全 文 ：书交让木内生真菌的分离和抑菌活性的研究
苏香萍，汪 洋，霍丽丽，涂 璇 (三峡大学化学与生命科学学院，湖北宜昌 443002)
摘要 ［目的］分离交让木中的内生真菌，并研究其抗菌活性。［方法］先采用尖端菌丝挑取法分离纯化交让木的内生真菌，然后依据
《微生物分类学》和形态观察初步鉴定其内生真菌，最后用牛津杯法对内生真菌发酵液进行抑菌试验。［结果］从交让木的茎和叶组织
部位分离得到 8株内生真菌，初步鉴定为半知亚菌门得丝核菌属 1种，头孢霉属 2 种，木霉属 1种，青霉属 2 种，及接合菌纲的毛霉属 1
种，根霉属 1种。其中 JＲ0203菌株代谢产物有较强的抑菌活性。［结论］交让木内生真菌有一定的抑菌活性，值得进一步研究。
关键词 交让木( Daphniphyllum macropodum) ; 内生真菌;分离;发酵;抑菌试验
中图分类号 S792． 24 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2013) 03 －01041 －03
Isolation of Endophytic Fungi in Daphniphyllum macropodum and Their Antimicrobial Activities
SU Xiang-ping et al ( College of Chemistry and Life Science，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443002)
Abstract ［Objective］To isolate the endophytic fungi in Daphniphyllum macropodum and to study their antimicrobial activities． ［Method］
Firstly，endophytic fungi from D． macropodum were isolated by hyphal tip picking method． Then，according to microbial taxonomy and mor-
phology method，the endophytic fungi were identified． Lastly，antimicrobial experiments of endophytic fungi were carried out with Oxford cup
assay． ［Ｒesult］8 different endophytic fungi were obtained from the leaves and the stalks samples of D． macropodum． 2 species Ｒhizoctonia
DC of Deuteromycotina，1 species of Cephalosporium，1 species of Trichoderma，2 species of Penicillium，1 species of Mucor and 1 species of
Ｒhizopus were identified respectively． Among them，JＲ0203 strain metabolites with strong antibacterial activity were found． ［Conclusion］The
endophytic fungi from D． macropodum had certain antimicrobial activities，which needed to be further studied．
Key words Daphniphyllum macropodum; Endophytic fungi; Isolation; Fermentation; Antimicrobial activities
基金项目 国家自然科学基金( No． 31070313) ;楚天学者科研启动基金
( KJ2009B001 ) ; 宜昌市科学技术研究与开发项目 ( No．
A2011-302-23) 。
作者简介 苏香萍( 1978 － ) ，女，湖北当阳人，讲师，硕士，从事微生物
菌种选育和中药提取相关教学科研工作，E-mail: xiangpingsu
@ ctgu． edu． cn。
收稿日期 2012-09-07
交让木(Daphniphyllum macropodum)为虎皮楠科(Daph-
niphyllaceae)虎皮楠属(Daphniphyllum)植物，又名画眉珠、虎
皮楠、山黄树(湖北)、豆腐头(广东)、枸色子、枸血子和水红
朴(四川)等。交让木为常绿乔木，分布于长江流域以南、云
南、四川、贵州、广西、广东、湖南、湖北、江西、浙江、安徽及台
湾等省区［1］。其果实、叶和根在民间多作药用。树皮灰白
色，平滑;枝粗壮，小枝灰绿色，无毛，疏生椭圆形皮孔。交让
木具有治疗疮疖肿毒、哮喘、咳嗽、风湿、炎症、感冒发热、肝
脾肿大、骨折和毒蛇咬伤之功效，具有良好的药用价值［2］。
内生真菌是普遍存在于健康植物组织中，形成不明显浸
染的一类真菌。这类真菌生长在植物体的特殊生境中，不但
对促进宿主植物的生长发育、增强抗逆性起着重要作用，而
且能产生许多活性物质，包括一些结构新颖的化合物［3 －4］。
近十几年来，人们已在药用植物内生真菌的次级代谢产物中
陆续发现了紫杉醇等生物活性物质，使得药用植物内生真菌
的研究受到广泛关注。药用植物中蕴含着丰富的内生真菌
资源，次生代谢产物极为丰富，具有多种生物活性，其中某些
产物与宿主的次级代谢产物相同或相似(真菌与植物之间的
共进化作用或基因转移作用使两者可能存在相同的代谢途
径) ，而有些产物对宿主体内某些活性成分的形成有重要影
响。因此，利用药用植物内生真菌开发新药源具有极大的可
能性［5 －6］。目前，国内外关于交让木的研究主要集中在栽培
和细胞培养方面，而关于其内生细菌的研究鲜有报道。笔者
对分布于三峡地区丘陵地带植物交让木进行内生真菌进行
分离筛选，并对分离筛选的菌株抗菌活性进行初步研究，以
期为交让木植物内生真菌资源的进一步开发利用提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。交让木(Daphniphyllum macropodum)的茎
和叶，均采自三峡地区丘陵地带。
1． 1． 2 供试细菌。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ，
大肠杆菌(Escherichia coli) ，绿脓杆菌(Pseudomonas aerugino-
sa)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ，均由实验室培养。
1． 1． 3 主要试剂。PDA固体、液体培养基，实验室自制。
1． 2 方法
1． 2． 1 PDA培养基的制备。称取 200． 00 g 马铃薯，洗净去
皮切碎，加水煮沸约 30 min，用 2层纱布过滤去渣，再加入蔗
糖和琼脂，用蒸馏水定容至 1 000 ml，pH自然，于 1 × 105 Pa
灭菌 30 min，即得。
1． 2． 2 内生真菌的分离纯化。挑选出健康完整的老叶、老
茎，先用水洗净，然后在浓度 75%的酒精中浸泡 2 ～3 min，用
无菌水冲洗 3 次，继续放入浓度 3%的次氯酸钠溶液浸泡
3 ～5 min，然后用无菌水冲洗 3次，再用无菌滤纸吸干表面水
分。用无菌的手术刀将叶片切成 2 mm × 5 mm的小块，茎先
削去表皮再切成 2 mm ×5 mm长的小块(手术刀和镊子用完
一次要消毒 2 ～3 min)。将处理好的交让木各组织片分别接
入加有抑菌剂的平板培养基中，培养并观察结果。将长出的
菌落的菌丝挑出用划线法接入未加抑菌剂的平板中纯化并
标记，挑完后把菌落抹去待再次长出真菌重复再挑 1次。将
挑出的菌落反复转接纯化，直至得到纯化的菌落为止［7］。
1． 2． 3 内生真菌的初步鉴定。把分离纯化出的真菌在平皿
固体培养基上以点接法接入三点菌丝，呈三角排列，培养 2 ～
3 d后以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约 45°插入培
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(3):1041 － 1043 责任编辑 石金友 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.03.083
养基内(插在菌落边缘上) ，使真菌菌丝沿着培养基表面与盖
玻片的交接处生长而附着在盖玻片上，将插片平板倒置，继
续培养 2 ～3 d后，用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面的培养
物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接置入光学显
微镜下观察其形态并拍照［8］。采用菌落观察和显微镜装片
观察，根据菌落性状，镜检结果及《微生物分类学》的查阅，初
步鉴定为内生真菌。
1． 2． 4 内生真菌的抑菌试验。于无菌操作台内，用灭菌的
接种环取一环供试菌种，转入备好的 40 ml无菌水中，充分振
荡以使菌细胞或菌丝分散。用血小球计数板测菌液的浓度，
然后调配使其浓度为 1． 0 × 105 cfu /ml。培养基倒入平板冷
却后，加入 0． 1 ml菌悬液并在表面涂布均匀，在 37 ℃的环境
下放置 30 min。然后用镊子小心的在每个平皿表面上均匀
的放 4个已经灭菌的牛津杯，用移液枪向每个牛津杯内加入
100 μl上清液，再将其移至37 ℃的环境中培养16 ～18 h。观
察牛津杯外是否有抑菌圈，测定抑菌圈大小，并记录试验
结果［9 －10］。
2 结果与分析
2． 1 内生真菌的鉴定 试验主要从交让木各内生真菌的菌
落、(40 ×10)镜检和发酵液的形态特征方面加以辨别，同时
辅以《微生物分类学》参考鉴定［11］。由表 1 可知，从交让木
中分离得到 8 株内生真菌，分别为半知亚菌门的丝核菌属 1
种，头孢霉属2种，木霉属1种，青霉属2种，及接合菌纲的毛
霉属 1种，根霉属 1种。
表 1 交让木内生真菌的分离结果
编号 纲 种属
JＲ0201 丝孢纲 丝孢目，头孢霉属
JＲ0202 丝孢目，丛梗孢科，青霉属
JＲ0203 无孢目，丝核菌属
JＲ0204 丝孢目，丛梗孢科，青霉属
JＲ0205 丝孢目，头孢霉属
JＲ0206 丝孢目，木霉属
JＲ0207 接合菌纲 毛霉目，毛霉科，根霉属
JＲ0208 毛霉目，毛霉科，毛霉属
2． 1． 1 菌株 JＲ0201。(1)菌落特征。白色菌丝体，菌落中心
为橘红色，边缘规则。前期中心为红色，边缘为白色。第 4
天，白色菌丝体覆盖整个菌落，从后面看中心为红色，放冰箱
贮藏时从后面看变成黑色。(2)镜检形态(10 × 40)。有孢
子，比较疏散，轮生，菌丝较长，没有隔痕。(3)发酵形态。发
酵液为棕黄色浑浊状，菌丝球直径 1． 5 mm左右，有很清澈的
香味。各形态特征基本符合分类学描述，故确定菌株 JＲ0201
属丝孢纲，丝孢目，头孢霉属(图 1)。
图 1 菌株 JＲ0201的菌落形态、(40 ×10)镜检结构和发酵液观察的特征
2． 1． 2 菌株 JＲ0202 号。(1)菌落特征。菌落为毡状，菌落
为青色，边缘规则，气生菌丝密且短。前期为中心青色，边缘
为白色。第 3 天白色菌丝体覆盖整个菌落。(2)镜检形态
(10 ×40)。有孢子，比较繁杂，菌丝较长成网状，没有隔痕。
(3)发酵形态。褐色，瓶壁有附着物，有黑色菌丝球，直径2． 0
mm左右，其中还有个较大的菌丝体。各形态特征基本符合
分类学描述，故确定菌株 JＲ0202 属丝孢纲，丝孢目，丛梗孢
科，青霉属。
图 2 菌株 JＲ0202的菌落形态、(40 ×10)镜检结构和发酵液观察的特征
2． 2 交让木内生真菌的抑菌结果 试验以大肠杆菌代表革 兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌代表革兰氏阳性菌，枯草芽孢
2401 安徽农业科学 2013 年
杆菌和绿脓杆菌作为供试菌种，分别检测已鉴定出的 8种内
生真菌发酵液的抑菌活性［12］。由表 2 可知，JＲ0203 对金黄
色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌有抑菌效果强，对绿
脓杆菌抑菌效果较强，说明其有广谱的抗菌作用，而其他 7
株内生真菌均对 4种供试菌均无明显抗菌作用。
表 2 交让木内生真菌对 4种细菌的抑制结果
菌号
金黄色葡萄球菌
S． aureus
大肠杆菌
E． coli
枯草芽孢杆菌
B． subtilis
绿脓杆菌
P． aeruginosa
JＲ0201 + － + －
JＲ0202 － + + +
JＲ0203 + + + + + + + + + + +
JＲ0204 + + － +
JＲ0205 + － － －
JＲ0206 － + － +
JＲ0207 － + + －
JＲ0208 + － － －
注:“+ + +”、“+ +”和“+ ”分别表示抑菌圈直径为 13 ～ 17 mm、
10 ～13 mm和 10 mm以下，“－”表示无抑菌圈。
3 结论
植物内生真菌是一类相对来说开发较少、次生代谢产物
丰富、应用前景广阔的微生物资源。目前已从内生真菌中分
离到多种具有生物活性的代谢产物，主要有黄酮、生物碱、萜
类、甾体、醌类、环肽、脂肪酸等化合物。试验对交让木分离
出的内生真菌做鉴定后，得到 8 株内生真菌，鉴定分别为半
知亚菌门的丝核菌属 1种，头孢霉属 2种，木霉属 1 种，青霉
属 2种，及接合菌纲的毛霉属 1种，根霉属 1种。
试验结果表明，菌株 JＲ0203对金黄色葡萄球菌、枯草芽
孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果强，对绿脓杆菌抑菌效果较
强，说明有广谱抗菌作用。课题的研究结果将对交让木内生
真菌的次级代谢产物，分离获得具有药效活性的化合物提供
研究基础。
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10 －12．
( 上接第 1027页)
3 结论与讨论
试验结果表明，3种不同器官的挥发油在成分构成上比
较相似，含有 16 种相同成分，但在相对含量上差异较大，同
时与文献报道的数据有很大差异。杨爱梅等［4］人报道的光
果莸全草挥发油中化学成分含量最高的是乙酸桃金娘烯酯
(27． 96%) ，而试验中乙酸桃金娘烯酯只占 0． 06%;闫平等［2］
人报道的光果莸不同器官中含量最高的是反 －乙酸松香芹
酯，而试验中未鉴定出该物质。这可能与采样地点、气候、采
集时间等条件有很大关系，而且使用的气质联用仪器和检索
谱库的不同，都会使分析鉴定出来的化学成分与相关文献报
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340141 卷 3 期 苏香萍等 交让木内生真菌的分离和抑菌活性的研究