）
蛋
白
提
取
率
（
%）
从图4可知，在一定条件下，蛋白质的提取率随
着提取时间延长而增大，当浸提时间超过120min后，
蛋白质的溶出基本达到动态平衡 [12]，提取率趋于平
稳，此时，延长提取时间对提取率的影响不大。因此，
综合各种因素，选择提取时间为120min较佳。
2.1.4 料液比对蛋白提取率的影响 取5g仿栗籽粕，
设定提取温度50℃、浸提pH9.0、提取时间120min，不
同料液比对仿栗籽蛋白提取率的影响如图5所示。
从图5可知，仿栗籽蛋白提取率随着料液比的增
大而增加，当料液比超过1∶25后，随料液比的增大，
提取率趋于平稳。这是因为当料液比较低时，溶液的
黏度较大，蛋白质不能充分浸润，分子扩散速率低，
从而影响了传质过程；但料液比过大会增加水的消
耗及后续的浓缩成本，对实际生产意义不大[13-14]。因
此，选择料液比为1∶25较为适宜。
2.2 中心组合实验结果与分析
2.2.1 中心组合实验结果与响应面分析 根据Box-
Benhnken中心组合实验设计原理，依据上述单因素
实验结果，确定pH（X1）、温度（X2）、时间（X3）和料液
比（X4）四个因素水平，以仿栗籽蛋白提取率（Y）为指
标，设计四因素三水平的Box-Benhnken中心组合实
验。实验设计方案及结果见表2，每组实验重复3次，
取其平均值为实验结果。
通过SAS软件的RSREG程序对实验结果进行响
应面分析，经二次回归拟合后求得响应函数，即回归
方程为：
Y=63.5-0.914167X1-0.89X2-0.5425X3-0.643333X4-
0.745833X12-1.279583X22-0.923333X32-3.232083X42-
1.215X1X2+1.8825X1X3-0.175X1X4-3.91X2X3-0.585X2X4+
0.935X3X4
为说明回归方程的有效性及各因素对提取率的
影响程度，对该方程及各因素进行方差分析，结果见
表3。
图5 料液比对蛋白提取率的影响
Fig.5 Effect of material/liquid ratio on protein yield
65
60
55
50
45
40
1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 1∶30 1∶35
料液比（g/mL）
蛋
白
提
取
率
（
%）
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2012年第16期
Vol . 33 , No . 16 , 2012
编码半径r 响应值Y（%） 标准误 X1 X2 X3 X4
0 63.500000 0.540078 0 0 0 0
0.1 63.602355 0.538064 -0.046475 -0.078404 0.001413 -0.041120
0.2 63.676253 0.532162 -0.052307 -0.176242 0.062315 -0.048163
0.3 63.757359 0.522805 -0.026284 -0.262593 0.137207 -0.039089
0.4 63.857149 0.510766 0.004173 -0.340213 0.208435 -0.028161
0.5 63.977631 0.497240 0.035538 -0.414088 0.277458 -0.016893
0.6 64.119387 0.483935 0.067197 -0.486057 0.345257 -0.005526
0.7 64.282651 0.473164 0.098980 -0.5569239 0.412316 0.005877
0.8 64.467538 0.467846 0.130825 -0.627091 0.478897 0.017295
0.9 64.674109 0.471311 0.162703 -0.696788 0.545151 0.028720
1.0 64.902404 0.486820 0.194601 -0.766152 0.611171 0.040147
表5 岭嵴分析
Table 5 Ridge analysis
从表3可知，回归决定系数R2=0.9324，说明响应
值的变化有93.24%来源于所选因素的变化，模型修
正决定系数R2Adj=0.8535，说明该模型能解释85.35%
响应值的变化，回归方程的显著性检验极显著，失拟
性检验不显著，表明方程对实验拟合情况很好，可用
该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。
从方差分析表中各因素的F值可以看出，各因素对仿
栗籽蛋白提取率影响大小顺序为：温度＞料液比＞pH＞
时间，且温度、料液比分别对仿栗籽蛋白提取率的影
响达到了极显著与显著水平。
根据表3的分析结果，作出各显著交互因素的响
应曲面图（图6、图7）。由图6、图7及方差分析可得出，
浸提pH、提取时间与提取温度因素间的交互作用对
仿栗籽蛋白提取率的影响最大，浸提pH与提取温度
的交互作用对仿栗籽蛋白提取率的效应相关性呈山
丘形曲面，它们之间的交互作用达到了显著水平，提
取温度与提取时间的交互作用对仿栗籽蛋白提取率
的效应相关性呈马鞍形曲面，它们之间的交互作用
达到了极显著水平。由图6可知，浸提pH一定时，蛋白
提取率随着温度的升高呈先增加后下降的趋势，且
下降趋势随pH的增加越来越明显，这说明提取温度
升高有利于蛋白提取，但高温容易使蛋白发生变性，
造成提取率下降[15]；由图7可知，当提取温度较低时，
延长提取时间，可获得较高的蛋白提取率，但当提取
温度较高时，延长提取时间，蛋白提取率反而降低，
这可能是因为长时间的高温导致蛋白变性引起的[8]。
2.2.2 典型分析 典型分析结果可以判断方程是否
有极值存在，当特征值均为正值时，响应面分析图为
山谷形曲面，有极小值存在；当特征值为负值时，为
山丘曲面，有极大值存在；当特征值有正有负时，为
马鞍形曲面，无极值存在 [16]。为了确定最佳提取条
件，通过SAS软件对回归方程进行典型分析，结果见
表4。
从表4可以看出，4个因素的特征值有正有负，表
明此二次响应面是鞍面，无极值存在，这与以上响应
面图的直观显示结果是一致的。因此不能直接从二
次响应面上找出最佳工艺参数，需要进一步作岭嵴
分析。
2.2.3 岭嵴分析 岭嵴分析的原理是以原始设计中
心点为球心，r为半径的超球面与响应面的交点形成
的轨迹范围内找出最佳响应值，即最佳工艺条件。岭
嵴分析的结果是对每个坐标从编码零值点开始不断
扩大，半径r可以由实验者自行规定，但不能超出实
验范围[17]。为了便于分析，本文选取r在0、0.1、0.2、…
1.0上计算嵴点。岭嵴分析结果见表5。
从表5可以看出，随着编码半径r的增加，响应值
Y逐渐增大。由此可知，仿栗籽蛋白提取率随pH、料
液比、时间和温度的增加而增大。在本实验的水平范
围内，当r=1.0时，此时的pH9.5973、提取温度42.3385℃、
图6 Y=f（X1，X2）的响应面图
Fig.6 Response surface showing the interactive effects of pH
and extraction temperature on protein yield
63.2
59.2
Y
-0.9
0.9
X2
-0.9
0.9
X1
图7 Y=f（X2，X3）的响应面图
Fig.7 Response surface showing the interactive effects of length
of extraction time and extraction temperature on protein yield
64
58
Y
-0.9
0.9
X3
-0.9
0.9
X2
特征值
特征向量
X1 X2 X3 X4
1.090470 0.319464 -0.679782 0.650223 0.114228
-1.296577 0.940431 0.174447 -0.254624 -0.142564
-3.031477 0.112226 0.584414 0.437402 0.674200
-3.274083 -0.030627 0.407339 0.566617 -0.715599
表4 典型分析表
Table 4 Canonical analysis
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2012年第16期
提取时间138.3351min、料液比1∶25.2007（g/mL），仿栗
籽蛋白的理论提取率为64.9024%，为方便实际操作，
设定最优提取条件为：pH9.6、提取温度42℃、提取时
间138min、料液比1∶25（g/mL），按此优化工艺进行3次
验证实验，得到仿栗籽蛋白实际提取率为64.97%，与
预测值基本一致且高于中心组合实验中的任何一
组。因此，回归拟合模型可较好地预测仿栗籽蛋白
提取率，所得的仿栗籽蛋白提取工艺优化条件是切
实可行的。
3 结论
采用响应面分析法（RSA）研究了碱溶酸沉法提
取仿栗籽蛋白的工艺条件，建立了仿栗籽蛋白提取
率的二次回归方程，其决定系数和修正系数分别为
93.24%和85.35%；在本实验设计范围内，所选因素对
仿栗籽蛋白提取率影响大小顺序为：温度＞料液比＞
pH＞时间，且温度、料液比分别对仿栗籽蛋白提取率
的影响达到了极显著与显著水平，仿栗籽蛋白提取率
与提取温度、pH、提取时间、料液比的二次回归曲面
为鞍面，无极值存在，需要通过岭嵴分析找出最佳提
取工艺条件。岭嵴分析的结果表明，碱溶酸沉法提取
仿栗籽蛋白的最佳工艺条件为：pH9.6、提取温度42℃、
提取时间138min、料液比1∶25（g/mL），在此条件下，仿
栗籽蛋白提取率预测值为64.90%，与验证值64.97%基
本一致，故回归拟合模型能较好地预测仿栗籽蛋白提
取率，所得的工艺优化条件切实可行。本实验首次对
仿栗籽蛋白的提取工艺进行研究，研究结果可为仿
栗籽资源的综合开发利用提供一定的实验依据。
参考文献
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含量分析[J]. 湖南林业科技，2008，35（2）：4-8.
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