全 文 ：第 29卷 第 2期
2008年 4月 　　　　　　　　　　
华南农业大学学报
JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity　　 　　　　　　　　
Vol.29, No.2
Apr.2008
　收稿日期:2007-05-18
　作者简介:张传利(1981—), 男 ,讲师 , 硕士 , 现在云南热带作物职业学院工作;　通讯作者:林良斌(1963— ), 男 , 教授 ,
E-mail:linliangbin-63@163.com
　基金项目:云南省自然科学基金(2004C0035M)
芝麻菜下胚轴原生质体的分离培养及再生植株
张传利1, 2 , 桂雪梅 1, 3 , 朱　媛1 , 刘雅婷 1 , 毛孝强1 , 林良斌 1
(1云南农业大学 农学与生物技术学院 , 云南 昆明 650201;2云南热带作物职业学院 ,
云南 普洱 665000;3云南普洱市种子管理站 ,云南 普洱 665000 )
摘要:以芝麻菜 ErucasativaMill无菌苗下胚轴为材料 ,研究了光照条件 、苗龄 、酶液组合 、酶解时间 、酶液中甘露醇
浓度及纯化条件对其原生质体分离制备的影响.以附加不同激素组合的改良 KM8p培养基进行液体浅层培养.结
果表明 , 无菌苗的下胚轴酶解 10 h, 用 “过滤 -离心 -漂浮法”进行纯化后 ,可高效分离出有活力的原生质体;在改
良的 KM8p培养基的进行原生质体培养 ,当密度为 7×104 mL-1时 ,分裂频率最高 , 为 24.8%.4周后形成大量的细
胞团和肉眼可见的小愈伤组织 ,植板率为 5.6%.然后转移到培养基上使其增殖 , 当愈伤组织长至 3 ～ 5 mm时 , 将
其转到分化培养基上诱导芽的分化 ,芽分化率为 33.6%.当芽长 2 ～ 3 cm时 , 将其切下插入生根培养基上诱导生
根 , 可获得完整植株.
关键词:芝麻菜;下胚轴;分离;原生质体培养;再生植株
中图分类号:Q942.5　　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-411X(2008)02-0063-06
PlantRegenerationandHypocotylProtoplastsIsolationofErucasativa
ZHANGChuan-li1, 2 , GUIXue-mei1, 3 , ZHUYuan1 , LIUYa-ting1 , MAOXiao-qiang1 , LINLiang-bin1
(1ColegeofAgronomyandBiotechnology, YunnanAgriculturalUniversity, Kunming650201, China;
2 YunnanVocationalCollegeofTropicalCrops, Pu er665000, China;
3YunnanPu erSeedsManagementStation, Pu er665000, China)
Abstract:ThehypocotylsfromasepticseedlingsofErucasativaMilwereusedasmaterialsforprotoplast
isolation.Theefectsofthelight, concentrationofmannitol, theseedlinggrowndays, combinationsof
diferentenzyme, digestingtime, themethodsofprotoplastpurification, onprotoplastisolationwerestud-
ied.TheprotoplastswereculturedinmodifiedKM8pmediumsupplementedwithdiferentphytohormone
by“thinliquidlayer” method.Theresultsshowedthattheprotoplastswithhigheryieldandqualitywere
obtainedbytreatingthehypocotylsfor10hwiththecombinationofenzyme.Thehypocotylswereappro-
priateforprotoplastsisolation.WhentheprotoplastswerecultivatedinthemodifiedKM8pmediumatthe
densityof7×104 mL-1 , thedivisionfrequencywasupto24.8%.Thesmalcalicouldbeobtainedin
fourweeks, andthentransferredtotheproliferationmedium, theplatingfrequencywasabout5.6%.
Caliof3-5mmindiameterweretransferedondiferentiationmedium, thefrequencyofshootregenera-
tionwas33.6%.Plantletswereobtainedupontransferring2-3 cmshootsto1 /2MSmediumwith0.5
mg/LIBA+0.2mg/L6-BA.
Keywords:Erucasativa;hypocotyls;isolation;protoplastculture;plantregeneration
　　芝麻菜 ErucasativaMil是十字花科 Cruciferae
芝麻菜属 Eruca一年生草本植物 ,是世界干旱半干旱
地区的重要油料作物 [ 1] ,也是迄今为止人们发现的
最为抗旱耐瘠的十字花科油料作物[ 2] .在我国北
方 ,尤其在西北干旱地区普遍种植.芝麻菜叶子可做
色拉用 ,种子富含对人体有益的 4-甲基硫代葡萄糖
苷(4-methylthiobutylglucosenolates)[ 3]和生产工业润
滑油原料棕榈油 [ 4] .芝麻菜具有抗旱 、耐瘠 、抗(耐)
病 、耐盐碱等优点 ,因此 ,芝麻菜是芸薹属油料作物
乃至整个十字花科植物育种的重要资源.朱媛等[ 5]
对芝麻菜与甘蓝型油菜远缘杂交亲和性进行了研
究 ,结果发现二者为高度不亲和.本研究以芝麻菜的
下胚轴为供体材料 ,对原生质体分离与培养条件进
行了研究 ,并获得了再生植株 ,为通过原生质体融合
利用芝麻菜的有益基因资源改良油菜品种提供了技
术支撑.
1　材料与方法
1.1　材料
芝麻菜 ErucasativaMil,由云南农业大学农学
与生物技术学院实验室提供.
1.2　方法
1.2.1　无菌苗体系的建立　选取籽粒饱满 、大小均
一的芝麻菜种子 ,在水中浸泡 1 h后 ,用 φ=70%乙
醇表面消毒 1 min,再用 1 g/LHgCl2溶液消毒 10
min左右 ,无菌水漂洗 4次 ,接种于不含激素的 B5固
体培养基上 [ 6] ,在不同温度和光照条件下萌发和生
长 ,光照度为 2 000 ～ 2 500 lx.
1.2.2　原生质体的游离与纯化　待芝麻菜无菌苗
长至 3 ～ 5cm时 ,取其下胚轴约 1 g,纵切成约 1 mm
大小的细条 ,置于附加 130 g/L甘露醇的 CPW盐溶
液(101 mg/LKNO3 , 27mg/LKH2PO4 , 246mg/LMg-
SO4· 7 H2O, 1 480 mg/LCaCl2· 2H2O)[ 7]中质壁分
离 1 h后 ,转移到盛有 10 mL酶液的直径 60 mm培
养皿中 , 在 25 ℃、黑暗 、静止条件下酶解 ,接着在
25 ℃恒温摇床上 45 r/min振荡游离 1 h,以分离原
生质体.酶液为 10g/L纤维素酶(onozukaR-10)+
7 g/L离析酶(onozukaR-10)+3 mmol/LMES+
CPW-9M(CPW+90 g/L甘露醇), pH5.6.将酶解
后的混合物用 300目的尼龙网过滤 ,滤液 500 r/min
离心5 min,收集原生质体并悬浮于洗涤液(附加 90
g/L甘露醇的 CPW盐溶液)中.用 CPW-18S(含 w
=18%蔗糖)悬浮原生质体 , 以 800 r/min离心 8
min.在溶液的界面用 Pasteur吸管将原生质体收集
于新的玻璃离心管 ,加入原生质体洗涤液 ,以 500 r/
min离心 5min.倒去上清液 ,按同样的方法用洗涤
液再洗 1次 ,培养液洗 1次 ,获得纯净的原生质体.
原生质体产量用血球计数板记数 ,原生质体活力测
定用 1g/L的伊文斯蓝染色检测 ,以未染色的原生质
体占原生质体观察总数的百分数表示.
1.2.3　原生质体的培养及愈伤组织的形成 　以改
良 KM8p培养基[ 8]为原生质体培养基 ,并附加 0.058
mol/L蔗糖 、0.055 mol/L葡萄糖 、0.32 mol/L甘露
醇 、3.0 mmol/LMES及不同浓度配比的激素 ,
pH5.8.采用液体浅层培养法 ,在直径为 60mm的培
养皿中 ,加入 2 mL的培养液 ,原生质体密度为 7×
10
4 mL-1 , (25±1)℃黑暗培养 ,每周加 0.5 mL新鲜
培养液.培养开始后每天观察原生质体的分裂和生
长状况.相对分裂频率以培养 8 d时发生分裂的原
生质体数占植板的存活原生质体总数的百分数表
示.培养 2周 ,原生质体分裂形成小细胞团 ,此时 ,加
入的新鲜培养基的渗透压稳定剂浓度要逐渐降低 ,
以便再生细胞壁的细胞生长.培养 4周左右 ,产生肉
眼可见的愈伤组织.然后将小愈伤组织转至增殖培
养基(B5:盐 +0.087mmol/L蔗糖 +0.2 mg/L2, 4-
D+0.5 mg/LNAA+0.2 mg/L6-BA+5 g/L琼脂 ,
pH5.8),在(26±1)℃、弱光(500 lx)、光照 16 h/d
增殖培养.
1.2.4　植株再生及生根 　待愈伤组织长至 3 ～
5 mm时 ,转移到分化培养基(MS:盐 +0.087 mol/L
蔗糖 +0.1 mg/LIAA+0.8 mg/L6-BA+7 g/L琼
脂 , pH5.8)中诱导不定芽分化.当不定芽长至
2 ～ 3 cm时将其切下 ,插入含有 0.5 mg/LIBA+0.2
mg/L6-BA的 1/2MS生根培养中诱导生根.
2　结果与分析
2.1　无菌苗的培养条件对原生质体产量和活力的
影响
2.1.1　萌发条件对原生质体分离效果的影响 　以
不同培养条件下获得的芝麻菜无菌苗的下胚轴为材
料分离制备原生质体 ,其原生质体产量 、活力均有差
异(图 1、表 1).
　　表 1的结果表明 ,芝麻菜原生质体产量和活力
以无菌苗在 15 ℃、黑暗培养 4 d后再转到光照(14
h/d)培养 6 d的最高 , 分别为 1.78 ×106 g-1和
87.2%,其培养细胞分裂频率也最高 ,为 24.2%.与
64 　　 华　南　农　业　大　学　学　报　　　 第 29卷　
Ⅰ :悬浮得到的原生质体;Ⅱ:刚分离出的原生质体 (×400);Ⅲ:细胞团(×400);Ⅳ:细胞粘连(×400);Ⅴ:小愈伤组织(×10);Ⅵ :愈伤组织
(×10);Ⅶ :愈伤组织增殖;Ⅷ 、Ⅸ :不定芽;Ⅹ :再生植株
I:aerosolobtainsprotoplast;II:protoplastsisolatedfromhypocotylsofErucasativa(×400);II:celclonies(×400);IV:celadhension(×400);V:cal-
lusformation(×10);Ⅵ :calus(×10);Ⅶ :protoplastmultiplication;Ⅷ andⅨ :regeneratedplantlet;Ⅹ :regeneratedplants
图 1　芝麻菜下胚轴原生质体分离培养及植株再生
Fig.1　PlantregenerationandhypocotylprotoplastsisolationofErucasativa
表 1　无菌苗萌发条件对原生质体活力和分裂的影响 1)
Tab.1　EffectofcultureconditionsofprotoplastisolationanddivisionofE.sativa
培养条件
culturecondition
产量
yield/(×106 g-1)
活力
viability/%
t第1次分裂
tthefirstdivision/d
分裂频率
divisionfrequency/%
25 ℃光照 10 d
25 ℃light10d 1.62 69.4 4 19.2
15 ℃黑暗 4d,然后 25℃光照 6 d
15 ℃ dark4 d, then25 ℃ light6 d 1.78 87.2 3 24.2
25 ℃黑暗 10 d
25 ℃ dark10d 0.64 53.8 6 11.8
　1)10 g/L纤维素酶 R-10+7 g/L离析酶 R-10+CPW-9M酶组合处理约 10 h
有光照的培养相比 ,直接在黑暗条件下培养的无菌
苗得到的原生质体产量和活力明显较低且在分离过
程中细胞很易破碎.这可能是由于不同材料 ,其种子
萌发和生长的条件不同而造成的.此外 ,在分离原生
质体前 ,无菌苗在 4 ℃下低温预处理 4 ～ 6h,分离出
的原生质体尽管产量没有变化 ,但原生质体活力较
高 ,更易于分离纯化.
2.1.2　苗龄对原生质体分离制备效果的影响 　从
表 2可以看出 5d无菌苗下胚轴的原生质体产量和
活力都很低 ,且细胞碎片较多 ,随着无菌苗苗龄的延
长 ,原生质体的产量和活力相应提高 , 10、11 d无菌
苗下胚轴原生质体活力(87.2%)与产量(1.82×106
g-1)分别达到最高 , 12d的无菌苗下胚轴原生质体
产量和活力开始下降.可见 ,在进行分离芝麻菜下胚
轴原生质体培养时 ,以 10 d无菌苗的下胚轴做分离
材料相对最佳.
表 2　苗龄对芝麻菜下胚轴原生质体解离的影响 1)
Tab.2　Theeffectsofhypocotylsageonprotoplastisolation
ofE.sativa
苗龄
seedlinggrowndays/d
原生质体产量 protoplast
yield/(×106g-1)
原生质体活力 protoplast
viability/%
5 0.39 52.2
7 0.88 67.3
9 1.65 78.4
10 1.78 87.2
11 1.82 81.6
12 1.72 76.7
　1)10 g/L纤维素酶 R-10+7g/L离析酶 R-10+CPW-9M酶组合处理约
10h
2.1.3　酶液中甘露醇质量浓度对原生质体分离效
果的影响　由表 3可知 ,随着酶液中甘露醇质量浓
度的升高(70 ～ 110g/L),原生质体的产量和活力都
有一定的增加.原生质体的产量在甘露醇质量浓度
65　第 2期 　　　　　张传利等:芝麻菜下胚轴原生质体的分离培养及再生植株 　　　
表 3　甘露醇质量浓度对芝麻菜下胚轴原生质体解离的影响 1)
Tab.3　Theeffectsofmannitolmassconcentrationonpro-
toplastisolationofE.sativa
ρ甘露醇
ρmannitol/(g·L-1)
原生质体产量 protoplast
yield/(×106g-1)
原生质体活力
protoplastviability/%
原生质体形态
protoplastshape
70 0.84 56.3 胀大或破裂
80 1.67 72.2 稍微膨胀
90 1.76 86.9 正常
100 1.82 83.4 正常
110 1.86 79.5 稍微收缩
120 1.68 68.6 收缩
　1)10g/L纤维素酶 R-10+7g/L离析酶 R-10酶组合处理约 10h,苗龄为 10d
为 110g/L时 ,达到 1.86×106 g-1 ,活力在甘露醇质
量浓度为 90 g/L时达到最高(86.9%).而当甘露醇
质量浓度到 120g/L时 ,分离的原生质体活力和分裂
频率都降低.表明较高的酶液渗透压可对芝麻菜下
胚轴原生质体造成明显伤害.此外 ,当甘露醇质量浓
度在 70 g/L以下时 ,较多细胞胀大或膨胀破裂 ,造成
产量和活力较低.综合考虑原生质体产量和活力 ,认
为甘露醇质量浓度为 90 g/L时分离制备下胚轴原生
质体较适宜.
2.1.4　酶类组合对芝麻菜下胚轴原生质体分离效
果的影响　不同酶组合 、不同酶解时间 ,分离制备原
生质体的效果不同(表 4).不同酶液配比对原生质
体分离有明显影响 ,随着纤维素酶和离析酶的浓度
升高 ,原生质体产量增加 ,尤其是增加离析酶的量 ,
原生质体产量增加明显.工作酶液中纤维素酶质量
浓度为 10g/L、离析酶质量浓度为 7g/L,酶解 10h,
分离制备原生质体的效果较理想 ,产量为 1.78 ×
10
6 g-1 ,活力为 87.2%.这与范春丽等 [ 9]在甘蓝型
黄籽油菜原生质体的游离中的结果一致.
表 4　不同酶组合对芝麻菜下胚轴原生质体分离的影响 1)
Tab.4　Theeffectsofdifferentenzymecombinationoniso-
lationE.sativa
ρ纤维素酶
ρcelluase/(g·L-1)
ρ离析酶
ρmacerozyme/(g·L-1)
t酶解
tenzymolysis/h
产量
yield/(×106g-1)
活力
viability/%
6 3 15 0.98 73.8
8 5 13 1.49 80.3
10 5 11 1.51 85.9
10 7 10 1.78 87.2
12 7 9 1.82 83.5
14 7 8 1.63 72.6
　1)苗龄 10 d,甘露醇质量浓度为 90g/L渗透压时处理 10h的结果
2.1.5　纯化条件对原生质体活力的影响 　对芝麻
菜下胚轴游离出的原生质体采用过滤 -离心 -漂浮
法进行纯化 ,采用不同质量浓度的蔗糖溶液对原生
质体进行漂浮 ,并采用不同的离心速度离心来纯化.
用 180g/L的蔗糖漂浮效果相对较好 ,离心速度为
1 000 r/min时 ,原生质体破裂得较多 ,有活力的原生
质体少 , 500 r/min离心时 ,形成的界面不明显 ,漂浮
的原生质体少 , 800 r/min离心较好.可见 , 180 g/L
的蔗糖溶液 、800 r/min的离心速度对原生质体进行
纯化 ,杂质较少 ,原生质体破裂得少 ,得到较好的纯
化效果(表 5).
表 5　纯化条件对原生质体活力的影响 1)
Tab.5　Theeffectsofpurifyconditiononprotoplastviabili-
ty
ρ蔗糖
ρsucrose/(g· L-1)
离心速度
centrifugalization/(r· min-1)
活力
viability/%
180 1000 59.5
180 800 87.4
180 500 56.7
210 1000 58.2
210 800 87.2
210 500 54.6
　1)10 g/L纤维素酶 R-10+7 g/L离析酶 R-10 +CPW-
9M酶组合处理约 10 h,苗龄为 10 d
2.1.6　酶解时间对原生质体分离制备的影响 　比
较了酶解 8 ～ 12h对于芝麻菜下胚轴原生质体的解
离效果(表 6),酶解时间在 8 ～ 11 h范围内 ,随酶解
时间的增加 ,原生质体产量提高 ,酶解 11h原生质体
产量可达 1.81×106 g-1 ,继续增加酶解时间原生质
体产量下降 ,同时可以观察到酶液中原生质体碎片
增多.可见长时间酶解可以导致原生质体解体.长
时间的酶解对原生质体活力也会造成不利影响 ,酶
解时间为 9 ～ 11h所得到原生质体的活力相近 ,再继
续增加酶解时间原生质体活力则下降.综合考虑原
生质体产量和活力 2个因素 ,酶解 10 h分离芝麻菜
下胚轴原生质体效果较好.
表 6　酶解时间对芝麻菜下胚轴原生质体游离的影响 1)
Tab.6　Theeffectsofenzymolysistimeonprotoplastisola-
tion
t酶解
tdigestionwithenzyme/h
产量
yield/(×106g-1)
活力
viability/%
8 1.38 78.6
9 1.72 86.4
10 1.78 87.2
11 1.81 85.8
12 1.68 76.9
　1)10 g/L%纤维素酶 R-10+7 g/L离析酶 R-10+CPW
-9M酶组合处理约 10 h,苗龄为 10 d
66 　　 华　南　农　业　大　学　学　报　　　 第 29卷　
2.2　芝麻菜原生质体培养
2.2.1　培养密度对芝麻菜下胚轴原生质体培养的
影响　在芝麻菜下胚轴原生质体培养中 ,培养密度
对原生质体的分裂频率影响很大(表 7).培养密度
为 7×104 mL-1效果较好 ,分裂频率达 23.2%,植板
率达 5.1%.当培养密度为 3×104 mL-1 ,原生质体
开始分裂的时间较长且分裂频率较低.当培养密度
低至 1×104 mL-1 ,不能形成愈伤组织.当细胞培养
密度过大时 ,尽管细胞开始分裂较早 、频率较高 ,却
易导致细胞聚集 、粘连 ,影响细胞进一步分裂 ,最后
导致褐化死亡.
表 7　培养密度对芝麻菜下胚轴原生质体分裂的影响 1)
Tab.7　Effectsofdifferentculturedensityonthecelldivi-
sionandcolonyformationofE.sativa
培养密度
densityofculture
/(×104mL-1)
t第1次分裂
tthefirstdivision/d
分裂频率
division
frequency/%
植板率
plating
efficiency/%
褐化
browning
1 6 3.2 0.0 无
3 4 15.6 2.6 无
5 3 22.4 4.7 较少
7 3 23.2 5.1 较少
10 3 26.5 3.8 较明显
20 3 21.9 0.0 明显
　1)10g/L纤维素酶 R-10 +7 g/L离析酶 R-10+CPW-9M酶组合处理约 10h, 苗龄为
10 d
2.2.2　植物激素对原生质体分裂的影响 　在芝麻
菜下胚轴原生质体培养中 ,培养基中不同的激素组
合和浓度对细胞分裂有很大的影响(表 8).从表 8
可知 , 1.0mg/L2, 4-D+1.0mg/LNAA+0.5 mg/L
6-BA效果最好 ,分裂频率高达 24.8%.培养基中
不含 NAA对细胞分裂的频率影响不大 ,但在不含 2,
4-D的培养基中 ,细胞分裂的频率较低(4.9%),且
持续分裂形成小细胞团的能力也较差.单独使用 2,
4-D时分裂频率较好 ,且随着 2, 4-D质量浓度
(0.5 ～ 1.5 mg/L)升高 ,细胞分裂频率也相应增高
(18.8% ～ 22.8%),但植板率下降(4.8% ～ 2.3%),
这就要求在形成细胞团或小愈伤组织时要降低 2, 4
-D的浓度.而在不含 6-BA的培养基中分裂频率
都较低 ,因此 ,在芝麻菜下胚轴原生质体培养中所用
激素必须是生长素(含 2, 4-D)和细胞分裂素按一
定比例的组合.
2.3　原生质体的早期分裂
用改良的 KM8p培养基进行液体浅层培养 ,原
生质体在培养 1d后 ,体积明显增大 ,有的呈椭圆形 ,
表 8　激素对芝麻菜下胚轴原生质体分裂的影响 1)
Tab.8　Effectofplanthormoneonthecelldivisionofhypo-
cotylprotoplastsfromE.sativa
ρ激素
ρhormones/(mg· L-1)
2, 4-D NAA 6-BA
t第1次分裂
tthefirstdivision/d
分裂频率
division
frequency/%
植板率
plating
eficiency/%
0.5 0 0 5 18.8 4.8
0.5 0.5 0.5 4 16.4 2.3
0.5 1.0 0.5 3 17.5 3.1
0 1.0 0.5 6 4.9 1.2
1.0 0 0 4 19.6 3.9
1.0 0.5 0.5 4 21.2 4.7
1.0 1.0 0.5 3 24.8 5.6
1.0 1.0 0 4 8.5 0.8
1.0 0 0.5 4 20.6 4.2
1.5 0 0 4 22.8 2.3
1.5 0.5 0.5 3 20.7 3.8
1.5 1.0 0.5 3 17.3 3.3
　1)培养以改良的KM8p为培养基 ,培养密度为 7×104 mL-1
2 d后大多数原生质体变成椭圆形.在培养 3 d后发
生第 1次细胞分裂 , 6 ～ 7 d后 ,群体的第 1次细胞分
裂达到高峰.4 d后出现第 2次分裂 , 2周后形成小
细胞团(图 1Ⅲ).试验中观察到 ,胞质较浓的细胞比
胞质稀少的细胞容易发生分裂和形成愈伤组织 ,且
在培养过程中发现经常发生集聚 、粘连(图 1Ⅳ)而
沉降于培养皿底部 ,因此 ,在培养过程中要每天定时
缓慢摇动 2 ～ 3次.
2.4　愈伤组织的形成及植株再生
培养 2周 ,原生质体分裂形成小细胞团后 ,继续
培养至 4周左右 ,原生质体可增殖形成肉眼可见的
小愈伤组织(图 1Ⅴ、Ⅵ ).然后将 1 ～ 2mm愈伤组织
转至增殖培养基上增殖培养 ,待愈伤组织长至 3 ～ 5
mm时(图 1Ⅶ ),将其转移到分化培养基中诱导不定
芽分化 , 1周后出现绿点 , 2周左右分化出不定芽(图
1Ⅷ ),分化频率为 32.8%.当不定芽长至 2 ～ 3 cm
(图 1Ⅸ )时将其切下 ,插入含有 0.5 mg/LIBA+0.2
mg/L6-BA的 1/2 MS生根培养基上 , 12 d后即可
形成再生植株(图 1Ⅹ ),生根率达 81%.
3　讨论与结论
3.1　起始材料的生理状态对芝麻菜下胚轴原生质
体分离的影响
　　起始材料的生理状态对分离的芝麻菜下胚轴原
生质体活力及培养的分裂频率有很大的影响:黑暗
67　第 2期 　　　　　张传利等:芝麻菜下胚轴原生质体的分离培养及再生植株 　　　
条件下培养的黄化苗分离制备的原生质体的分裂频
率 (11.8%)不 到 光 照条 件 下 无 菌苗 的 1/2
(24.2%),可见光照可使原生质体的分裂频率有很
大的提高 ,程振东等 [ 10]以甘蓝型油菜下胚轴作材料
进行培养也观察到类似的现象.制备原生质体前对
材料进行低温处理也有利于获得高活力和高分裂频
率的原生质体 ,本试验结果与他人在其他植物原生
质体培养中的结果相一致 [ 11-12] .
3.2　芝麻菜下胚轴原生质体分离过程中的影响
因素
　　在工作酶液中 ,增加离析酶的浓度可提高原生
质体的产量且高于增加纤维素酶浓度的效果 ,但对
原生质体的活力影响不大.这与刘选明等[ 13]在油菜
中的研究结果有差异.用蔗糖漂浮法纯化原生质体
时 ,蔗糖浓度 、离心速度和时间是影响纯化的关键因
素 ,直接影响原生质体的稳定性 ,试验表明 ,用 CPW
-18S(含 180 g/L蔗糖 )、pH5.8、 800 r/min离心
8 min,可以有效地使原生质体集中在离心管的最上
部 ,获得纯净的原生质体并便于收集.
3.3　激素对芝麻菜下胚轴原生质体培养的影响
原生质体培养基中 ,不同的激素组合和配比影
响着原生质体的持续分裂和愈伤组织的形成.本试
验表明 ,在无 2, 4-D或 6-BA的培养基上 ,细胞分
裂的频率都较低 ,且持续分裂的能力差.虽然单独的
2, 4-D就可以诱导细胞的分裂 , 并且随着浓度升
高 ,细胞分裂频率增高.但 2, 4-D浓度过高又会抑
制细胞的分裂和植板率.因此 ,在芝麻菜下胚轴原生
质体培养中生长素和细胞分裂素配合使用才对细胞
分裂起最佳的效果.
3.4　继代培养是芝麻菜下胚轴原生质体培养所必
需的
　　原生质体培养得到的小愈伤组织如不经增殖而
直接转移到固体分化培养基上培养 ,会造成愈伤组
织褐化死亡.说明愈伤组织的早期继代培养是必需
的.这与其他报道一致[ 14-15] .经几次继代 ,要及时将
大小适中(3 ～ 5 mm)的愈伤组织转移到分化培养基
中 ,转移太晚 ,愈伤组织会失去分化能力而褐化死
亡.当愈伤组织转移到分化培养基后 ,一部分愈伤组
织转变为致密的绿色组织 ,也能产生绿色芽点 ,但很
难分化出不定芽.只有颜色淡黄绿色 、表面呈颗粒状
的愈伤组织长出绿色芽点后才进一步分化出芽.
参考文献:
[ 1] 　孙万仓 ,官春云 , 李恂 , 等.芸芥(ErucasativaMil1.)与
芸薹属(BrassicaL.)3个油用种的远缘杂交 [ J] .作物
学报 , 2005, 31(1):36-42.
[ 2] 　杨玉萍.我国芸芥的分布区域和品质特性及研究价值
[ J] .甘肃农业科技 , 2001, 21(7):354-358.
[ 3] 　IONR, BEMADIR, GUEYRARDD, etal.Formationof
glucoraphaninbychemoselectiveoxidationofnaturalglu-
coerucin:Achemoenzymaticroutetosulforaphane[ J] .
Bio-ChemicalLetter, 1999, 9:1047-1048.
[ 4] 　KUMARPR, TSUNODAS.Variationinoilcontentand
fattyacidcompositionamongseedsfromCruciferae[ M] ∥
Anon.Brassicacropsandwildalies.Tokyo:JapanScien-
tificSocietiesPress, 1980:235-252.
[ 5] 　朱媛 , 林良斌 , 张传利.甘蓝型油菜与芝麻菜远缘杂交
研究 [ J] .云南农业大学学报 , 2007, 22(1):26-29.
[ 6] 　张传利 , 林良斌.芝麻菜愈伤组织的诱导及植株再生
[ J] .云南农业大学学报 , 2006, 21(5):560-564.
[ 7] 　FREARSONEM, POUERJB, COCKINGEC.Theiso-
lation, cultureandregenerationofPetunialeafprotoplast
[ J] .DevBiol, 1973, 33:130-137.
[ 8] 　KAOKN, MICKAYLUKMR.Nutritionalrequirements
forgrowthViciahajastanacelsandprotoplastsatavery
lowpopulationdensityinliquidmedia[ J] .Planta, 1975,
126:105-110.
[ 9] 　范春丽 , 陶澜 ,林呐 , 等.甘蓝型黄籽油菜原生质体的游
离和纯化 [ J] .中国农学通报 , 2005, 21(2):43-45.
[ 10] 程振东 ,卫志明 , 许智宏.甘蓝型油菜下胚轴原生质体
培养的研究生物工程学报 [ J] .1994, 10(1):30-33.
[ 11] 周云罗 ,钱迎倩 , 蔡起贵.龙胆叶原生质体再生愈伤组
织的研究 [ J] .植物学报 , 1985, 27(2):149-150.
[ 12] 周音 ,钟维瑾 , 张智奇.单双低油菜原生质体培养高效
成株体系的研究 [ J] .吉林农业大学学报 , 1994, 16(4):
77-81.
[ 13] 刘选明 ,官春云.油菜原生质体培养与融合技术的研究
进展 [ J] .湖南农业大学学报 , 1997, 23(5):483-491.
[ 14] 周邗扬 ,佘建明 , 陆维忠.甘蓝型油菜原生质体培养获
得再生植株的研究 [ J] .作物学报 , 1991, 17(5):340-
344.
[ 15] 孟征 ,李世君 , 李德葆.甘蓝型油菜子叶原生质体培养
再生植株 [ J] .浙江农业大学学报 , 1993, 19(4):395-
398.
【责任编辑　周志红】
68 　　 华　南　农　业　大　学　学　报　　　 第 29卷