全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 11期，第 2604-2609页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.11, 2604-2609
技术主题
Technology Feature
红毛丹 SRAP反应体系优化及多态性标记筛选
林兴娥 1 周兆禧 1 葛宇 1 臧小平 1 肖正新 2 尹俊梅 3 马蔚红 1*
1中国热带农业科学院海口实验站,海口, 570102; 2保亭黎族苗族自治县国营农场管理局,保亭, 572300; 3中国热带农业科学院热带作物品种
资源研究所,儋州, 571737
*通讯作者, zjwhma@163.com
摘 要 为建立成熟可靠的红毛丹 SRAP-PCR扩增检测技术体系，本研究首先采用单因素实验设计，对反应
体系中的 DNA模板、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物浓度等 5个主要影响因素，设置不同的水平梯度，
筛选出适宜的因子范围；在此基础上，进一步采用 L16(45)正交设计，建立了红毛丹 SRAP-PCR最佳反应体系：
20 μL体系中包含 DNA模板 20 ng、dNTPs 0.25 mmol/L、引物 0.6 μmol/L、rTaq酶 1.0 U、Mg2+ 2.5 mmol/L。并
利用优化的反应体系，从 116对 SRAP引物组合中筛选出 37对扩增条带清晰、产物多态性较好的引物。本研
究建立的 SRAP-PCR体系及筛选的引物，将为红毛丹从分子水平进行种质资源遗传多样性分析、品种指纹图
谱构建等研究提供基础。
关键词 红毛丹, SRAP, PCR
Optimization of SRAP-PCR System and Primers Screening for Rambutan
(Nephelium lappaceum L.)
Lin Xinge 1 Zhou Zhaoxi 1 Ge Yu 1 Zang Xiaoping 1 Xiao Zhengxin 2 Yin Junmei 3 Ma Weihong 1*
1 Institute of Banana and Plantain, CATAS, Haikou, 570102; 2 Bureau of State Farm, Baoting, 572300; 3 Tropical Crops Genetic Resources Insti-
tute, CATAS, Danzhou, 571737
* Corresponding author, zjwhma@163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.002604
Abstract To establish a stability and reliable SRAP system for rambutan (Nephelium lappaceum L.), in this
study, the PCR procedure was firstly evaluated by using a single-factor experiment, which involved various
concentration levels of DNA template, Mg2 + , dNTPs, Taq DNA polymerase and primers. Based on the initial
results, another assay with orthogonal design of L16(45) was carried out, and eventually brought about an optimized
system for rambutan as follows: a volume of 20 μL reaction mixture containing 20 ng genome DNA, 0.25 mmol/L
dNTP mixture, 0.60 μmol/L each primer, 1.0 U rTaq DNA polymerase and 2.5 mmol/L Mg2+. And then, 37 primer
pairs were screened out from 116 SRAP combinations based on their stable amplification, clear banding patterns
and good polymorphism. In all, both the optimized SRAP-PCR reaction system and selected primers will facilitate
the researches of genetic diversity and mapping in rambutan.
Keywords Rambutan (Nephelium lappaceum L.), SRAP, PCR
基金项目：本研究由海南省自然科学基金项目(20153062)和南亚热带作物研究所基本科研业务费专项(1630062014018)共同资助
红毛丹 (Nephelium lappaceum . L)为无患子科
(Sapindaceae)韶子属(Nephelium)植物，是广受消费者
喜爱的热带珍稀水果，果实外观独特，果肉富含磷、
镁、硫、钙、锌、铁和锰，果壳和种仁含抗氧化和抗菌
活性成分，具有极高的食用和药用价值(Ragasa et al.,
2005; 陈嘉曦等 , 2007; Palanisamy et al., 2008; Ra-
jasekaran et al., 2013)。红毛丹原产于马来西亚和印度
尼西亚，现广泛分布于东南亚、中美洲等热带地区
(Wall, 2006)，被联合国粮农组织列为优先推广的“四
大热带水果”之一。中国于 20世纪 60年代早期从马
来西亚和泰国引种，试种于海南保亭；1990年开始规
模化生产推广。近年来，尽管国内外市场对红毛丹需
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
求剧增，但因受其物种生态习性的制约，对温度、湿
度、土壤等生长条件要求苛刻，加上管理技术不成
熟、部分品种产量和商品性低等影响，生产规模仍然
较小，目前主要在中国海南东南部、云南西双版纳和
台湾屏东等少数地区种植。因此，针对性地开展本土
化育种是红毛丹产业规模化可持续发展的迫切需求。
对广泛收集的种质资源进行评价鉴定，是生产
应用、品种保护和新品种培育的重要基础性工作。长
期以来，对红毛丹的资源评价以株型、叶型、果型等
形态及果实品质特征为主(Whitehead, 1959；Andrade
et al., 2008, Andrade et al., 2009; Barreto et al., 2015)。
表型评价受环境影响大、周期长、灵敏度低，且随着
新品种和无性系变异的不断出现，以及品种传播过
程中伴随的重复命名等现象，表型特征已经不足以
实现品种鉴定和血缘分析。以 PCR扩增为基础的分
子标记技术，因具有不受环境影响、多态性高、数量
多等优点，被逐渐应用于红毛丹资源评价中。Chew
等(2005)利用 6个 RAPD标记，对马来西亚农业发展
研究院(MARDI)保存的 221份红毛丹种质进行分析，
显示具有丰富的遗传多样性，不同种质遗传相似性
系数范围为 0.232~0.900，平均 0.444；De Andrade 等
(2012)采用 AFLP标记，对巴西圣保罗地区果园收集
保存的 18个实生苗品系进行检测，显示不同品系之
间存在遗传差异，和表型及生化分析结果一致，表明
种子不适合用于商业化种苗繁殖。另外，Sakuan-
rungsirikul等(2005)采用 ISSR分子标记，对泰国的红
毛丹栽培品种进行了遗传多样性评价。我国引种红
毛丹的历史已经超过 50年，但由于缺乏系统性的资
源与育种基础研究，种质来源及系谱难以考据，因
此，借助分子标记技术，探明我国现有资源的遗传基
础和多样性水平，对红毛丹重要性状遗传与分子形
成机制等基础研究，以及制定有效的育种计划、开展
自主新品种选育非常重要。
SRAP (Sequence-related amplified polymorphis)是
近年来发展的一种基于 PCR的分子标记技术，该标
记针对基因的开放阅读框(open reading frames, ORFs)
进行扩增，由于不同个体的内含子、启动子与间隔区
长度不等而产生多态性(Li and Quiros, 2001)。相对于
其他标记，该标记具有多态性高、重复性好、简单高
效、适用性强等特点，作为遗传学分析工具，在多种
作物的种质资源遗传多样性分析、资源鉴定、图谱构
建、分子标记辅助选择育种等方面广泛应用，在荔枝
(刘忠, 2013)、龙眼(张立杰等, 2015)、芒果(应东山等,
2014)、梨(王文魁等, 2014)、苹果(司鹏等, 2010)等重
要果树作物上已经广泛应用，但该技术在红毛丹研
究中的应用尚无报道。本研究拟通过单因素分析和
正交试验设计的方法，对 SRAP反应体系中各组分
(DNA模板量、引物浓度、Mg2+、dNTPs和 Taq DNA
聚合酶)进行优化，以期建立适合于红毛丹基因组
SRAP-PCR 扩增的反应体系，并利用优化后的
SRAP-PCR体系进行引物筛选，旨在为今后开展红
毛丹种质遗传多样性评价、指纹图谱构建、遗传育种
改良等研究提供技术支持。
1结果与分析
1.1 DNA模板纯度分析
各取 6 μL红毛丹 DNA样品加入 2 μL 6× DNA
Loading Buffer进行电泳检测。各个样品 DNA主条
带清晰(图 1)，且无降解现象，无 RNA污染，可用于
后续实验。
图 1 DNA琼脂糖电泳结果
注: M: Marker3; 1~14:各样品 DNA
Figure 1 Result of genomic DNA electrophoresis
Note: M: Marker3; 1~14: Refers to DNA samples
1.2单因子实验实验结果
1.2.1模板 DNA对 SRAP扩增效果的影响
实验通过设计 4个样本DNA浓度梯度(20~35ng)，
比较不同 DNA模板量对 PCR扩增的影响(图 2)。4个
DNA浓度梯度内均能扩出条带(图 2)，但当模板用量
为 20 ng和 30 ng时扩增条带较少，亮度较弱，当模
板浓度为 25 ng时，扩增条带清晰且条带丰富。因此，
确定 25 ng为最优 DNA模板量。
1.2.2不同Mg2+浓度对 SRAP扩增效果的影响
当 Mg2+浓度为 1.5~2.5 mmol/L时(图 2)，扩增条
带模糊，且部分条带有缺失，Mg2+浓度为 3.0 mmol/L
时，扩增条带明显增多，且条带清晰，特异性强，因
此，适宜的Mg2+浓度为 3.0 mmol/L。
1.2.3不同 dNTPs浓度对 SRAP扩增效果的影响
在 4个 dNTPs浓度范围内(图 2)，均有扩增条带，
且扩增结果较一致，差异不明显，浓度大时带型较
2605
亮，当 dNTPs浓度为 0.30 mmol/L时，扩增条带亮且
清晰，从节约成本角度考虑，dNTPs 浓度选择为
0.25 mmol/L为宜。
1.2.4引物浓度对 SRAP扩增效果的影响
当引物浓度为 0.6~0.8 μmol/L时(图 2)，扩增条
带模糊，当引物浓度为 0.2~0.4 μmol/L时，扩增条带
清晰、亮度好且条带丰富，当引物浓度为 0.4 μmol/L
时，扩增条带更亮，稳定性更好。因此，引物浓度为
0.4 μmol/L时为最佳反应水平。
1.2.5不同 Taq DNA聚合酶用量对 SRAP扩增效果
的影响
随着 Taq DNA聚合酶用量的增加(图 2)，扩增条
带逐渐增多，当 TaqDNA聚合酶用量为 1.0~1.2 U时，
条带均较多，但 1.2 U时条带亮度更佳。因此，以 1.2 U
为 Taq DNA聚合酶的最佳反应用量。
1.3红毛丹 SRAP-PCR反应体系的正交优化
采用正交实验设计 L16(45)对红毛丹 SRAP-PCR
反应体系的 5个因素(模板 DNA,引物, Mg2+, dNTPs
和 Taq聚合酶浓度) 在 4个水平上进行优化实验，选
取 Me7/Em6作为扩增引物，每个处理 3次重复，得
正交设计优化结果(图 3)。
各处理由于模板 DNA、引物、Mg2+、dNTPs和 Taq
DNA聚合酶浓度组合的不同(图 3)，扩增结果存在着
明显的差异。其中处理 1、6、8、15、16扩增条带弥散，
处理 4、5、9、10、11、12、13、14扩增条带少，丰富度不
够，条带较暗。处理 2扩增条带清晰度较高、特异性
条带和非特异性条带差异明显，但较处理 3和处理 7
特异性条带少；处理 7条带清晰度较差；在后续实验
操作过程中，处理 3的扩增条带在 6%聚丙烯酰胺凝
胶电泳上条带清晰度更好。因此，确定处理 3为最佳
反应体系，即 20 μL体系中包含 DNA模板 20 ng、
dNTPs 0.25 mmol/L、引物 0.6 μmol/L、rTaq酶 1.0 U、
Mg2+ 2.5 mmol/L，ddH2O补足 20 μL。
1.4优化反应体系的验证和引物筛选
以 9个红毛丹品系 DNA为模板，利用Me6/EM9
引物组合对优化后的反应体系的稳定性进行检测
(图4)，扩增结果表明，条带清晰且条带多态性丰富，
由此表明该反应体系是最适于红毛丹的 SRAP-PCR
反应体系。利用该反应体系对 116对引物组合进行
筛选，共筛选出 37对扩增条带清晰、多态性较好的
引物，具体如下：Me1/Em9、Me2/Em4、Me3/Em2、
Me3/Em3、Me3/Em4、Me3/Em7、Me3/Em9、Me4/Em5、
Me4/Em7、Me4/Em8、Me4/Em9、Me5/Em3、Me6/Em4、
Me6/Em9、Me7/Em5、Me7/Em6、Me7/Em7、Me7/Em8、
Me7/Em9、Me8/Em1、Me2/Em4、Me8/Em8、Me8/Em9、
Me9/Em1、Me9/Em3、Me9/Em4、Me9/Em5、Me9/Em6、
图 2 20 μL反应体系中各组分浓度对 SRAP-PCR反应的影响
注: M: DL2000 DNAMarker; 1~4: DNA模板浓度(20~35 ng); 5~8: Mg2+浓度(1.5~3.0 mmol/L); 9~12: dNTPs浓度(0.15~0.30 mmol/L);
13~16:引物浓度(0.2~0.8 μmmol/L); 17~20: Taq DNA聚合酶浓度(0.6~1.2 U)
Figure 2 Effect of each factor concentrations of SRAP-PCR patterns in 20 μL reaction system.
Note: M: DL2000 DNA Marker; 1~4: DNA templates concentration (20~35 ng); 5~8: Mg2+ concentration (1.5~3.0 mmol/L); 9~12:
dNTPs concentration (0.15~0.30 mmol/L); 13~16: primer concentration (0.2~0.8 μmmol/L); 17~20: Taq DNA polymerase concen-
tration (0.6~1.2 U)
图 3正交实验设计 L16(45)得到的各处理扩增结果(引物Me7/Em6)
注: M: DL2000DNAmarker; 1~16:分别代表各处理组合(表 2),每个处理 3次重复
Figure 3 Amplification result of each treatment based on the orthogonal design diagram L16(45)
Note: M: DL2000 DNAmarker; 1~16: Refer to the treatments listed in table 2
红毛丹 SRAP反应体系优化及多态性标记筛选
Optimization of SRAP-PCR System and Primers Screening for Rambutan (Nephelium lappaceum L.)
2606
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
Me9/Em7、Me9/Em8、Me9/Em10、Me10/Em1、Me10/
Em3、Me10/Em4、Me10/Em5、Me10/Em9。
2讨论
SRAP作为功能性分子标记，在分子标记辅助育
种中具有广阔的应用前景，目前在果树种质资源研
究中正在逐步应用。由于受反应条件、扩增程序及物
种不同的影响，体系建立存在一定的复杂性，因此，
需要对不同的试材及实验条件进行优化，从而保证
标记分析的稳定性和可靠性。本研究首先通过单因
素实验设计对各影响因素进行单因素多水平的研
究，明确各因子的最佳用量，但由于单因素实验不能
兼顾各因素间的交互作用，因此再通过正交实验设
计对体系进行进一步优化，从而确定适合红毛丹
SRAP-PCR的最佳反应体系。
本研究单因素实验结果表明，模板 DNA浓度、
Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和 rTaq酶用量等对
SRAP-PCR反应均有一定的影响，影响大小顺序为
Mg2+>Taq DNA聚合酶>引物>DNA模板>dNTPs，其
中Mg2+浓度对红毛丹 SRAP-PCR反应影响最大，这
是由于 Mg2+浓度不仅直接影响酶活性，而且还对引
物的退火、扩增产物的特异性、引物二聚体等有影
响，Mg2+浓度过高会降低反应的特异性，增加非特异
扩增产物，浓度过低会导致 Taq DNA聚合酶的活性
显著降低，减少反应产物；其次是 Taq DNA聚合酶，
Taq DNA聚合酶用量过低会导致 PCR反应不完全，
用量过多会使非特异性产物增加；dNTPs是 PCR扩
增反应的底物，dNTPs浓度过高会竞争 Mg2+，造成
Taq DNA聚合酶活性下降，还会增大错误扩增的几
率，出现非特异扩增产物和弥散，浓度过低会减少扩
增产物，本研究结果中 dNTPs浓度对反应体系影响
最小，单因素实验和正交实验筛选出的最佳浓度相
图 4引物Me6/EM9对 9个红毛丹品系DNA的 SRAP扩增带型
注: M: Marker3
Figure 4 SRAP profiles amplified among 9 rambutanstrains with-
primers Me6/Em9
Note: M: Marker3
同，均为 0.25 mmol/L。
本研究通过实验优化得到红毛丹 SRAP-PCR的
最佳反应体系为：DNA模板 20ng、dNTPs0.25mmol/L、
引物 0.6 μmol/L、rTaq 酶 1.0 U、Mg2+ 2.5 mmol/L，总
体积 20 μL，扩增结果稳定可靠，条带清晰，特异性
好，并利用该体系筛选出的 37对扩增条带清晰、多
态性较好的 SRAP引物组合。获得的 SRAP-PCR扩
增反应体系及多态性引物，为红毛丹从分子水平进
行种质资源遗传多样性分析、品种指纹图谱构建等
研究奠定了基础。
3材料与方法
3.1材料
试验所用红毛丹材料均采自保亭热带作物研究
所红毛丹种质资源圃，编号 23为优化所用品系，栽
培品系保研 2号、保研 5号和编号 60为多态性筛选
品系，采取枝条上无病虫害的叶片，-80℃保存备用。
3.2红毛丹总 DNA的提取及质量检测
采用改良 2×CTAB法(林兴娥等, 2015)提取红毛
丹叶片基因组 DNA，用紫外分光光度法和琼脂糖凝
胶电泳法检测样品 DNA质量及完整性，根据检测结
果，将总DNA稀释至 20 ng/μL后，-20℃保存待用。
3.3 SRAP-PCR反应条件
SRAP-PCR 扩增程序为：95℃预变性 5 min，
94℃变性 1 min，35℃复性 1 min，72℃延伸 70 s，5个
循环；94℃变性 1 min，50℃复性 1 min，72℃延伸 70 s，
35 个循环，72℃延伸 5 min，4℃保存。PCR 产物用
1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，经 GoldView染色
后在 Tanon-4100凝胶成像分析系统上采集图像。
3.4 SRAP-PCR 反应体系的优化
参照荔枝(昝逢刚等, 2009)、龙眼等(姜帆等, 2007)
的 SRAP-PCR反应体系和反应条件，采用引物组合
Me7/Em6对红毛丹 SRAP-PCR扩增反应体系进行优
化。原初反应体系定为 20 μL，内含 10×Buffer 2μL,
25 ng DNA，2.0 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，
0.4 mmol/L primer，0.8 U Taq酶，灭菌 ddH2O补足至
20 μL。先采用单因素实验设计对 SRAP-PCR反应体
系中的 Mg2+、Primer、rTaq DNA聚合酶、dNTPs、DNA
浓度进行 5因素 4水平实验，各因素的浓度梯度见
表 1，3次重复。再采用 L16(45)正交试验设计，对 SRAP-
PCR 反应体系中的 Mg2+、Primer、Taq DNA 聚合酶、
2607
dNTPs、DNA浓度进行 5因素 4水平 16个组合的筛
选分析(表 2)。
3.5反应体系稳定性的检测及引物筛选
利用优化的红毛丹 SRAP反应体系，在 3份果
皮颜色差异大的红毛丹材料进行 PCR 扩增以筛选
出多态性好、扩增条带清晰稳定的引物。参考文献报
道的 SRAP引物序列(Li and Quiros, 2001) (表 3)，由上
海生物工程有限公司合成。
致谢
本研究由海南省自然科学基金项目(20153062)
和南亚热带作物研究所基本科研业务费专项(16300-
62014018)共同资助。
作者贡献
林兴娥和马蔚红负责设计实验方案和数据分析；
周兆禧和葛宇参与数据分析讨论；臧小平、肖正新和
尹俊梅参与材料准备和样品制备，林兴娥负责实验操
表 1 SRAP-PCR扩增影响因子的梯度实验
Table 1 Gradient experiment of factors influencing SRAP-PCR
水平
Level
1
2
3
4
A
20
25
30
35
B
0.15
0.20
0.25
0.30
C
0.2
0.4
0.6
0.8
D
1.5
2.0
2.5
3.0
E
0.6
0.8
1.0
1.2
表 2 SRAP-PCR正交试验设计表
Table 2 Orthogonal design to SRAP-PCR system [L16(45)]
处理组合
Combinations
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
B
20
20
20
20
25
25
25
25
30
30
30
30
35
35
35
35
A
0.15
0.20
0.25
0.30
0.15
0.20
0.25
0.30
0.15
0.20
0.25
0.30
0.15
0.20
0.25
0.30
C
0.2
0.4
0.6
0.8
0.4
0.2
0.8
0.6
0.6
0.8
0.2
0.4
0.8
0.6
0.4
0.2
D
1.5
2.0
2.5
3.0
2.5
3.0
1.5
2.0
3.0
2.5
2.0
1.5
2.0
1.5
3.0
2.5
E
0.6
0.8
1.0
1.2
1.2
1.0
0.8
0.6
0.8
0.6
1.2
1.0
1.0
1.2
0.6
0.8
因素
Factor
表 3红毛丹 SRAP-PCR体系优化所用引物序列
Table 3 Primer sequences used in optimization of SRAP reaction
编号
Code No.
Me1
Me2
Me3
Me4
Me5
Me6
Me7
Me8
Me9
Me10
正向引物(5-3)
Forward primers (5-3)
TGAGTCCAAACCGGATA
TGAGTCCAAACCGGAGC
TGAGTCCAAACCGGAGT
TGAGTCCAAACCGGATT
TGAGTCCAAACCGGAAG
TGAGTCCAAACCGGTAA
TGAGTCCAAACCGGACT
TGAGTCCAAACCGGATG
TGAGTCCAAACCGGACA
TGAGTCCAAACCGGGAT
编号
Code No.
Em1
Em2
Em3
Em4
Em5
Em6
Em7
Em8
Em9
Em10
反向引物(5-3)
Reverse primers (5-3)
GACTGCGTACGAATTAAT
GACTGCGTACGAATTTGC
GACTGCGTACGAATTGAC
GACTGCGTACGAATTTGA
GACTGCGTACGAATTAAC
GACTGCGTACGAATTGCA
GACTGCGTACGAATTCAG
GACTGCGTACGAATTCTG
GACTGCGTACGAATTTCA
GACTGCGTACGAATTATG
红毛丹 SRAP反应体系优化及多态性标记筛选
Optimization of SRAP-PCR System and Primers Screening for Rambutan (Nephelium lappaceum L.)
注: A:脱氧核苷酸 (mmol/L); B: DNA模板(ng); C:引物(μmol/L);
D: Mg2+ (mmol/L); E: Taq聚合酶(U)
Note: A: dNTPs (mmol/L); B: DNA template (ng); C: Primer
(μmol/L); D: Mg2+ (mmol/L); E: Taq DNA polymerase (U)
作和论文撰写。全体作者都阅读并同意最终版本。
参考文献
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Andrade R.A.D., Lemos E.G.D.M., Martins A.B.G., and Paula R.
C.D., 2009, Morphological characterization of rambutan
plants, Acta Scientiarum. Agronomy, 31(4): 613-619
注: A: DNA 模板(ng); B: 脱氧核苷酸 (mmol/L); C: 引物
(μmol/L); D: Mg2+ (mmol/L); E: Taq聚合酶(U)
Note:B:DNA template (ng); dNTPs (mmol/L); ;C: Primer (μmol/L);
D: Mg2+ (mmol/L); E: Taq DNA polymerase (U)
2608
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
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