全 文 ：白蔹多糖的分离纯化及其对小鼠脾细胞增殖的影响
李 岩，赵 宏，王宇亮，初 维，张 宇* (佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯 154007)
摘要 ［目的］分离纯化白蔹多糖，研究白蔹均一多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。［方法］采用水提醇沉法提取白蔹多糖，通过三氯
乙酸法脱除蛋白，用中空纤维超滤膜和 DEAE Cellulose DE － 52 对白蔹多糖进行分离纯化，高效凝胶过滤色谱法鉴定纯度并测定分子
量，PMP柱前衍生化测定单糖组成，采用 MTT法测定均一多糖对 ConA和 LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。［结果］PAJM － A均
一多糖分子量为 1． 29 ×105 u，由甘露糖(Man)、鼠李糖(Ｒha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xly)组成，其物质
的量比为 1． 36∶ 1． 87∶ 2． 02∶ 1． 58∶ 1． 04，均一多糖对 ConA诱导的 T淋巴细胞和 LPS诱导的 B淋巴细胞有较显著的增殖作用。［结论］PA-
JM － A是一种新的白蔹均一多糖，并与 ConA、LPS 对 T、B淋巴细胞的增殖有协同刺激作用。
关键词 白蔹;多糖;分离纯化;脾淋巴细胞
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2016)17 －137 －04
Separation and Purification of Polysaccharides from Ampelopsis Japonica(Thunb．)Makino and Its Effects on Proliferation Function
of Mice Spleen Lymphocyte
LI Yan，ZHAO Hong，WANG Yu-liang，ZHANG Yu* et al (College of Pharmacy，Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154007)
Abstract ［Objective］To separate and purify polysaccharides from Ampelopsis Japonica (Thunb．)Makino，and to study its effects on prolif-
eration function of mice spleen lymphocyte transformation． ［Method］Hot water extracting and TCA method were employed to isolate the PA-
JM． Hollow fiber ultrafiltration membrane and the DEAE Cellulose 52 were used to separate and purify polysaccharides，and the monosaccha-
ride composition，and structure were preliminarily identified by IＲ and HPLC． Their effects on proliferation function of mice spleen lymphocyte
transformation were determined by MTT． ［Ｒesult］PAJM － A was 1． 29 × 105 u and it was mainly composed of Man，Ｒha，GlcA，Glc，Gal
and Xyl in the molar ratio of 1． 36∶ 1． 87∶ 2． 02∶ 0． 10∶ 1． 58∶ 1． 04． And the homogeneous polysaccharides were able to increase the proliferation
of lymphocytes induced by ConA and LPS． ［Conclusion］PAJM-A is a novel homogeneous polysaccharide，PAJM-A can effectively increase
lymphocyte proliferation and enhance the effect of ConA，LPS-induced T and B cell growth．
Key words Ampelopsis Japonica (Thunb．)Makino;Polysaccharides;Separation and purification;Spleen cell
基金项目 佳木斯大学校级创新团队(CXTD － 2013 － 05) ;佳木斯大学
青年创新人才培养计划(22Zq201501) ;佳木斯大学研究生
科技创新项目(LZZ2015_030)。
作者简介 李岩(1992 － ) ，女，黑龙江宝清人，硕士研究生，研究方向:
天然产物的研究与开发。* 通讯作者，教授，硕士，硕士生
导师，从事天然药物有效成分的分离及结构研究。
收稿日期 2016-05-13
白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹 Ampelopsis Japonica
(Thunb．)Makino的干燥块根［1］，广泛分布于华东、华北、中
南、辽宁、吉林、贵州、广西等地。其味苦、辛、微寒，归心、胃
经，具有清热解毒、消痈散结、敛疮生肌之功效。白蔹中的化
学成分复杂，目前已从中分离获得多糖类［2］、黄酮类［3 －5］、有
机酸类［6］、三萜［7］、甾醇类等成分，临床用于治疗疮痈肿毒、
烧烫伤、癌性发热、支气管扩张咯血、手足皲裂、骨折等［8 －13］。
笔者对白蔹多糖进行分离纯化，并选择小鼠脾淋巴细胞增殖
试验考察其对免疫作用的影响，旨在为研发理想的用于免疫
调节的中药组分奠定理论基础。
1 材料与方法
1． 1 仪器 UV757CＲT紫外可见分光光度计(上海精密科
学仪器有限公司) ;LG10 － 2． 4A型高速离心机(北京京立离
心机有限公司) ;3 500 u透析袋(上海源叶生物科技有限公
司) ;FDU －1200 型真空冷冻干燥机(日本东京理化株式会
社) ;FA2004电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司) ;
TDL －5000B型离心机(上海安亭科学仪器厂) ;Waters － 600
高效液相色谱仪(美国Waters公司) ;Waters － 2424蒸发光检
测器(美国Waters公司) ;BSZ －100自动部分收集器(上海沪
西分析仪器厂) ;FTIＲ －8400S型红外光谱仪(日本岛津有限
公司) ;SW － CJ － 2FD 型净化工作台(苏州安泰空气技术有
限公司) ;680型酶标仪(美国 Bio － Ｒad公司)。
1． 2 试剂 白蔹由安国市万联中药饮片有限公司提供，经
佳木斯大学药学院天然药物化学教研室张宇教授鉴定为葡
萄科蛇葡萄属中药白蔹，鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿
拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸均为 Pharmacia公司
产品，质量分数均 ＞ 99%;DEAE Cellulose 52(Whatman 公
司) ;三氟乙酸(美国 Sigma公司)。
1． 3 方法
1． 3． 1 白蔹多糖的提取与分离纯化。取白蔹干燥块根 1 kg，
用 90%乙醇回流提取 3 次，每次 2 h，弃去提取液，药渣加 8
倍量的水，回流提取 3 次，每次 2 h，合并提取液，过滤浓缩，
加入乙醇醇沉，使乙醇终体积分数为 80%，静置 24 h，抽滤得
沉淀后冷冻干燥得白蔹粗多糖。粗多糖用三氯乙酸法除蛋
白后醇沉，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，得白蔹多糖
PAJM。
称取 PAJM溶液依次过中空纤维超滤膜(150、100、50、
20、10和 6 ku) ，用 DEAE －52(80 cm × 3 cm)进一步分离，用
0 ～1． 0 mol /L NaCl溶液进行洗脱，采用苯酚硫酸法测定吸光
度(A490) ，收集洗脱液，透析，减压浓缩，冷冻干燥，得到均一
多糖 PAJM － A，备用。
1． 3． 2 纯度及分子量测定。采用高效凝胶渗透色谱(HPG-
PC － ELSD)分析:色谱柱为 Ultrahydrogel TM(Linear)水溶性
凝胶柱(7． 8 mm × 300． 0 mm) ，标准葡聚糖(T20、T40、T110、
T500、T2000)配制成2 g /L的标准品溶液，经0． 45 μm微孔滤
膜过滤，以色谱峰的保留时间(Ｒt)为横坐标，lgMw为纵坐标
绘制标准曲线。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2016，44(17):137 － 140 责任编辑 李占东 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.17.045
样品多糖分子量的测定:配制 PAJM － A 2 g /L的溶液，
以三蒸水作为流动相，流速 0． 8 mL /min，柱温 30 ℃。检验其
纯度，通过标准曲线的回归方程得到 PAJM － A的分子量。
1． 3． 3 PAJM － A单糖组成分析。
1． 3． 3． 1 混合单糖对照品溶液的制备。精密称取甘露糖、
鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛
酸、木糖 8种单糖对照品各 10 mg，用双蒸水配成 1 mmol /L
的混合单糖对照品储备液。
1． 3． 3． 2 PAJM － A 的水解。取 PAJM － A 5 mg，加 2 mL
2 mol /L TFA，封管后于 120 ℃水解 160 min，冷却后，将水解
样品溶液加甲醇洗涤反复旋干，加入 700 μL蒸馏水，备用。
1． 3． 3． 3 单糖对照品及 PAJM － A水解产物的衍生化标记。
分别取单糖对照品混合溶液和 PAJM － A 水解产物各
700 μL，加入 0． 5 mol /L重蒸 PMP甲醇溶液 350 μL、0． 3 mol /L
NaOH溶液 350 μL涡旋混匀，于 70 ℃反应 1 h，冷却至室温，
加入 0． 3 mol /L HCl溶液 350 μL进行中和，加 1 mL乙酸异
戊酯萃取 2 次，再加入氯仿 2 mL涡旋混匀，弃去氯仿液，重
复 3次后将水相过 0． 45 μm微孔滤膜供 HPLC进样分析。
1． 3． 3． 4 色谱条件。ZOＲBAX Eclipse XDB － C18柱(250． 0 mm
×4． 6 mm，5 μm)色谱柱:流动相磷酸盐缓冲溶液 －乙腈(83
∶ 17) ，柱温 30 ℃，流速 1． 0 mL /min，检测波长 245 nm，进样量
10 μL［14］。
1． 3． 4 红外光谱分析。取均一多糖 PAJM － A 1 mg 与干燥
的 KBr粉末100 mg混合压片，在红外光谱仪4000 ～400 cm －1
扫描，记录红外光谱图［15］。
1． 3． 5 ConA和 LPS诱导小鼠脾淋巴细胞增殖试验。脾淋
巴细胞悬浮液的制备参照文献［16 －17］，在 96 孔培养板中
每孔依次加入浓度为 1 × 108 个 /mL的小鼠脾细胞悬液 100
μL，除最外圈的空白对照加 100 μL PBS，放入 CO2 培养箱中
37 ℃培养 24 h，剩下的 60孔再加入 ConA和 LPS 20 μL使其
终浓度为 5 μg /mL，每孔加入不同稀释度的多糖溶液(ＲPMI
－1640培养液配制)80 μL，每个稀释度设 6个复孔。放置在
5% CO2 培养箱中 37 ℃培养 48 h。每孔加入 5 g /L的 MTT
溶液10 μL，继续培养4 h，再加入二甲基亚砜100 μL，充分振
荡，于酶标仪上 492 nm处测定吸光度。
1． 4 数据分析 用 SPSS软件对试验数据进行分析，所得数
据以均值 ±方差表示，组间用 t检验进行比较。
2 结果与分析
2． 1 纯度及分子量 经高效凝胶色谱鉴定纯度，色谱峰形
基本上是单一而尖锐，说明多糖中相对分子质量分布较均
一。标准葡聚糖标准曲线方程 Y = － 0． 711 1X + 11． 706(Ｒ2
= 0． 994 6) ，分子量在 20 000 ～ 200 000 u线性关系良好(图
1)。PAJM － A出现对称的单一峰，可判断 PAJM － A为均一
多糖，PAJM － A保留时间(tＲ)为 9． 280 min，分子量(Mw)为
1． 29 ×105 u(图 2)。
2． 2 PAJM －A单糖组成 混合标准单糖对照品经 PMP柱
前衍生后，进行 HPLC 分析后得到 8 种标准单糖的色谱峰，
混合单糖对照品及样品的 HPLC 色谱见图 3。PAJM － A 经
图 1 标准葡聚糖标准曲线
Fig． 1 Standard curve of standard glucan
图 2 PAJM －A的高效液相凝胶渗透色谱图
Fig． 2 High performance liquid gel permeation chromatogram
of PAJM-A
衍生化后通过 HPLC 测定其单糖组成，结果表明，PAJM － A
由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖组成，
物质的量比为 1． 36∶ 1． 87∶ 2． 02∶ 0． 10∶ 1． 58∶ 1． 04。
图 3 对照品(A)和 PAJM －A(B)衍生产物的 HPLC
Fig． 3 HPLC of reference substances (A)and PAJM-A(B)de-
rived products
2． 3 IＲ分析 PAJM － A 的红外光谱图见图 4。由图 4 可
知，在3 500 ～3 300 cm －1有一个强且宽的O －H伸缩振动峰;
次甲基 － CH －的伸缩振动在 3 000 ～ 2 800 cm －1出现一个小
峰，是糖类的特征峰;1 400 ～1 200 cm －1的一组峰则是 C － H
的伸缩振动引起的，在 1 735 cm －1左右无吸收，表明 PAJM －
A不含糖醛酸，在890 cm －1左右有吸收峰，可能为 β －吡喃糖
831 安徽农业科学 2016 年
苷键。
图 4 PAJM －A的红外光谱
Fig． 4 Infrared spectroscopy of PAJM －A
2． 4 PAJM －A对 ConA和 LPS诱导的小鼠脾细胞增殖的
影响 由表 1可知，空白对照组与阳性对照组相比具有极显
著性差异(P ＜0． 01) ，ConA诱导脾细胞增殖，提示造模成功，
药物组与空白对照组相比，各组吸光度均有极显著差异(P ＜
0． 01) ，提示 PAJM － A对 ConA诱导 T细胞增殖具有明显的
促进作用，且在 200 ～ 800 μg /mL 与 ConA 诱导剂有协同作
用，并具有明显的量效关系。
表 1 PAJM －A对 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
Table 1 Effects of PAJM-A on proliferation of mice spleen lymphocyte
induced by ConA
组别
Group
浓度
Concentration
μg /mL
OD
OD value
空白对照组 Blank control group 0 0． 191 ±0． 007
阳性对照组 Positive control group 0 0． 258 ±0． 015＊＊
PAJM － A 800 0． 359 ±0． 019＊＊
400 0． 305 ±0． 008＊＊
200 0． 271 ±0． 014＊＊
注:与空白对照组相比，* 表示差异显著(P ＜0． 05) ，＊＊表示差异极
显著(P ＜0. 01) ，n =6。
Note:Compared with control group，* indicated significant differences(P
＜0． 05) ;＊＊ indicated extremely significant differences (P ＜
0. 01) ，n =6．
由表 2可知，阴性对照组与空白组相比，吸光度明显升
高，且有极著性差异(P ＜0． 01) ，说明 LPS能引起小鼠脾淋巴
细胞体外增殖。药物组与空白对照组相比，各组吸光度均有
极显著差异(P ＜ 0． 01) ，提示 PAJM － A 对 LPS 诱导 B 细胞
增殖有明显的促进作用，且在 200 ～ 800 μg /mL与 LPS 诱导
剂有协同作用，并具有明显的量效关系。
3 结论与讨论
免疫学研究的一个重要方向在于将基础免疫学研究的
成果应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等重要疾病
发病机制的研究、特异性的预防和治疗措施的建立、新型疫
苗的研制和开发等［18］。多糖为单糖组成的天然高分子化合
物，20世纪 60年代后多糖作为广谱免疫促进剂引起人们极
大兴趣，赵武连［19］、张庆等［20］研究发现，多糖对淋巴细胞有
一定的促进增殖作用。脾脏是最大外周免疫器官，是 B淋巴
细胞和 T淋巴细胞的定居场所，T淋巴细胞和 B淋巴细胞是
免疫系统中非常重要的免疫细胞［21］，PAJM － A 能有效促进
脾淋巴细胞的增殖，并与 ConA、LPS对 T、B 淋巴细胞的增殖
有协同刺激作用。
表 2 PAJM －A对 LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
Table 2 Effects of PAJM-A on proliferation of mice spleen lymphocyte
induced by LPS
组别
Group
浓度
Concentration
μg /mL
OD
OD value
空白对照组 Blank control group 0 0． 203 ±0． 055
阳性对照组 Positive control group 0 0． 249 ±0． 080＊＊
PAJM － A 800 0． 453 ±0． 011＊＊
400 0． 327 ±0． 012＊＊
200 0． 304 ±0． 076＊＊
注:与空白对照组相比，* 表示差异显著(P ＜ 0． 05) ，＊＊表示差异极
显著(P ＜0． 01) ，n =6。
Note:Compared with control group，* indicated significant differences(P
＜0． 05) ;＊＊ indicated extremely significant differences (P ＜
0. 01) ，n =6．
该研究首次对中药白蔹中免疫活性成分多糖进行分离
纯化，为进一步分析白蔹多糖的一级结构和高级结构以及今
后研究其构效关系奠定理论基础。高效凝胶渗透色谱法是
目前测定多糖纯度和分子量的常用方法，具有快速、准确、分
辨率高、重现性好、样品量小等优点［22］。白蔹多糖为水溶性
多糖，在提取多糖时需要脱掉脂溶性成分，用无水乙醇和丙
酮洗去杂质和一些色素，可以提高多糖的含量。在对粗多糖
进行分离纯化时，DEAE － 52 的纯化效果较好，经 HPGPC －
ELSD检测后，PAJM － A 呈单一对称峰，说明纯度可达 98%
以上，是均一多糖。该研究采用 PMP 柱前衍生化高效液相
色谱法［23］测定单糖组成，结果表明，PAJM － A的单糖组成均
由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖组成，
其物质的量比为 1. 36∶ 1． 87∶ 2． 02∶ 0． 10∶ 1． 58∶ 1． 04。该研究
结果表明，白蔹含大量的具有显著生物活性的多糖类成分，
这进一步深化了对常用中药白蔹药效物质基础和功效的认
识，为合理开发利用白蔹药材提供理论依据。
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
97 －100．
(上接第 87页)
指数计算公式计算各月的 C值，划分甘肃省每个月旅游的舒
适程度按照标准，结果见表 3。由表 3可知，河西地区的旅游
舒适期在 5、6和 9月，较舒适期在 4、7、8 和 10 月，其他月份
为较不舒适期和不舒适期;河东地区的天水、崆峒和临洮 3
个地区旅游舒适期在 5 ～ 9 月，较舒适期在 4、10 月;玛曲和
合作地区由于海拔较高，合作的舒适期只有 7 月，玛曲没有
舒适期，而合作的较舒适期在 5、6、8、9月，玛曲的较舒适期在 5
～8月，其他月份较不舒适和不舒适期。综合得出，甘肃省除
玛曲和合作地区外，旅游气候适宜性为春夏适宜，旅游舒适期
主要分布在春夏季节，为 4 ～ 9月，冬季受到冷高压控制，天气
比较寒冷，较不舒适期或不舒适期在 11月到次年 3月。
表 3 甘肃省各地区旅游气候舒适度分期
Table 3 Time division of tourism climate suitability in different areas in Gansu province
地区
Area
舒适期
Suitable period
较舒适期
Ｒelatively suitable
period
较不舒适期
Ｒelatively unsuitable
period
不舒适期
Unsuitable
period
舒适期长
Long suitable
period∥月
武威 Wuwei 5、6、9月 4、7、8、10月 3、11月 1、2、12月 7
张掖 Zhangye 5、6、9、10月 4、7、8月 3、11月 1、2、12月 7
酒泉 Jiuquan 5、6、8、9月 4、7、10月 3、11月 1、2、12月 7
敦煌 Dunhuang 4、5、9月 3、6、7、8、10月 11月 1、2、12月 8
永昌 Yongchang 5、6、7、8月 4、9、10月 3、11月 1、2、12月 7
兰州 Lanzhou 5、6、9月 3、4、7、8、10月 1、2、11、12月 8
天水 Tianshui 4、5、6、9月 7、8、10月 3、12月 1、2月 7
崆峒 Kongtong 5、6、7、8、9月 4、10月 3、11月 1、2、12月 7
西峰 Xifeng 5、6、7、8、9月 4、10月 3、11月 1、2、12月 7
临洮 Lintao 5、6、7、8、9、10、11月 4月 3月 1、2、12月 8
玛曲 Maqu 5、6、7、8月 4、9、10月 1、2、3、11、12月 4
合作 Hezuo 7月 5、6、8、9月 3、4、10、11月 1、2、12月 5
5 结论
通过温湿指数、风寒指数和着衣指数分析甘肃省旅游气
候资源适宜性，得出以下结论:①春季最适宜旅游的地区是
天水和敦煌地区，夏季最适宜旅游的地区是临洮和永昌地
区，秋季最适宜旅游的地区是天水和临洮地区，冬季最适宜
旅游的地区是兰州和天水。敦煌、兰州和临洮的旅游舒适期
最长，为 8个月。②甘肃省旅游区最佳旅游期为 4 ～ 10 月，
7 ～8月平均温度为 20 ℃左右，11 月到次年 2 月气温较低。
加上甘肃省具有独特的自然景观，历史遗产也很多，旅游业
发展优势很强。
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041 安徽农业科学 2016 年