全 文 ：第 35卷 第 3期
2016年 6月
天 津 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Vol．35 No．3
Jun．2016
摘要：[目的]建立同时测定地锦草药材中没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚 4种指标成分的超高液相色谱法
（UPLC）。[方法]采用 UPLC法，色谱柱为 Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为甲醇-乙腈
4∶6（A）-0.2%甲酸水（B）溶液，梯度洗脱：0~3 min，5% A；3~4 min，5%~17% A；4~19 min，17% A；19~42 min，17%~30%
A；42~50 min，30%~34%A；50~55 min，34%~70%A，体积流量 0.2 mL/min；检测波长为 0~4 min, 270 nm；4~55 min，360 nm，
柱温 30℃。[结果] 4种成分均达到基线分离，各成分在线性范围内有良好的线性关系（r＞0.999 7）；回收率在 96.5%~
102.9%。[结论]建立的测定方法准确灵敏、重复性好，能较全面地评价地锦草药材的质量。
关键词：UPLC；同时测定；地锦草；含量
中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1673－9043（2016）03－0196-04
UPLC法同时测定地锦草中
4种指标成分的含量 *
冯光维 1，2，刘志东 1，祁东利 1，皮佳鑫 1，顾 星 1，张 谦 1，黄 瑞 1
（1.天津中医药大学现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津 300193；
2.黔南民族医学高等专科学校，都匀 558000）
*基金项目：黔南民族医学高等专科学校科研基金资助项目
（QNYZ2014014）。
作者简介：冯光维（1982-），男，少数民族骨干硕士，讲师，主
要从事中药制剂及质量标准研究。
通讯作者：刘志东，E-mail: lonerliuzd@163.com。
地锦草为大戟科植物地锦（Euphorbia humifusa
Willd.）或斑地锦（Euphorbia maculate L.）的干燥全
草，分布于全国各地，具有清热解毒、利湿退黄、活
血止血的功效，临床上主要治疗细菌性痢疾、肠炎、
痈肿疔疮和湿热黄疸等[1-2]。地锦草中化学成分主要
是没食子酸、鞣花酸等有机酸类和槲皮素、山奈酚
等黄酮类化合物[3-8]，其中没食子酸具有抗炎、抗病
毒、抗肿瘤等活性[9]，鞣花酸具有抗氧化、抗肿瘤、抗
突变等活性[10]，槲皮素、山奈酚均具有抗炎、抗氧化、
抗菌等活性[11-12]。中国药典以槲皮素作为地锦草的
质控指标，同时有文献采用高效液相色谱法（HPLC）
测定地锦草中成分[13-15]，但对其多指标成分的测定
较少报道。超高效液相色谱法（UPLC）测定具有方法
简便，分析时间短，溶剂消耗少等特点，尤其适用于
中药材多指标成分的定量检测。本研究采用 UPLC
技术[16-20]，建立了 UPLC法测定地锦草中没食子酸、
鞣花酸、槲皮素、山奈酚含量的方法，更加全面的控
制地锦草药材的质量，对地锦草制剂开发及质量控
制提供可靠依据。
1 仪器与材料
Waters Acquity超高效液相色谱仪，配置四元高
压泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱、TUV检
测器，美国 Waters公司；Sorvall ST16R高速离心机，
德国 Thermo Scientific 公司；Milli—Q 超纯水机，德
国 Millipore公司；KQ-300B超声清洗仪，昆山市超
声仪器有限公司；FW177型中草药粉碎机，天津泰
斯特仪器有限公司；Mettler Toledo XP205电子分析
天平，Mettler Toledo仪器有限公司；FA124型天平，
上海舜宇恒平有限公司。
没食子酸（批号 110831-201204）、槲皮素（批号
100080-201408）对照品由中国食品药品检定研究
院提供；鞣花酸（批号 W16-5-0）、山奈酚（批号
W13-5-9）对照品由天津中新药业有限公司提供，
质量分数均≥98%。甲醇、乙腈均为色谱纯，Fisher
Scientific公司；水为超纯水；甲酸为色谱纯，购自日
本东京化成工业株式分社。地锦草药材分别收集于
贵州、河南、安徽、广西等产地，共 12批，经天津中
医药大学中医药研究院刘志东博士鉴定为大戟科
植物地锦（Euphorbia humifusa Willd.）的干燥全草。
药材信息见表 1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为 Acquity UPLC BEH C18
DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.12
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（100mm×2.1mm，1.7μm），检测波长为 0~4min，270 nm，
4~55 min，360 nm；柱温 30 ℃；体积流量0.2 mL/min；
进样量为 2 μL；流动相为甲醇∶乙腈 4∶6（A）-0.2 %
甲酸水（B）进行梯度洗脱，洗脱程序见表 2。
2.2 溶液的制备
2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取没食子
酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚对照品适量，加甲醇制
成浓度分别为:412.0、608.0、200.0、10.0 mg/L混合对
照品储备液。分别精密量取 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、
1.6、2.0 mL储备液置 10 mL量瓶中，加甲醇定容至
刻度，摇匀，制得系列混合对照品溶液，避光保存。
2.2.2 供试品溶液的制备 称取地锦草粉末（过三
号筛）2.0 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加
入 80%甲醇 50 mL，密塞，称质量，超声处理 45 min
（频率 40 KHz，功率 300 W），放冷、称质量，加 80%
甲醇补足减失的质量，摇匀，12 000 r/min离心 10min，
用 0.2 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
2.3 系统适应性实验 分别精密吸取混合对照品
溶液及供试品溶液 2 μL，按“2.1”项色谱条件进样，
结果 4种被测成分均能达到基线分离，与相邻色谱
峰的分离度均大于 1.5，理论塔板数以各色谱峰计
均超过 10 000，峰形较好。UPLC色谱图见图 1。
2.4 线性关系考察 在“2.1”项色谱条件下，分别
精密量取系列质量浓度的混合对照品溶液 2 μL，注
入液相色谱仪，记录色谱图。分别按照色谱条件依
次进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），
对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行
线性回归，得回归方程。结果见表 3。
2.5 精密度实验 取混合对照品溶液，在“2.1”项
色谱条件下，连续进样 6次，进样体积为 2 μL，以对
照品峰面积进行计算，没食子酸、鞣花酸、槲皮素、
山奈酚峰面积的 RSD分别为 0.66%、0.55%、0.80%、
1.39%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性实验 取待测地锦草（编号 S2）供试品
溶液，按“2.1”项下色谱条件操作，分别在 0、2、4、8、
12、24 h进样，测定没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈
酚的峰面积，按峰面积计算得 RSD分别为 0.80%、
0.97%、1.18%、1.33%，表明供试品溶液在 24 h 内
稳定。
2.7 重复性实验 取同一批次地锦草药材粉末（编
表 1 12批地锦草药材来源
编号 样品来源 产地 收集日期
S1 贵州康心药业有限公司 贵州 20141015
S2 贵州一杆秤大药房连锁有限公司 贵州 20141018
S3 贵州一品药业连锁有限公司 贵州 20141029
S4 河南顺康医药有限公司 河南 20141102
S5 河南宝芝堂医药连锁有限公司 河南 20141120
S6 河南省同乐医药有限公司 河南 20141202
S7 安徽亳州市中药材公司 安徽 20141020
S8 安徽丰原大药房连锁有限公司 安徽 20141120
S9 广州致信药业有限公司 安徽 20141219
S10 广西桂玉医药有限责任公司 广西 20141216
S11 广西康祥医药有限公司 广西 20141220
S12 广西一心医药公司 广西 20141221
表 2 梯度洗脱程序表
时间（min）
流速
（mL/min）
甲醇∶乙腈 4∶6（A）
（%）
0.2%甲酸水（B）
（%）
0 0.2 5 95
3 0.2 5 95
4 0.2 17 83
18 0.2 17 83
42 0.2 30 70
50 0.2 34 66
55 0.2 70 30
表 3 4种指标成分线性关系考察结果
成分 标准曲线 相关系数（r） 线性范围（mg/L）
没食子酸 Y＝31 866X－ 1 403.2 0.999 8 4.12～65.92
鞣花酸 Y＝17 379X－26 262.0 0.999 7 6.08～97.28
槲皮素 Y＝47 854X－18 446.0 0.999 9 2.00～40.00
山奈酚 Y＝39 465X－ 1 837.1 0.999 8 0.21～ 3.28
1：没食子酸；2：鞣花酸；3：槲皮素；4：山奈酚
图 1 4种混合对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的 UPLC
色谱图
时间（min）
时间（min）
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表 4 地锦草药材中 4种指标成分含量测定结果（n＝3）
编号 产地
质量分数（mg/g）
没食子酸 鞣花酸 槲皮素 山奈酚
S1 贵州 0.280 5 1.648 2 0.028 5 0.002 0
S2 贵州 1.390 0 2.010 0 0.172 0 0.025 0
S3 贵州 1.611 7 1.778 0 0.088 0 0.007 1
S4 河南 1.299 1 1.588 5 0.083 8 0.012 6
S5 河南 0.578 7 1.709 2 0.042 2 0.011 4
S6 河南 0.602 7 1.263 4 0.038 1 0.015 4
S7 安徽 1.372 9 1.521 7 0.094 9 0.009 9
S8 安徽 0.498 8 0.857 7 0.068 4 0.002 1
S9 安徽 1.298 4 1.548 6 0.072 7 0.011 3
S10 广西 1.458 1 1.975 4 0.107 8 0.011 2
S11 广西 4.430 4 3.107 1 0.123 0 0.016 5
S12 广西 1.714 1 0.664 7 0.029 1 0.021 1
号 S2）约 2.0 g，平行称定 6 份，按“2.2.2”项下方法
操作，制备供试品溶液 6份，每份精密吸取 2 μL，按
“2.1”项下色谱条件测定，分别测得没食子酸、鞣花
酸、槲皮素、山奈酚质量分数的 RSD分别为 1.80%、
1.40%、1.76%、1.21%，表明方法重复性良好。
2.8 加样回收率实验 取已测定的地锦草药材（编
号 S2）粉末 6份，每份 1.0 g，精密称定，每份加入相
同量的没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚对照品，
按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液，按“2.1”
项下条件测定，结果平均回收率分别为 96.5%、
102.9%、96.9%、97.0%，RSD 分别为 1.34%、1.22%、
0.91%、1.30%。
2.9 样品测定 取收集于贵州、河南、安徽、广西等
不同产地的 12批地锦草药材，分别称取地锦草药
材粉末约 2.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法操作，
制备供试品溶液，平行 3份，按“2.1”项下色谱条件
进行测定，并计算样品中 4种指标成分的含量，结
果见表 4。
结果表明，贵州、河南、安徽、广西产地 12批次
的地锦草药材中 4种指标成分的含量存在一定差
异，其中没食子酸含量差异较大，以广西产的含量
最高，这可能与土壤、环境、采收季节、加工过程等
有关。
3 讨论
本实验考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲
酸水、甲醇∶乙腈（4∶6）-0.1%甲酸水混合溶剂系统对
地锦草成分分离度的影响，结果发现甲醇∶乙腈（4∶
6）-0.1%甲酸水混合溶剂系统能够使色谱峰达到完
全分离。同时考察了甲酸用量对色谱峰对称性的影
响，结果发现，0.2%甲酸水溶液对色谱峰对称性较好，
且甲酸易挥发的性质适用于 UPLC的测定，故最终
确定甲醇∶乙腈（4∶6）-0.2%甲酸水溶液作为流动相。
在样品处理过程中，考察了甲醇、80%甲醇、
50%甲醇 3种溶剂的提取效率，结果表明 80%甲醇
作为提取溶剂时，各指标成分的含量较高，故选择
80%甲醇作为提取溶剂。
超声提取各成分，考察了 30、45、60 min超声时
间的提取效果，发现超声 30 min时各成分的含量相
对较低；45 min和 60 min各成分的含量基本一致，
故提取时间选择 45 min。
测定波长的选择上，没食子酸的最大吸收为
270 nm，鞣花酸、槲皮素、山奈酚均在 360 nm 时有
强吸收，并且基线平稳，故确定其测定波长为0~4 min
时波长为 270 nm，4~55 min时波长为 360 nm。
《中国药典》2015年版采用酸水解的方法对地
锦草中黄酮苷进行降解，测定降解产物槲皮素的含
量；而本实验采用有机溶剂直接提取药材中的有效
成分进行含量测定，更能准确反映各指标成分在药
材中的真实含量。
本实验建立了 UPLC法测定地锦草中 4种指标
成分的方法，分析了 4个产地 12批药材中有机酸
和黄酮类成分的含量，黄酮类成分含量地域差异较
小，而有机酸类成分含量差异较大，为地锦草药材
的质量控制提供了科学依据。
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Simultaneous determination of four components in Euphorbia HumifusaWilld. by UPLC
FENG Guang-wei1,2, LIU Zhi-dong1, QI Dong-li1, PI Jia-xin1, GU Xing1, ZHANG Qian1, HUANG Rui1
（1． Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique, Ministry of
Education, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2.Qiannan Medical College
for Nationalities, Duyun, Guizhou, 558000, China）
Abstract: [Objective] To establish an UPLC method for simultaneous determination four index components
such as gallic acid, ellagic acid, quercetin and kaempferol in Euphorbia Humifusa Willd. [Methods] A
chromatographic separation method was established with Acquity UPLC BEH C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.7μm)
with methanol-acetonitrile (40∶60, A)-0.2% formic acid (B) as mobile phases at the flow rate of 0.2 mL/min. The
gradient elution was carried out as follows: 0~3 min, 5%A; 3~4 min, 5%~17%A；4~19min, 17%A；19~42 min, 17%~
30%A; 42~50 min, 30%~34%A; 50~55 min, 34%~70%A. The detection wavelength was 270 nm at 0~4 min and
360 nm at 4~55 min, and the column temperature was 30 ℃ . [Results] The four index components were well
separated and each component had a good linear relationship in the liner range (r>0.999 7); and the recovery was in
the range of 96.5%~102.9%. [Conclusion] The method is accurate, sensitive and repeatable for the comprehensive
quality control of Euphorbia Humifusa Willd.
Key words: UPLC; simultaneous determination; Euphorbia Humifusa Willd.; content
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