全 文 ：第 36 卷 第 2 期 青 海 医 学 院 学 报 Vol． 36 No． 2
2015 年 JOUＲNAL OF QINGHAI MEDICAL COLLEGE 2015
※:李元忠(1975 ～)，男，汉族，青海籍，主治医师
* :通信作者，博士，教授，E － mail:djzhang@ nwipb． ac． cn
五味余甘子散对大鼠心肌缺血再灌损伤
Bcl － 2、Bax蛋白表达的影响
李元忠1，谭国生2，李福安2，张得钧2*
(1．青海省海东市乐都区中医院，青海 乐都 810799;2．青海大学医学院，青海 西宁 810001)
摘 要 目的 探讨藏方五味余甘子散对大鼠心肌缺血再灌损伤相关细胞凋亡蛋白表达的影
响及其可能机理。方法 96 只 SD大鼠随机分成 6 组，分别为五味余甘子散高、中、低剂量组，伪手
术组，模型组以及阳性对照组，每组 16 只。用结扎大鼠左冠状动脉前降支法制备心肌缺血再灌注
模型，再灌注 40 min后，检测大鼠心肌细胞 Bcl － 2、Bax 蛋白的表达。结果 五味余甘子散能显著
提高心肌细胞 Bcl － 2 蛋白的表达，抑制 Bax 蛋白的表达，同时提高 Bcl － 2 /Bax 比值。结论 五味
余甘子散对大鼠心肌缺血再灌损伤具有保护作用，其机制可能通过上调凋亡 Bcl － 2 蛋白表达，提
高 Bcl － 2 /Bax比值，下调 Bax蛋白的表达抑制细胞凋亡。
关键词 五味余甘子散 心肌缺血再灌注损伤 Bcl － 2 Bax
中图分类号 Ｒ932 文献标识码 A
DOI:10． 13452 / j． cnki． jqmc． 2015． 02． 012
THE INFLUENCE OF TIBETAN MEDICINE WUWEIYUGANZISAN
ON Bcl － 2 AND Bax EXPＲESSION IN MYOCAＲDIAL
ISCHEMIA － ＲEPEＲFUSION INJUＲY IN ＲATS
Li Yuanzhong1，Tan Guosheng2，Li Fuan2，Zhang Dejun2
(1． Ledu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Haidong，Qinghai，810799;
2． Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai，810001)
Abstract Objective To explore the influence of apoptosis － associated protein expression and its possible
mechanism of Wuwei Yuganzi San，one of Tibetan medicine，on myocardial ischemia － reperfusion injury in rats．
Methods Ninety － six Sprague － Dawley rats were assigned randomly into six groups including high dose group，
moderate dose group and low dose group according to the dosage of Wuwei Yuganzi San administrated． Moreover，
Sham － operation group，Model group and Positive control group were supplemented． And each group was 16 rats，
Myocardial ischemia － reperfusion injury model was established by ligation of the left anterior descending coronary
artery(LAD)of the heart． Following 40 min reperfusion in rats，Bcl － 2 and Bax protein expression in cardiomyocytes
were detected． Ｒesults Myocardial Bcl － 2 protein expression was significantly augmented well paralleling with an
increase in ratio of Bcl － 2 to Bax，while Bax protein expression was inhabited． Conclusion WuweiYuganzi San may
have a protective effect on myocardial ischemia － reperfusion injury model． The mechanisms may associate with an
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up － regulated expression of Bcl － 2，and an increased ratio of Bcl － 2 /Bax and a low － regulated expression of Bax，
resulting in suppression of apoptosis．
Keywords Wuweiyuganzisan Myocardial ischemia － reperfusion injury Bcl － 2 and Bax
心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia －
reperfusion injury，MIＲI)机制很多，细胞凋亡是缺血
再灌注损伤心肌细胞死亡重要的形式之一［1］。近
年来，对抗心肌缺血再灌注损伤凋亡的报道较多，但
所述机制不一，且无相应解决方法。五味余甘子散
化裁于《帝玛医著选集》［2］中“居如聂莪”方，其由余
甘子、藏锦鸡儿等组成，临床应用效果明显，但缺乏
相关应用依据。因此，本研究通过观测心肌缺血再
灌注损伤后心肌组织中 Bcl － 2 蛋白及 Bax 蛋白表
达变化，来探讨五味余甘子散对大鼠心肌缺血再灌
注损伤的作用机制。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验对象
清洁级 SD大鼠，雌雄各半，体重 180 ～ 220 g，共
96 只，购自甘肃中医学院科研实验中心，许可证号:
SCXK(甘)2011 － 0001。
1． 1． 2 药品及试剂
五味余甘子散(由青海省金诃藏药有限公司提
供)，普萘洛尔(山西晋太药业，规格:10mg /片，批
号:20110502)，氨基甲酸乙酯(国药集团化学试剂
有限公司，批号:国药准字 H14021523);大鼠心肌凋
亡 Bc1 － 2 及 Bax蛋白试剂盒(20131113． 60284Ｒ)。
1． 1． 3 主要实验仪器
YP601N电子天平(上海精密科学仪器有限公
司)，星海 Seastar旋转蒸发器(锡市星海五生化设备
有限公司)，SHB － B 型循环水式多用真空泵(郑州
长城科工贸有限公司)，动物人工呼吸机(浙江医科
大学仪器实验厂)，ML818 PowerLab 生物信息信息
采集系统(澳大利亚 ADinstrument 公司)，TDL50B
飞鸽牌台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 药物制备
将五味余甘子散各味药按一定比例配制，总量
500 g，将诸药饮片稍加粉碎，混匀置砂锅中，加 8 倍
药量蒸馏水，浸泡 1 h 后，先以武火煮沸，后用文火
煎煮 50 min后将药液倒出，再加约为药量 4 倍的蒸
馏水再煎提一次，最后将两次煎提液充分混匀，四层
纱布过滤，在旋转蒸发器(40℃ ～ 50℃，30r /min)中
进行减压浓缩，浓缩至 100%浓缩液，即 1 mL 浓缩
液含生药 1 g。将 500 mL 浓缩液按 60 kg 成人与
200 g 大鼠的剂量估算关系进行折算［3］，配成低、
中、高三个剂量，分别为 0． 093、0． 187、0． 373 g /mL
(分别为人的 7、14、28 倍剂量);普萘洛尔浓度配成
0． 0013 g /mL，置于 4 ℃冰箱备用。
1． 2． 2 动物分组及给药
经 1 周适应性饲养，96 只大鼠随机分成 6 组，
分别为五味余甘子散高、中、低剂量组，伪手术组，模
型组以及阳性对照组，每组 16 只，雌雄各半。五味
余甘子散低、中、高组分别给予 1． 40、2． 80、
5． 60 g /(kg·d)五味余甘子散，伪手术组及模型组
分别给予相应浓度生理盐水，阳性对照组给予
0． 02 g /(kg·d)普萘洛尔，每日 1 次灌胃，连续灌胃
10 d。
1． 2． 3 动物模型制备
据相关文献［4］稍加改进，大鼠经称重后，以
20%的氨基甲酸乙酯溶液(5mL /kg)行腹腔麻醉，固
定，备皮，连接好 Powerlab数据采集分析系统并记录
正常心电图，于颏下颈部逐层钝性分离气管，甲状软
骨下 0． 8 cm 处，剪一倒置“T”型切口，进行气管插
管，并连接动物呼吸机，调整呼吸频率至 70 次 /min，
潮气量 15 ～ 20 mL /kg，呼吸比 3:1，压力 5 ～ 25 cm
H2O。沿距胸骨左缘第三肋间 0． 8 cm 处，用组织剪
纵向剪开约 2． 5 cm(为第三肋至第六肋之间)切口，
充分暴露胸腔，仔细将心包剥离，暴露心脏，于左心
耳与肺动脉圆锥间处找到左冠状动脉主干，用棉签
轻轻将左侧心脏托起，于左心耳下缘左冠脉左前降
支 1． 5 ～ 2 mm处，用带 5 /0 号丝线的无创眼科缝合
针进针，深度为 1 ～ 1． 5 mm，宽度为 2 ～ 3 mm，从肺
动脉圆锥旁出针。将肝素化的聚乙烯管于结扎处与
血管平行、贴壁放置，后结扎并关闭胸腔，观察心电
图变化及心尖部颜色改变。以心电图 QＲS 波增宽
及 J点抬高或降低超过三分之一稳定 10 min 以上、
心尖部呈暗紫色为结扎成功标志。30 min 后，将结
扎线从聚乙烯管腔中剪断，缓慢拔出线头，再灌
40 min，以心电图恢复、心尖部明显颜色改善为再灌
注成功标志，否则给予剔除。伪手术组，只穿线而不
结扎，30 min后将线拨出。
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1． 2． 4 标本采集及指标测定
造模结束后，摘取心脏，用 4 ℃生理盐水冲洗血
渍，滤纸吸干，迅速以液氮固定，固定好之后置于
－ 80 ℃冰箱中保存备测。Bcl － 2 及 Bax 蛋白表达
通过酶联免疫法测定。
1． 2． 5 统计学处理
数据采用 SPSS17． 0 软件进行处理，实验结果用
珋x ± s表示，组间比较用方差分析，两两比较采用
LSD － t检验，以 P ＜ 0． 05 表示有统计学意义。
2 结果
2． 1 对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织 Bcl － 2 及
Bax蛋白表达的影响(表 1)
表 1 五味余甘子散对心肌缺血再灌损伤大鼠心肌组织中 Bcl － 2 及 Bax蛋白表达的影响(珋x ± s)
Table 1 The effect of Wuwei Yuganzi San on rats myocardial tissue Bcl －2 and Bax expressions in MIＲI(珔x ± s)
组别 例数(n) Bcl － 2(% ) Bax(% ) Bcl － 2 /Bax比值
伪手术组 12 0． 075 ± 0． 015 0． 077 ± 0． 015 0． 984 ± 0． 014
模型组 14 0． 114 ± 0． 021☆ 0． 311 ± 0． 017☆ 0． 351 ± 0． 026☆
普萘洛尔阳性对照组 9 0． 084 ± 0． 014△ 0． 078 ± 0． 007△ 1． 076 ± 0． 026△
五味余甘子散低剂量组 11 0． 077 ± 0． 011△ 0． 085 ± 0． 015△ 0． 887 ± 0． 015☆△◇
五味余甘子散中剂量组 11 0． 079 ± 0． 010△ 0． 090 ± 0． 014△ 0． 879 ± 0． 016☆△◇
五味余甘子散高剂量组 11 0． 088 ± 0． 014△ 0． 094 ± 0． 020△ 0． 946 ± 0． 028△◇▼●
F － 12． 292 477． 052 1817． 703
P － ＜ 0． 001 ＜ 0． 001 ＜ 0． 001
注:☆表示与伪手术组比较，P ＜ 0． 05，△表示与模型组比较，P ＜ 0． 05，◇表示与普萘洛尔阳性对照组比较，P ＜ 0． 05，▼表示
与五味余甘子散低剂量组比较，P ＜ 0． 05，●表示与五味余甘子散中剂量组比较，P ＜ 0． 05．
表 1 示，模型组与伪手术组比较，凋亡 Bcl － 2
蛋白及相关 Bax 蛋白表达量升高(P ＜ 0． 01)，
Bcl － 2 /Bax比值下降(P ＜ 0． 01)，有显著性差异，表
明缺血再灌注可引起 Bcl － 2、Bax 蛋白表达上调。
五味余甘子散各组与模型组比较，凋亡 Bcl － 2 蛋白
表达降低及 Bax 蛋白表达上调 (P ＜ 0． 01)，
Bcl － 2 /Bax比值升高(P ＜ 0． 01)，有显著性差异，表
明五味余甘子散干预心肌缺血再灌损伤有效;与阳
性对照组比较(P ＜ 0． 01)，无统计学差异，表明五味
余甘子散干预作用与阳性药物相当;五味余甘子散
各剂量组比较无统计学差异(P ＞ 0． 01)，表明治疗
效果与剂量无关。
3 讨论
作为传统藏药藏方，五味余甘子散在藏医中用
于治疗血热血瘀证，具有清热凉血、化瘀通脉的功
效，临床应用于治疗心绞痛、高血压，高脂血症等疾
病，尤其是心绞痛，疗效显著，但其作用机理不清。
故本研究从细胞凋亡相关蛋白 Bcl － 2、Bax 表达量
角度探讨五味余甘子散对心肌缺血再灌注损伤的可
能机制。
大量研究表明，MIＲI 的机理涉及到氧化应激、
炎性反应、钙超载、坏死与凋亡［5 － 7］等，这些机制中
一种或多种共同参与再灌注后的损伤。目前细胞凋
亡被认为是心肌缺血再灌损伤的最终原因之一［8］。
凋亡是一种细胞程序性死亡，主要有线粒体介导、死
亡受体介导及内质网介导凋亡通路，其中对前两者
研究较多，其具体的机理仍未完全阐明，但 Bcl － 2
家族蛋白在线粒体介导的凋亡通路中起到关键作
用，其分为 Bcl － 2、Bcl － XL等为主的抗凋亡调节蛋
白，以及以 Bax、Bak 等为主的促凋亡调节蛋白［9］。
抗凋亡蛋白 Bcl － 2 位于线粒体膜上，防止线粒体释
放细胞色素 C，而促凋亡蛋白 Bax 位于细胞质中，可
以诱导凋亡启动因子细胞色素 C 的释放，而细胞色
素 C与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf － 1)结合并激活
Caspase 9 形成复合体，后者通过级联反应可分离并
激活 Caspase 3，从而启动凋亡程序或增强凋亡信
号［10］。因此，Bcl － 2 与 Bax 是一个动态平衡体系，
Bax蛋白过量表达则细胞凋亡处于促进状态，
Bcl － 2蛋白过量表达则细胞凋亡处于抑制状态，
Bcl － 2 /Bax蛋白表达比率决定细胞凋亡发生是
否［11，12］。在缺血或再灌注期间，Bcl － 2 与 Bax 的表
达量，不管在促使和(或)阻止心肌细胞凋亡方面都
起着关键作用。因此，Bcl － 2、Bax 蛋白表达量及
Bcl － 2 /Bax蛋白表达量比值可以在一定程度上反
映心肌细胞凋亡情况。本研究结果表明五味余甘子
散各组可以上调 Bcl － 2 蛋白、下调 Bax 蛋白表达以
931
及升高Bcl － 2 /Bax表达量的比值，表明五味余甘子
散可能通过上调 Bcl － 2 的表达量、下调 Bax 的表达
量，来抑制或阻断心肌缺血再灌注损伤的细胞凋亡
的发生。
综上所述，五味余甘子散对心肌缺血再灌损伤
具有保护作用，其可能的机理是通过上调抑制细胞
凋亡相关蛋白 Bcl － 2 及下调促细胞凋亡相关蛋白
Bax来实现保护缺血再灌注后的心肌细胞。但由于
心肌缺血再灌损伤的机制较为复杂，五味余甘子散
对缺血再灌损伤的保护作用是直接作用还是间接作
用，尚待进一步明确。
参考文献
［1］Zhang Q，Xiang J，Wang X，et al． Beta(2)－ adrenocep-
tor agonist clenbuterol reduces infarct size and myocardial apop-
tosis after myocardial ischemia / reperfusion in anaesthetized rats
［J］． Br J Pharmacol，2010，160(6):1561 － 1572．
［2］帝玛·丹增彭措．帝玛·丹增彭措医著选集(藏文)
［M］．西宁:青海民族出版社，1994． 262．
［3］陈奇．中药药理研究方法学［M］． 2 版．北京:人民卫
生出版社，2006． 31．
［4］张玮玮，郭永清． 大鼠急性心肌缺血再灌注模型的
改进［J］．山西医药杂志，2009，38(10):902 － 903．
［5］Wang Y，Zhang ZZ，Wu Y，et al． Honokiol protects rat
hearts against myocardial ischemia reperfusion injury by reducing
oxidative stress and inflammation［J］． Exp Ther Med，2013，5
(1) :315 － 319．
［6］Shintani － Ishida K，Inui M，Yoshida K． Ischemia －
reperfusion induces myocardial infarction through mitochondrial
Ca2 + overload［J］． J Mol Cell Cardiol，2012，53(2):233 － 239．
［7］Li Q，Wang F，Zhang YM，et al． Activation of cannabi-
noid type 2 receptor by JWH133 protects heart against ischemia /
reperfusion － induced apoptosis［J］． Cell Physiol Biochem，
2013，31(4 － 5) :693 － 702．
［8］Guo C，Zeng X，Song J，et al． A soluble receptor for ad-
vanced glycation end － products inhibits hypoxia / reoxygenation
－ induced apoptosis in rat cardiomyocytes via the mitochondrial
pathway［J］． Int J Mol Sci，2012，13(9) :11923 － 11940．
［9］Hu ZY，Abbott GW，Fang YD，et al． Emulsified isoflu-
rane postconditioning produces cardioprotection against myocar-
dial ischemia － reperfusion injury in rats［J］． J Physiol Sci，
2013，63(4) :251 － 261．
［10］Wang N，Minatoguchi S，Chen X，et al． Antidiabetic
drug miglitol inhibits myocardial apoptosis involving decreased
hydroxyl radical production and Bax expression in an ischemia /
reperfusion rabbit heart［J］． Br J Pharmacol，2004，142(6) :983
－ 990．
［11］Wang Y，Zhang ZZ，Wu Y，et al． Quercetin postcondi-
tioning attenuates myocardial ischemia / reperfusion injury in rats
through the PI3K /Akt pathway［J］． Braz J Med Biol Ｒes，2013，
46(10) :861 － 867．
［12］Zhu SB，Liu Y，Zhu Y，et al． Ｒemote preconditioning，
perconditioning，and postconditioning:a comparative study of
their cardio － protective properties in rat models［J］． Clinics(Sao
Paulo) ，2013，68(2) :263 － 268．
收稿日期 2015 － 01 － 03
041