全 文 : 中国南方果树/SOUTH CHINA FRUITS 2014;43(1):18~22
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研究报告 ·落叶果树·
潮汕余甘子种质资源遗传多样性与亲缘关系的ISSR分析
刘晓生1,2,郑道序2,周春娟1,2,马瑞君1,詹潮安3,杨海东3,杨培奎1,庄东红1,2
(1韩山师范学院,潮州,521041;2汕头大学理学院生物系;3广东省汕头市林业科学研究所)
收稿日期:2013-09-11;修回日期:2013-12-21
基金项目:广东省科学技术厅科技基础条件建设项目(编号:2008A060201003、2010B060200003)资助。
作者简介:刘晓生,男,在读硕士生,研究方向为生物化学与分子生物学。
电话:15994994733,E-mail:934168346@qq.com
通信作者:马瑞君,教授,博士,主要从事植物生态学研究。E-mail:1277703092@qq.com
摘 要:采用ISSR分子标记技术,对潮汕地区所收集的17份余甘子品种(系)的遗传多样性进行分
析。利用7条多态性引物共扩增出70条可重复条带,多态性条带有56条,多态位点百分率(PPB)
为80%,分析揭示供试品种(系)的观察等位基因数、有效等位基因数、Nei’s遗传多样性指数和
Shannon's信息指数分别为1.800 0、1.470 0、0.270 3、0.404 7;各品种(系)之间的遗传相似系数
(GS)范围在0.528 6~0.9之间,平均遗传相似性系数为0.694 3。结果表明,17份供试材料的遗
传多样性水平较高,亲缘关系鉴定结果与根据样品来源、农艺性状及形态特征划分类别的结果基本
一致。
关键词:余甘子;ISSR;遗传多样性
中图分类号:S 665.9 文献标识码:A 文章编号:1007-1431(2014)01-0018-05
Analysis of Genetic Diversity and Genetic Relationship of Phyl-
lanthus emblica L.Germplasm in Chaoshan Area with ISSR
LIU Xiaosheng1,2,ZHENG Daoxu2,ZHOU Chunjuan1,2,MA Ruijun1,ZHAN Chaoan3,YANG Hai-
dong3,YANG Peikui 1,ZHUANG Donghong1,2
(1Hanshan Normal University,Chaozhou,521041;2Biology Department of Shantou University;3Shantou For-
estry Research Institute)
Abstract:Genetic diversity of 17 Phyllanthus emblica L.Germplasm colected in east of Guangdong was analyzed
with ISSR markers.Seven primers gave rise to 70discernible DAN fragments and 56(80%)of them were poly-
morphic.The observed number of aleles(Na),effective number of aleles(Ne),Nei's genetic diversity(H)
and Shannon's information index(I)were 1.800 0,1.470 0,0.270 3and 0.404 7,respectively.The genetic
similarity among 17varieties ranged from 0.528 6to 0.9.The average genetic similarity was 0.694 3.The re-
sults showed that the genetic diversity of these germplasm was very high.The genetic relationship analyzed with
ISSR markers was basicaly in accordance with the classification results based on geographical distribution and
morphological characteristics.
Keywords:Phyllanthus emblica L.;ISSR;genetic diversity
余甘子Phyllanthus emblica 属于大戟科(Eu-
phorbiaceae)叶下珠属(Phyllanthus)落叶乔木。在
我国余甘子主要分布于江西、福建、台湾、广东、海
南、广西、四川、贵州和云南等省区。余甘子果实可
生食,因食用后回味甘甜,故名余甘。在我国余甘子
的种植历史悠久,种质资源丰富,但也存在品种名称
混淆的问题。对于余甘子分类鉴定的研究主要是农
艺性状等生物学特征的比较[1-3],随着分子生物学技
术的迅速发展,RAPD[4]、SRAP[5]和ISSR[6-7]等分
子标记技术也被用于从DNA水平上对余甘子品种
DOI:10.13938/j.issn.1007-1431.2014.01.018
第1期 刘晓生,等:潮汕余甘子种质资源遗传多样性与亲缘关系的ISSR分析
资源的分析鉴定。潮汕地区不仅是余甘子的主产区
之一,而且具有丰富的余甘子种质资源。此前针对
潮汕地区余甘子的研究主要集中于品种特性[1]以及
优良品种的调查[8],而对其品种资源的遗传多样性
以及品种间的亲缘关系缺乏科学有效的分析研究。
本研究在前期余甘子品种资源调查收集的基础上,
利用ISSR分子标记技术对汕头市林业科学研究所
已收集的潮汕地区余甘子品种资源的遗传多样性进
行分析研究,旨在为该地区余甘子种质资源的保护、
保存管理以及育种提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用的17份材料由广东省汕头市林业
科学研究所提供(见表1)。
表1 潮汕地区17份余甘子材料名称及来源
编号 样品名 来源地 编号 样品名 来源地
1 普甘1号 揭阳普宁 10 谷饶甜种 汕头潮阳
2 硬枝 揭阳普宁 11 本甘1号 汕头潮阳
3 普甘2号 揭阳普宁 12 揭阳甜种 揭阳普宁
4 土种 汕头潮阳 13 山油甘 潮州饶平
5 饼甘 揭阳普宁 14 透明甜种 揭阳普宁
6 东坑甜种 汕头潮阳 15 狮头软枝 揭阳普宁
7 玻璃种 汕头潮阳 16 广西种 汕头潮南
8 本甘2号 揭阳普宁 (广西引种)
9 珍珠甘 汕头潮阳 17 青皮 揭阳普宁
1.2 DNA提取
采用改良 CTAB 法 提 取 余 甘 子 基 因 组[9]。
DNA经过0.8%琼脂糖电泳检测后保存于-40℃
冰箱备用。
1.3 ISSR扩增及PCR产物检测
ISSR引物由上海生物工程公司合成(见表2),
在 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(TP600)型
PCR仪上进行PCR扩增。余甘子ISSR-PCR扩增
反应体系为25μL∶10×Buffer(10mmol/L)2.5
μL;5U/μL的Taq DNA聚合酶(TaKaRa)0.2μL;
25mmol/L的 MgCl22.0μL;10mmol/L的dNTPs
(TaKaRa)2.0μL;10μmol/L 的引物(上海生工)
1.0μL,10ng/μL 的模板 DNA 1.0μL,ddH2O
16.3μL。扩增程序为94℃预变性5分钟;94℃变
性30秒,54℃退火(不同引物有其特异退火温度)1
分钟,72℃延伸1.5分钟,40个循环;72℃延伸7
分钟。4℃保存。PCR产物用1.8%琼脂糖凝胶电
泳分离,EB染色检测,BIO-PRINT凝胶成像系统
拍照。
1.4 数据处理与分析
有ISSR条带记为1,无带记为0。将所有引物
的数据汇聚成原始数据矩阵,使用POPGEN 32软
件计算多态位点百分率(PPB)、观察等位基因数、有
效等位基因数、Nei’s遗传多样性指数、Shannon’s
信息指数等遗传多样性指数;利用 NTSYS-pc2.1e
软件根据SM计算品种间的遗传相似性系数,运用
UPGMA构建树状图进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 ISSR引物扩增产物的多态性和供试品种的
遗传多样性
采用筛选出的7条多态性好、稳定性高的ISSR
引物,对供试的17份余甘子品种进行PCR扩增分
析。试验结果看出,这些引物共扩增得到70个条
带,其中多态性条带为56个,多态位点百分率为
80%。单条引物扩增的条带数在7~12条,平均每
条引物扩增出10个条带,平均每个引物扩增8条多
态性条带(见表2)。
表2 潮汕17份余甘子种质ISSR 引物
扩增结果及多态性
引物编号 引物序列
退火
温度/
℃
扩增
条带/
条
多态性
条带/
条
多态位点
百分率/
%
UBC-813 (CT)8T 52 7 5 71
ISSR2 (AC)8T 54 11 8 73
ISSR3 (AC)8C 54 10 9 90
UBC-812 (GA)8A 57 11 9 82
UBC-834 (AG)8YT 54 9 7 78
UBC-850 (GT)8YC 56 10 9 90
UBC-835 (AG)8TC 54 12 9 75
总计 70 56
平均 10 8 79.86
根据ISSR分析的结果对供试品种的遗传多样
性进行分析,结果表明,供试品种的观察等位基因
数、有效等位基因数、Nei’s遗传多样性指数和
Shannon’s信息指数分别为1.800 0、1.470 0、0.270
3和0.404 7(见表3)。综合引物的多态性以及遗
传多样性参数,引物ISSR 3和 UBC-850的PCR扩
增效果较好(见图1)。
91
中 国 南 方 果 树/SOUTH CHINA FRUITS 第43卷
表3 潮汕17份余甘子种质的遗传多样性
引物编号 观测等位基因数 有效等位基因数 Nei’s遗传多样性指数 Shannon’s信息指数
UBC-812 1.818 2 1.365 2 0.222 1 0.346 5
ISSR2 1.727 3 1.560 6 0.309 5 0.446 2
UBC-834 1.777 8 1.510 5 0.281 0 0.412 9
ISSR3 1.900 0 1.499 8 0.289 5 0.436 6
UBC-850 1.900 0 1.438 7 0.261 0 0.402 1
UBC-813 1.714 3 1.414 7 0.244 2 0.368 5
UBC-835 1.750 0 1.486 2 0.277 6 0.410 5
平均 1.800 0 1.470 0 0.270 3 0.404 7
St.Dev 0.402 9 0.385 3 0.193 6 0.263 8
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1M M
图1 潮汕17份余甘子种质引物UBC-850的ISSR-PCR 电泳图谱
2.2 品种(系)间的亲缘关系和聚类分析
供试品种(系)间的相似性系数介于0.528 6~
0.9之间,平均遗传相似性系数为0.694 3(见表
4)。其中,饼甘与硬枝、普甘2号及青皮遗传相似性
最低,均为0.528 6,亲缘关系最远;而透明甜种和狮
头软枝遗传相似性最高,为0.9。根据聚类结果,以
0.67为阈值将17份余甘子品种(系)分为3簇。第
一簇包括普甘1号、普甘2号、透明甜种、狮头软枝
等共8份材料,第二簇包括东坑甜种、珍珠甘、玻璃
种、山油甘号等7份材料,第三簇包括饼甘和本甘2
号两份材料(见图2)。
表4 潮汕17份余甘子种质间的相性似系数
种质编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 1
2 0.814 3 1
3 0.871 4 0.828 6 1
4 0.828 6 0.871 4 0.814 3 1
5 0.600 0 0.528 6 0.528 6 0.600 0 1
6 0.671 4 0.571 4 0.600 0 0.642 9 0.671 4 1
7 0.700 0 0.685 7 0.714 3 0.700 0 0.642 9 0.714 3 1
8 0.628 6 0.585 7 0.585 7 0.600 0 0.828 6 0.671 4 0.728 6 1
9 0.728 6 0.628 6 0.657 1 0.671 4 0.642 9 0.857 1 0.771 4 0.642 9 1
10 0.714 3 0.700 0 0.700 0 0.685 7 0.685 7 0.700 0 0.728 6 0.571 4 0.700 0
11 0.700 0 0.657 1 0.628 6 0.671 4 0.671 4 0.657 1 0.685 7 0.557 1 0.685 7
12 0.671 4 0.628 6 0.600 0 0.614 3 0.700 0 0.742 9 0.685 7 0.785 7 0.771 4
13 0.642 9 0.714 3 0.685 7 0.671 4 0.671 4 0.742 9 0.742 9 0.728 6 0.742 9
14 0.857 1 0.785 7 0.842 9 0.828 6 0.542 9 0.700 0 0.671 4 0.571 4 0.757 1
15 0.814 3 0.771 4 0.828 6 0.785 7 0.557 1 0.685 7 0.685 7 0.614 3 0.742 9
16 0.642 9 0.628 6 0.600 0 0.614 3 0.585 7 0.685 7 0.685 7 0.700 0 0.714 3
17 0.757 1 0.8 0.714 3 0.728 6 0.528 6 0.628 6 0.657 1 0.585 7 0.742 9
02
第1期 刘晓生,等:潮汕余甘子种质资源遗传多样性与亲缘关系的ISSR分析
续表4
种质编号 10 11 12 13 14 15 16 17
10 1
11 0.842 9 1
12 0.614 3 0.628 6 1
13 0.671 4 0.685 7 0.742 9 1
14 0.714 3 0.700 0 0.642 9 0.671 4 1
15 0.700 0 0.714 3 0.657 1 0.714 3 0.900 0 1
16 0.614 3 0.685 7 0.857 1 0.714 3 0.614 3 0.628 6 1
17 0.642 9 0.714 3 0.800 0 0.714 3 0.757 1 0.771 4 0.8000 0 1
注:种质编号名称见表1。
1
3
14
15
2
4
10
11
6
9
7
13
12
16
17
5
8
0.62 0.69 0.76 0.83 0.90
图2 潮汕17份余甘子种质的亲缘关系聚类
3 讨论
3.1 17份余甘子种质的亲缘关系分析
聚类结果树状图显示,17份余甘子品种可归为
3大类:第一大类共8个品种,包括普甘1号、普甘2
号、透明甜种、狮头软枝、硬枝、土种、谷饶甜种和本
甘1号,其中,来源于普宁的有5个品种,包括普甘
1号、普甘2号、透明甜种、狮头软枝和硬枝,而后三
者均来源于普宁市麒麟镇;第二大类共有7个品种,
包括东坑甜种、珍珠甘、玻璃种、山油甘、揭阳甜种、
广西种和青皮,其中,东坑甜种、珍珠甘、玻璃种等3
个品种来源于潮阳的金灶镇;第三类为饼甘与本甘
2号,来源于揭阳普宁。因此,初步分析得出亲缘关
系与来源地有一定的相关性。
另一方面,从农艺性状分析,第一类的谷饶甜种
与狮头软枝,虽来源于不同地方,但因其果实大小、
外观等农艺性状相近,被聚为同一类,而亲缘关系最
近的第14号透明甜种与第15号狮头软枝,虽来源
地均为普宁,但农艺性状分属甜种型和柿饼型[8],透
明甜种果实圆形透明,而狮头软枝果实椭圆形不透
明。因而聚类结果说明亲缘关系与农艺性状没有必
然的联系。
郑道序等[8]根据农艺性状及形态特征,也将潮
汕地区余甘子分为三大类,但其农艺性状划分的结
果与本文分析结果不尽相同。如本文第6号、第9
号样品的亲缘关系较接近,但其品种分别为东坑甜
种和珍珠甘,实际分属不同的类型,出现了聚类结果
与传统的形态学分类不一致的情况,这可能与此次
分析所用的引物与传统分类所涉及性状的关联度不
高,需要在后续的研究中进一步筛选引物以及进行
性状研究,从而获得与农艺性状相关性较高的引物
标记。但总体来看,利用ISSR分子标记[6-7]分析的
结果,与品种来源、农艺性状及形态特征划分类别的
结果还是比较一致,可以较好地用于现有品种资源
的研究。
3.2 潮汕地区余甘子品种(系)的遗传多样性
本文基于ISSR引物扩增结果计算出了多态位
点百分率、观察等位基因数、有效等位基因数、Nei’s
遗传多样性指数和Shannon’s信息指数等参数,从
不同的角度评价了供试样品的多样性水平。在这些
参数中,多态位点百分率为80%,这一参数明显低
于蔡英卿等对福建余甘子遗传资源基于RAPD分
析所得到的多态位点百分率为100%的研究结
果[4],而接近于李巧明等用ISSR分子标记技术对
云南干热河谷地区余甘子居群的遗传多样性多态位
点百分率85.19%[7]。在评价遗传多样性的参数
中,多态位点百分率计算方法简单直观,能够反映一
定的遗传多样性水平,在研究中得到广泛的应
用[11]。但是它不能确定各条带在强度上的均匀程
度,而且受到样本大小和条带总数的影响,只能是对
12
中 国 南 方 果 树/SOUTH CHINA FRUITS 第43卷
遗传多样性的一个粗略的估计值。而基于 Hardy-
Weinberg假设的 Nei’s遗传多样性指数和基于条
带表型强度的Shannon’s信息指数是更接近客观的
衡量指标,被大量地用作衡量物种及种群内的遗传
多样性水平。在本研究中,Nei’s遗传多样性指数
(0.270 3)和Shannon’s信息指数(0.404 7)均高于
云南干热河谷地余甘子种群(分别为0.247 1,0.378
9),且Nei’s遗传多样性指数也高于Nybom(2004)
所统计的多种植物种群水平的遗传多样性(基于
RAPD、AFLP、ISSR等显性标记)的平均值(H=
0.23),表明潮汕余甘子种群具有相对较高的遗传
多样性水平。其原因可能是本研究所用材料既有原
产地分布于潮汕的揭阳、汕头、潮州,也有外来品种,
如编号16的广西种。尤其是长期栽培中的人为定
向选育、驯化,从而形成了较丰富的变异类型,如程
文俊等根据果实的外部形态特征和生长特性,把当
地余甘子分为4个品种类型[12]。根据熊仪俊等对
我国余甘子地理气候分类及其特征分析,潮汕余甘
子属于湿润区分布类型[13]。该类型所生长的区域
具有较明显的热带季风气候性质,土壤多数为热带
砖红性土壤与亚热带红壤的过渡类型,余甘子生长
地方植被较为复杂,与分布于我国四川西昌为代表
的较湿润区和以云南元谋为代表的干热分布区的余
甘子相比,数量多,品种间差别较大。这一观点正好
与本研究结果相吻合。
4 结论
本试验采用7条ISSR引物,对17份余甘子种
质扩增,表现出较丰富的多态性。从分子水平来看,
供试的17份余甘子种质资源的遗传相似系数介于
0.528 6~0.9之间,说明其遗传分化较大,遗传多样
性较高。另外,从聚类图显示来看,17份余甘子品
种可归为3大类,其分类与它的农艺性状和地理来
源均有一定关系。综上所述,本试验结果可以为潮
汕余甘子种质资源的分类鉴定、遗传育种等提供理
论依据。
参 考 文 献
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(责任编辑:吴 涛;英文编辑:董朝菊
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