全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2007, 19:956-959, 972
文章编号:1001-6880(2007)04-0956-05
　
　
　收稿日期:2007-05-15　　　接受日期:2007-08-26
　基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金项目(20060001149);
863计划项目(2006AA09Z405)
＊通讯作者 Tel:86-10-82806188;E-mail:whlin@bjmu.edu.cn
南海半红树植物黄槿内源真菌 GT20036029代谢产物研究
李莉娅 1, 2 ,邓志威 3 ,于善江 4 ,顾　佳 2 ,林文翰 2＊
1首都医科大学中医药学院 ,北京 100069;2北京大学医学部 天然药物及仿生药物国家重点实验室 , 北京 100083;
3北京师范大学分析测试中心 , 北京 100875;4中国生物技术发展中心 ,北京 100081
摘　要:应用多种色谱技术从半红树药用植物黄槿内生真菌 GT20036029中分离得到 9个化合物 , 通过波谱学
方法并与已知化合物数据作比较 ,鉴定它们分别为 N-(2-羟基苯乙基)乙酰胺 (1)、环(L-脯氨酸-D-异亮氨酸)
(2)、环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)(3)、环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)(4)、环(亮氨酸-酪氨酸)(5)、环(苯丙氨酸-丝氨酸)
(6)、脑苷脂 B(7)、(25S)-纽替皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖-(1※ 2)-β-D-葡萄糖苷 (8)和(25S)-异纽替皂苷元-3-O-
α-L-鼠李糖-(1※ 2)-β-D-葡萄糖苷 (9)。化合物 1为首次从海洋真菌代谢产物中分离得到。化合物 8显示了较
好的肿瘤细胞生长抑制活性。
关键词:红树林;黄槿;内生真菌;代谢产物
中图分类号:R93;Q936 文献标识码:A
MetabolitesofEndophyticFungusGT20036029Isolatedfrom
theMangrovePlantHibiscustiliaceus
LILi-ya1, 2 , DENGZhi-wei3 , YUShan-jiang4 , GUJia2 , LINWen-han2＊
1CapitalMedicalUniversitySchoolofTraditionalChineseMedicine, Beijing100069 , China;2StateKeyLaboratoryofNatural
andBiomimeticDrugs, PekingUniversity, Beijing100083 , China;3AnalyticalCenterofBeijingNormalUniversity,
Beijing100875 , China;4ChinaNationalCenterforBiotechnologyDevelopment, Beijing100081 , China
Abstract:NinecompoundswereisolatedfromtheculturebrothofamangroveendophyticfungusGT20036029, which
wasisolatedfromasemi-mangroveplantHibiscustiliaceus.TheywereidentifiedasN-(2-hydroxyphenethyl)acetamide
(1), cyclo(L-Pro-D-Ile)(2), cyclo(L-Leu-L-Pro)(3), cyclo(D-Leu-L-Pro)(4), cyclo(Leu-Tyr)(5), cyclo(Phe-
Ser)(6), cerebrosideB(7), (25S)-nuatigenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1※ 2)-β-D-glucopyranoside(8)and
(25S)-isonuati-genin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1※ 2)-β-D-glucopyanoside(9)onthebasisofspectroscopicdataan-
alyses.Compound1wasfirstlyisolatedfrommarinefungus, whilecompound8 showedsignificantgrowthinhibitionof
tumorcells.
Keywords:mangroveplant;Hibiscustiliaceus;endophyticfungus;metabolites
　　红树林作为一个独特的生态系统 ,产生了丰富
的微生物资源。由于植物内生菌代谢成分的多样
性 、新颖性及显著生物活性等特点 ,近年来对红树植
物内生菌化学成分的研究成为了天然产物化学的热
点之一 [ 1-5] 。我们课题组致力于中国南海红树林生
态系统中红树植物与其内源性微生物化学成分相关
性的研究[ 6-8] 。我们曾对半红树药用植物黄槿(Hi-
biscustiliaceus)代谢产物进行了研究[ 9] 。本论文对
从该植物中分离到的一株内生真菌(GT20036029)
的发酵物进行化学成分研究 ,从中分离并鉴定 9个
化合物 ,其中化合物 1为首次从海洋真菌代谢产物
中分离得到 ,并且首次对其波谱数据进行报道。
图 1　化合物 1
Fig.1　Compound1
1　材料与方法
1.1　仪器与试剂
PERKIN-ELMER 243B polarimeter旋 光 仪;
BrukerAvance-500 MHz-FT-NMR型核磁共振仪;英
DOI :10.16333/j.1001-6880.2007.06.019
国 VG-ZAB-HS高分辨反置双聚焦磁质谱仪;美国
ABI公司 QSTAR液质联用仪;Altech高效液相 ,
ODSC-18半制备柱 , 10 ×250 mm, 5 μm, UV检测 ,
流速 1.5 mL/min;薄层层析及柱层析硅胶(青岛海
洋化工厂);SephadexLH-20(Pharmacia公司);常用
显色剂为 10%硫酸 /乙醇及茴香醛 /浓硫酸溶液;其
它所用试剂均为分析纯。
1.2　菌种来源
菌株 GT20036029分离自海南半红树植物黄槿
的叶片。具体菌种尚在鉴定中 , 菌株保留在德国
Hans-Knöl-Institute天然产物研究室 。
1.3　培养基
采用 Casein-meatpeptone培养基。其中 Sucose
20.0g,大豆粉 10.0 g, cornsteep10.0 g, KCl8.0 g,
H2O1000 mL, pH调至 6.5。温度 22 ℃,转数 120
rpm,培养时间为 12 d,规模 200 L。
1.4　活性筛选细胞株
四种肿瘤细胞株包括 HL-60 (人白血病细胞)、
Jurkat(人白血病细胞)、IM9/Bcl-2 (人骨髓瘤细
胞)、Hela(人宫颈癌细胞)以及转染腺病毒 E1A基
因的人肾上皮细胞系 293细胞 ,由北京大学医学部
免疫学系提供。
2　提取与分离
真菌 GT20036029发酵液(200 L)减压浓缩后
得总浸膏 30 g,用水混悬后 ,依次用乙酸乙酯 、正丁
醇萃取 。乙酸乙酯部分(8.0 g)上硅胶柱 ,经氯仿 /
甲醇梯度洗脱(20:1 ～ 1:1)分成 A(4.0 g)、B(0.15
g)、C(0.3g)和 D(2.1g)四个部分。其中 A部分为
油状物 , TLC及 1HNMR测试结果表明该部分以脂
肪酸类化合物为主。 B部分通过硅胶柱色谱(氯仿 /
甲醇 10:1)、凝胶 SephadexLH-20柱(100%甲醇)和
HPLC(60%, MeOH/H2O)分离得到化合物 2(29
mg)、3(18mg)、4(8mg)、5(35mg)和 6(17mg)。C
部分通过硅胶柱色谱(氯仿 /甲醇 10:1)柱分段及凝
胶 SephadexLH-20(100%甲醇)纯化后分离得到化
合物 1(18 mg)、7(56mg)以及一些神经酰胺的混合
物 。正丁醇部分(1.2 g)通过硅胶柱色谱(氯仿 /甲
醇 3:1+0.1%醋酸)和 HPLC(65%, MeOH/H2O)分
离得到化合物 8(21 mg)、9(15mg)以及大量的常见
核苷类化合物。
3　结构鉴定
N-(2-羟基苯乙基)乙酰胺(1)　白色无定型粉
末;FABMS(positivemode)m/z:180.3[ M+H] +;
1HNMR(500MHz, DMSO-d6)δ:7.90(1H, s, NH),
7.02 (1H, t, J=8.0 Hz, H-4′), 7.00(1H, d, J=8.0
Hz, H-6′), 6.78 (1H, d, J=8.0 Hz, H-3′), 6.70
(1H, t, J=8.0 Hz, H-5′), 3.70 (2H, t, J=6.5 Hz,
H-1), 2.63 (2H, t, J=6.5 Hz, H-2), 1.78 (3H, s,
CH3);13CNMR(125 MHz, APT, DMSO-d6)δ:39.69
(t, C-1), 31.45 (t, C-2), 126.59 (s, C-1′), 157.00
(s, C-2′), 115.92 (d, C-3′), 131.25 (d, C-4′),
119.19 (d, C-5′), 128.31 (d, C-6′), 170.14 (s,
CO), 23.75 (q, CH3)。通过分析一维谱数据结合
HMBC以及 HMQC确定该化合物结构。
环(L-脯氨酸-D-异亮氨酸)(2)　白色粉末;
mp.161 ～ 163 ℃;[ α] 25D -88.1°(c0.59, EtOH);
FABMS(positivemode)m/z:211.3 [ M+H] +;1H
NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:4.11 (1H, d, J=7.0
Hz, H-5), 4.10 (1H, s, H-2), 3.36 (2H, m, H-8),
2.14, 1.79 (2H, m, H-6), 2.03 (1H, m, H-2′), 1.80
(2H, m, H-7), 1.30(2H, m, H-3′), 0.98(3H, d, J=
6.5 Hz, H-1′), 0.84 (3H, t, J=6.5 Hz, H-4′)。 13 C
NMR(125 MHz, APT, DMSO-d6)δ:171.22(s, C-1),
60.31 (d, C-2), 166.33 (s, C-4), 59.30 (d, C-5),
29.04 (t, C-6), 23.13 (t, C-7), 45.15 (t, C-8),
16.06 (q, C-1′), 35.97 (d, C-2′), 24.97 (t, C-3′),
13.37 (q, C-4′)。以上数据与文献 [ 10, 11]对照一致 。
环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)(3)　白色粉末;
FABMS(positivemode)m/z:211.3 [ M+H] +;
[ α] 25D-118.1°(c0.11, EtOH);1HNMR(500 MHz,
DMSO-d6)δ:4.12 (1H, t, J=7.0 Hz, H-5), 3.92
(1H, br, H-2), 3.40 (2H, m, H-8), 2.35, 2.13 (2H,
m, H-6), 1.76-1.87 (5H, m, H-7, H-1′, H-2′), 1.02
(3H, d, J=6.5Hz, H-3′), 0.84 (3H, d, J=6.5 Hz,
H-4′)。以上数据与文献 [ 11, 12]对照一致。
环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)(4)　白色无定型粉
末;FABMS(positivemode)m/z:211.3 [ M+H] +;
[ α] 25D-100.0°(c0.38, EtOH);1HNMR(500 MHz,
DMSO-d6)δ:4.15 (1H, t, J=8.0 Hz, H-5), 4.04
(1H, dd, J=9.5, 3.0 Hz, H-2), 3.59(2H, m, H-8),
2.38, 2.15 (2H, m, H-6), 1.56, 2.08 (2H, m, H-
1′), 1.94, 2.04 (2H, m, H-7), 1.76 (1H, m, H-2′),
1.02 (3H, d, J=6.5 Hz, H-3′), 0.97 (3H, d, J=6.5
Hz, H-4′);13 CNMR(125 MHz, APT, DMSO-d6)δ:
166.09(s, C-1), 53.31 (d, C-2), 170.08 (s, C-4),
957Vol.19 李莉娅等:南海半红树植物黄槿内源真菌 GT20036029代谢产物研究
58.96 (d, C-5), 28.10 (t, C-6), 22.73 (t, C-7),
45.50 (t, C-8), 38.55 (t, C-1′), 24.69 (d, C-2′),
23.31 (q, C-3′), 21.11 (q, C-4′)。以上数据与文
献 [ 11]一致 。
环(亮氨酸-酪氨酸 )(5)　白色无定型粉末;
FABMS(positivemode)m/z:277.3 [ M +H] +;
[ α] 25D +60.0°(c0.10, EtOH);1HNMR(500 MHz,
DMSO-d6)δ:6.90(2H, d, J=8.0Hz, H-3′, 7′), 6.65
(2H, d, J=8.0 Hz, H-4′, 6′), 4.07 (1H, t, J=4.0
Hz, H-2), 3.45 (1H, dd, J=9.0, 4.5 Hz, H-5), 3.01
(1H, dd, J=13.0, 3.0 Hz, H-1′a), 2.70 (1H, dd, J
=13.0, 5.0 Hz, H-1′b), 1.43 (1H, m, H-2″), 0.12,
0.76 (2H, m, H-1″), 0.66 (3H, d, J=6.0 Hz, H-
4″), 0.65(3H, d, J=6.0 Hz, H-3″);13CNMR(125
MHz, APT, DMSO-d6)δ:56.79 (d, C-2), 168.58 (s,
C-3), 53.36(d, C-5), 167.37(s, C-6), 38.81 (t, C-
1′), 126.99 (s, C-2′), 132.39 (d, C-3′, 7′), 115.95
(d, C-4′, 6′), 157.48 (s, C-5′), 44.84 (t, C-1″),
24.05(d, C-2″), 23.93 (q, C-3″), 22.47 (q, C-4″)。
以上数据与文献 [ 13]对照一致 ,从而确定结构 。
环(苯丙氨酸 -丝氨酸)(6)　白色无定型粉末;
FABMS(positivemode)m/z:235.4 [ M +H] +;
[ α] 25D-66.7°(c0.09, EtOH);1HNMR(500 MHz,
DMSO-d6)δ:8.03 (1H, s, NH), 7.91 (1H, s, NH),
7.28(2H, t, J=7.5 Hz, H-3′, 5′), 7.17 (2H, d, J=
7.5 Hz, H-2′, 6′), 7.22 (1H, t, J=7.5 Hz, H-4′),
4.04(1H, m, H-3), 3.65 (1H, m, H-6), 3.28, 2.83
(2H, m, CH2OH), 3.08 , 2.98 (2H, m, H-7);13C
NMR(125 MHz, APT, DMSO)δ:167.65 (s, C-2),
56.61 (d, C-3), 166.87 (s, C-5), 58.26 (d, C-6),
41.03 (t, C-7), 137.76 (s, C-1′), 131.10 (d, C-2′,
6′), 129.26 (d, C-3′, 5′), 127.65 (d, C-4′), 64.25
(t, CH2OH)。以上波谱数据与文献[ 14]对照一致 ,从
而确定结构 。
脑苷脂 B(7)　白色粉末;ESI-MS(positive
mode)m/z:728.3 [ M+H] +;1HNMR(500 MHz,
DMSO-d6)δ:5.58 (1H, m, H-5), 5.36 (1H, dd, J=
15.0, 6.5 Hz, H-4), 5.08 (1H, m, H-8), 4.13 (1H,
d, J=8.0Hz, H-1″), 3.96 (1H, m, H-3), 3.50, 3.92
(2H, m, H-1), 3.80(1H, m, H-2′), 3.79 (1H, m, H-
3), 3.65 (1H, dd, J=12.0, 10.0 Hz, H-6″a), 3.42
(1H, dd, J=12.0, 6.0 Hz, H-6″b), 3.20 (1H, m, H-
4″), 3.12(1H, t, J=7.5 Hz, H-3″), 3.08 (1H, m, H-
5″), 2.94 (1H, t, J=7.5Hz, H-2″), 1.96(2H, m, H-
7), 1.94 (2H, m, H-6), 1.53 (3H, s, CH3 ), 0.85
(6H, d, J=7.0 Hz, H-18, 16′);13CNMR(125 MHz,
APT, DMSO)δ:69.99 (t, C-1), 53.94 (d, C-2),
71.07 (d, C-3), 132.23 (d, C-4), 132.49 (d, C-5),
33.43 (t, C-6), 28.47 (t, C-7), 124.74 (d, C-8),
136.19(s, C-9), 16.97 (q, 9-CH3), 15.20 (q, 16′,
18-CH3), 175.07(s, C-1′), 72.20(d, C-2′), 104.67
(d, C-1″), 74.52 (d, C-2″), 77.54 (d, C-3″), 71.14
(d, C-4″), 78.04 (d, C-5″), 62.19 (t, C-6″)。以上
数据与文献[ 15]对照一致。
(25S)-纽替皂苷元 -3-O-α-L-鼠李糖-(1※2)-β-
D-葡萄糖苷(8)　白色粉末 ;[ α] 25D -85.4°(c1.77,
MeOH);ESI-MS(negativemode)m/z:737.4 [ M-
H] -;1HNMR(500 MHz, DMSO-d6 )δ:5.32 (1H,
brs, H-6), 4.30 (1H, m, H-16), 3.48(1H, m, H-3),
5.02 (1H, s, H-1″), 4.36 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1′),
1.10 (3H, d, H-6″), 0.72(3H, s, H-18), 0.95 (3H,
s, H-19), 0.89 (3H, d, J=12.0 Hz, H-21), 1.07
(3H, s, H-27);13CNMR(125 MHz, APT, DMSO)δ:
37.49 (t, C-1), 29.73 (t, C-2), 76.77 (d, C-3),
38.26 (t, C-4), 140.99 (s, C-5), 121.99 (d, C-6),
33.28 (t, C-7), 31.64 (d, C-8), 50.27 (d, C-9),
37.07 (s, C-10), 21.06(t, C-11), 39.79 (t, C-12),
39.79 (s, C-13), 56.36 (d, C-14), 32.17 (t, C-15),
80.70 (d, C-16), 62.16 (d, C-17), 16.57 (q, C-
18), 19.66 (q, C-19), 38.29 (d, C-20), 15.52 (q,
C-21), 119.99 (s, C-22), 32.17 (t, C-23), 33.08
(t, C-24), 85.05 (s, C-25), 69.52 (t, C-26), 24.35
(q, C-27), 98.81 (d, C-1′), 78.18 (d, C-2′), 77.04
(d, C-3′), 70.77 (d, C-4′), 77.13 (d, C-5′), 61.52
(t, C-6′), 100.76 (d, C-1″), 71.11 (d, C-2″), 71.02
(d, C-3″), 72.43 (d, C-4″), 68.59 (d, C-5″), 18.99
(q, C-6″)。以上数据与文献 [ 16]一致 。
(25S)-异纽替皂苷元 -3-O-α-L-鼠李糖 -(1※2)-
β-D-葡萄糖苷 (9)　白色粉末;[ α] 25D -97°(c1.68,
MeOH);ESI-MS(negativemode)m/z:737.4 [ M-
H] -;1HNMR(500 MHz, DMSO-d6 )δ:5.33 (1H,
brs, H-6), 4.27 (1H, m, H-16), 3.48(1H, m, H-3),
5.02 (1H, s, H-1″), 4.35 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1′),
1.10 (3H, d, H-6″), 0.74(3H, s, H-18), 0.96 (3H,
s, H-19), 0.96 (3H, d, J=12.0 Hz, H-21), 0.96
(3H, s, H-27);13CNMR(125 MHz, APT, DMSO)δ:
958 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.19
38.08 (t, C-1), 30.31 (t, C-2), 77.34 (d, C-3),
38.86 (t, C-4), 141.59 (s, C-5), 122.58 (d, C-6),
32.78 (t, C-7), 32.25 (d, C-8), 50.85 (d, C-9),
37.67 (s, C-10), 21.65 (t, C-11), 40.37 (t, C-12),
40.37 (s, C-13), 57.02(d, C-14), 32.78 (t, C-15),
81.64 (d, C-16), 63.12 (d, C-17), 17.30 (q, C-
18), 20.25 (q, C-19), 42.33 (d, C-20), 16.06 (q,
C-21), 109.87 (s, C-22), 27.97 (t, C-23), 33.75
(t, C-24), 66.19 (s, C-25), 69.69 (t, C-26), 27.75
(q, C-27), 99.38 (d, C-1′), 78.76 (d, C-2′), 77.71
(d, C-3′), 71.35 (d, C-4′), 77.64 (d, C-5′), 62.10
(t, C-6′), 101.35 (d, C-1″), 71.60 (d, C-2″), 71.70
(d, C-3″), 73.02 (d, C-4″), 69.18 (d, C-5″), 18.99
(q, C-6)。以上数据与文献 [ 16]一致 。
4　结果与讨论
对(25S)-纽替皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖-(1※2)-
β-D-葡萄糖苷进行肿瘤细胞生长抑制活性筛选 。该
化合物的浓度为 10 μg/mL时 , 对 HL-60、Jurkat、
IM9/Bcl-2和 Hela细胞在 4 h内有生长抑制作用 。
当浓度为 5μg/mL时(20 h),诱导 HL-60细胞凋亡
率为 80.8%, IM9/Bcl-2细胞凋亡率为 26.46%;当
浓度为 10 μg/mL时 (20 h), HL-60细胞凋亡率为
97.65%, IM9/Bcl-2细胞凋亡率为 48.09%。该化
合物还对转染腺病毒 E1A基因的人肾上皮细胞系
293细胞在 24 h内显示出很强的抑制细胞生长 、诱
导细胞凋亡作用 。而(25S)-异纽替皂苷元 -3-O-α-L-
鼠李糖 -(1※2)-β-D-葡萄糖苷对上述四种肿瘤细胞
生长无抑制活性 。提示螺环部分的结构可能为其活
性官能团。
本文对文献分析发现[ 11] ,含脯氨酸环二肽的旋
光方向取决于脯氨酸的绝对构型。当脯氨酸为 L
时 ,环二肽的旋光为负值;而当脯氨酸为 D时 ,环二
肽旋光为正值。另一氨基酸组分的构型仅影响旋光
值 ,但不影响旋光方向。如 L-脯氨酸 -L-X氨酸的旋
光值通常较 L-脯氨酸 -D-X氨酸偏大(脂肪侧链碳原
子需大于等于三个)。化合物 2的旋光实测值为-
88.1°(c0.59, EtOH),与 D-Ile-L-Pro接近 , (文献报
道为-109°(MeOH)), 而文献报道[ 11] L-Ile-L-Pro旋
光为-153°(EtOH)及 -171°(MeOH)。化合物 3和 4
为差向异构体 。两者的旋光均为负值 , 3的旋光值
([ α] 25D -118.1°(c0.11, EtOH))较 4([ α] 25D -100.0°
(c0.38, EtOH))大 ,推断化合物 3为环(L-亮氨酸-
L-脯氨酸),而化合物 4为环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)。
由于其它氨基酸形成的环二肽旋光结果没有规律可
循 ,故化合物 5和 6的立体化学待定。含 D型氨基
酸的环二肽在所发现的天然产物中不多见。文献报
道 LL型环二肽无抗菌活性 ,而 D型氨基酸形成的
环二肽具有一定的抗菌活性 。因此 ,进一步探讨红
树植物的内生微生物中环二肽的构型及其抗菌 、抗
炎活性的关系 ,对揭示宿主生物的化学生态关系具
有一定的意义 。
致谢:该研究得到了德国 Hans-Knöl-Institute天
然产物研究所(HKI)的工作人员以及北京大学医学
部免疫学系的大力支持 ,在此对他们表示衷心的感
谢!
参考文献
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(下转第 972页)
959Vol.19 李莉娅等:南海半红树植物黄槿内源真菌 GT20036029代谢产物研究
发新的抗癫痫生物药品 ,尤其是开发一些小分子的
脑源性活性物质 ,将具有良好的应用前景 。
在以 C18反相层析色谱分析 NPI-4-1氨基酸组
成时 ,与氨基酸参照标准比较 ,仅能显出 NPI-4-1的
氨基酸组成至少含有 Ser、Gly、Ala、Tyr、Val、Phe、
Lys7种氨基酸。对其完整结构的判断有待于进一
步的研究。
在研究神经细胞的增殖 ,活性及凋亡等方面 ,
PC12细胞因其结构与功能与多巴胺神经元相似而
广泛用于神经细胞药理 、毒理研究 [ 6] 。本实验中
NPI各纯化组分进行的 MTT试验显示 , NPI具有抑
制 PC12细胞生长的活性 ,且具有量效关系。与对
照 PHT-Na相比 ,效果更显著 。
通过 PTZ建立急性癫痫动物模型来对某些神
经细胞因子进行体内活性检测已经得到普遍应用和
认可[ 7] 。在癫痫小鼠行为观察中 ,由于轻微程度发
作较难统计 ,我们选择了中等程度发作(Ⅲ级)及严
重发作(Ⅳ级和Ⅴ级)作为观察及统计指标 。
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