全 文 ：实 验 研 究
毛脉酸模无菌苗的制备及下胚轴愈伤
组织诱导的研究
谢彦梅，许岩，常丰华，沈剑，王振月
(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的:建立制备毛脉酸模无菌苗及下胚轴愈伤组织诱导方法。方法:通过摩擦种皮、种子浸泡时
间、消毒次数、消毒剂种类、消毒时间以及种子贮存时间等因素研究对种子发芽的影响，探讨建立无菌苗
培养体系的最佳方法;以获得的无菌苗的下胚轴为外植体，通过在 MS 基本培养基中附加 6 － BA 和 2，
4 － D两种激素不同配比筛选诱导愈伤组织的最优培养基配方。结果:制备毛脉酸模无菌苗的方法为:
挑选粒大饱满的新种子，120 目砂纸摩擦种皮，蒸馏水浸泡 24h，75%酒精中浸 2min，无菌水冲洗 3 次，
10%NaClO溶液处理 10min，无菌水冲洗 5 次，将其放置在有两层湿润的无菌滤纸的培养皿中 10h，再进
行第 2 次消毒，10%NaClO溶液处理 8min，无菌水冲洗 5 次，在无激素的 MS 培养基中培养即可获得大
量无菌苗;下胚轴愈伤组织诱导的最优培养基为 MS + 3． 0mg /L 6 － BA + 1． 7mg /L 2，4 － D。结论:建立
了毛脉酸模无菌苗培养体系，得到下胚轴愈伤组织诱导的最优培养基，为将来进一步研究奠定基础。
关键词:毛脉酸模;无菌苗;下胚轴;愈伤组织
中图分类号:R28 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2406(2012)02 － 0098 － 03
Aseptic Seedling Preparation and Induction of Callus from
Hypocotyl for Rumex Gmelini
XIE Yan － mei，XU Yan，CHANG Feng － hua，SHEN Jian，WANG Zhen － yue
(Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
Abstract:Objective:To obtain the methods of aseptic seedling preparation for Rumex gmelini and get the cal-
lus from hypocotyl for Rumex gmelini． Methods:Friction seed coat，soaking time，sterilization times，disin-
fectant type，sterilization time and storage duration were studied to find out the best sterilization method for a-
septic seedling． With the hypocotyls of the aseptic seedlings from Rumex gmelini seeds as explants，the opti-
mum medium was screened by adding different hormone (6 － BA，2，4 － D)proportions into MS basic medi-
um． Results:The best germicidal treatment was as follows:The seed coats of good and new seeds from Rumex
gmelini were rubbed with 120 eye sandpaper． The treated seeds were ducked in distilled water for 24h，then
were soaked in 75% alcohol for 2 min，washed by sterile water for 3 times，then soaked in 10% sodium hypo-
chlorite solution for 10 min，washed by sterile water for 5 times． The treated seeds were placed in a sterile en-
vironment for 10h，then soaked in 10% sodium hypochlorite solution for 8 min，washed by sterile water for 5
times． Finally the seeds were cultured at MS basic medium to get the aseptic seedling． The optimum medium
was MS + 3． 0 mg /L 6 － BA +1． 7mg /L 2，4 － D． Conclusion:The study has laid a foundation for the further
research on that tissue for active ingredients．
Key words:Rumex gmelini Turcz．;Aseptic seedling;Hypocotyl;Callus
基金项目:国家自然科学基金项目(30970300)
作者简介:谢彦梅(1985 －) ，女，黑龙江中医药大学 05 级七年制学生。
通讯作者:王振月(1956 －) ，男，教授，硕士研究生导师，主要从事中药资源开发与生物技术研究。
收稿日期:2011 － 09 － 21
修回日期:2011 － 10 － 15
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中 医 药 信 息
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2012 年第 29 卷第 2 期
Vol. 29，No. 2，2012
毛脉酸模(Rumex gmelini Turcz．)为蓼科酸模属
植物，民间以根及根茎入药，以治疗淋病、癣病、疮毒、
止血、肿瘤和调血脂等著称［1］。其根中富含白藜芦醇
及白藜芦醇苷、酸模素、大黄酚、大黄素等化合物［2 － 5］。
利用植物组织培养生产次生代谢产物具有保护植物资
源、生产周期短、不受地区和季节限制、利于生物转化，
寻找新的有效药物成分等优点［6］。但毛脉酸模组织培
养时，盆栽的毛脉酸模幼苗发芽率低、生长周期长、幼
苗较嫩，进行外植体消毒时易于脱水，失去活力不利于
诱导愈伤组织、丛生芽等。从无菌苗得到的外植体不
需消毒，外植体活力较高，所以笔者研究毛脉酸模无菌
苗的制备，并比较了不同激素种类或组合对毛脉酸模
下胚轴愈伤组织诱导的影响，旨在为今后的组织培养
奠定基础。
1 材料与试剂
毛脉酸模种子采自黑龙江中医药大学药用植物
园。表面消毒剂选用 75%的酒精、0． 1%的 HgCl2溶液
和 NaClO 溶液。NaClO 溶液原液(有效氯≥10． 0%)
购自天津市进丰化工有限公司。
2 方法
2． 1 摩擦种皮对种子发芽的影响
挑选粒大饱满的种子，用 120 目砂纸摩擦去掉种
皮，蒸馏水浸泡 24h，第 1 次消毒时种子在 75%的酒精
中浸 2min，再将其用 10%NaClO溶液处理 10min，放置
在带有两层湿润的无菌滤纸的培养皿中 10h，再进行
第 2 次消毒，用 10% NaClO 溶液处理 8min，无菌水冲
洗 5 次后，无菌滤纸吸干表面水分，接种于培养基(MS
+3%蔗糖 + 0． 9%琼脂)中，每皿接种种子 20 粒，置于
光照恒温培养箱中培养，培养温度(25 ± 2)℃，光照
14h /d，光照强度 1 500 ～ 2 000Lx。观察初始发芽时
间，每 2 天调查 1 次材料污染情况，培养 10 天后统计
污染率和发芽率。以不去种皮的种子为对照。
2． 2 不同浸泡时间和消毒次数对种子消毒效果的
影响
挑选粒大饱满的种子，120 目砂纸摩擦去掉种皮，
分别用蒸馏水浸泡 0、12h、24h、36h后进行消毒。第一
次消毒后每组分别取出一半的种子培养，另一半进行
第 2 次消毒。具体消毒、培养和统计方法如 2． 1。
2． 3 消毒剂种类与消毒时间对种子消毒效果的影响
挑选粒大饱满的种子摩擦去皮浸泡 24h，将其用
75%的酒精浸泡 2min后分成四组，分别用 10% NaClO
溶液处理 10min、15min;0． 1% 的 HgCl2 溶液处理
5min、7min。消毒后分别放置在带有两层湿润的无菌
滤纸的培养皿中 10h，进行第 2 次消毒，每组较第 1 次
的消毒时间减 2min。具体消毒、培养和统计方法如
2． 1。
2． 4 贮存时间对种子发芽的影响
将新种子和贮存一年、两年的种子按 2． 1 的方法
消毒、培养和统计。
2． 5 下胚轴诱导愈伤组织
用接种刀将无菌苗的下胚轴切割，接种到不同激
素浓度的 MS 培养基上，进行愈伤组织的诱导培养。
实验重复 3 次。培养 30 天观察统计愈伤组织的生长
状况。
3 结果与分析
3． 1 摩擦种皮
种子经砂纸摩擦、浸泡、消毒、培养一段时间后的
结果如表 1 所示，种子发芽时间、污染率和发芽率都与
未处理的种子差异明显。摩擦处理的种子 1 天就开始
发芽，无污染，发芽率达到了 81． 8%。种皮障碍是毛
脉酸模种子发芽率低的主要原因之一。毛脉酸模种子
种皮坚硬，硬实种子可采用多种方法损伤种皮，以达到
促进萌发的目的，如温度处理、切除种皮、碾磨擦伤种
皮、浓硫酸腐蚀种皮、有机溶剂浸渍去除种皮上的脂类
物质等［7］。本实验采用摩擦种皮的方法使发芽率得
到显著提高。
表 1 摩擦种皮对种子发芽的影响
处理方法 开始发芽时间(天) 污染率(%) 发芽率(%)
未处理种子 4 25． 4 15． 2
摩擦种皮 1 0 81． 8
3． 2 浸泡时间和消毒次数对消毒效果的影响
浸泡时间和消毒次数对消毒效果的影响如表 2 所
示。通过不同浸泡时间和消毒次数对种子处理后，观
察统计结果表明，经过两次消毒的种子与一次消毒的
种子相比污染率明显降低，初始发芽时间和发芽率没
有明显差异，控制污染是组培过程中的首要技术［8］，
所以选择两次消毒是比较合理的。浸泡 24h的种子发
芽率明显高于未浸泡和浸泡 12h、36h 的种子，说明种
子浸泡 24h是适合萌发的最佳条件。
表 2 浸泡时间和消毒次数对消毒效果的影响
浸泡时间
(h)
消毒次数
开始发芽
时间(天)
污染率
(%)
发芽率
(%)
0
1 2 10． 5 47． 0
2 2 2． 0 64． 6
12
1 2 10． 0 67． 7
2 2 0 65． 1
24
1 0 100． 0 0
2 1 0 81． 8
36
1 0 100． 0 0
2 1 8． 0 65． 3
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3． 3 最佳消毒剂和消毒时间的选择
表 3 所示，10% NaClO 溶液作为毛脉酸模种子的
消毒剂时消毒效果最好，其成苗率优于 0． 1% HgCl2溶
液消毒法。10%NaClO溶液浸种 10min 与 15min 消毒
效果相比较，消毒 10min的种子开始发芽时间短，发芽
率相对较高，效果明显。
表 3 不同消毒剂和消毒时间效果比较
消毒剂种类
第 1 次消毒
时间(min)
开始发芽
时间(天)
污染率
(%)
发芽率
(%)
10%NaClO溶液
10 1 0 81． 8
15 2 0 80． 0
0． 1%HgCl2溶液
5 4 0 47． 8
7 4 0 47． 2
3． 4 种子贮存时间对发芽的影响
分别取不同贮存时间的种子研究对比，结果如表
4，种子贮存时间越长，开始萌发时间越晚，发芽率越
低。可能是因为种子随着贮存时间的增长，活力开始
下降。说明组织培养最好用当年新采收的种子。
表 4 贮存时间对发芽的影响
贮存时间 开始发芽时间(天) 污染率(%) 发芽率(%)
当年 1 0 81． 8
一年 3 0 23． 9
两年 5 0 20． 0
3． 5 不同浓度激素组合对毛脉酸模愈伤组织发生的
影响 见表 5。
表 5 6 － BA和 2，4 － D配比对下胚轴愈伤组织诱导的影响
6 － BA
(mg /L)
2，4 － D
(mg /L)
诱导率
(%)
愈伤组织生长状态
3． 0 0． 7 0． 1 绿色，干燥，致密
3． 0 1． 0 0． 1 黄绿色，致密
3． 0 1． 5 80． 0 淡黄绿色，疏松
3． 0 2． 0 33． 3 黄绿色，疏松，湿软
3． 0 3． 0 33． 3 淡黄绿色，疏松
3． 0 1． 7 100． 0 淡黄色，疏松，颗粒状
2． 5 3． 0 80． 0 淡黄色，湿软
2． 0 2． 0 40． 0 淡黄色，疏松
2． 0 1． 5 20． 0 黄色，疏松
观察表明，下胚轴接种 10 天后，有的培养基上开
始形成愈伤组织。由表 5 可见，当激素 6 － BA 浓度不
变时，激素 2，4 － D浓度在 1． 5 ～ 3 mg /L 范围内，愈伤
组织诱导率较高。观察统计表明，6 － BA 浓度为 3．
0mg /L、2，4 － D 浓度为 1． 7mg /L 配合使用时，不仅愈
伤组织的诱导率为 100%，而且愈伤组织的生长速度
快，长势好。初期诱导形成的愈伤组织为半透明淡黄
色，随着培养时间的延长，伴随着愈伤组织的生长，逐
渐形成颗粒状、质地疏松的愈伤组织。一般认为，这种
愈伤组织为具有分化能力的愈伤组织［9 － 10］。综合考
虑，MS +3． 0mg /L 6 － BA + 1． 7mg /L 2，4 － D 的激素
组合是下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基，该培养基
诱导形成的愈伤组织可以为未来愈伤组织形成再生植
株和悬浮细胞的培养提供大量的材料。
4 小结与讨论
笔者系统研究了建立毛脉酸模无菌苗培养体系的
最佳方法、下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基。获得
毛脉酸模无菌苗的方法是:挑选粒大饱满的新种子，
120 目砂纸摩擦种皮，蒸馏水浸泡 24h，在 75%酒精中
浸 2min，无菌水冲洗 3 次，再将其用 10% NaClO 溶液
处理 10min，无菌水冲洗 5 次，将其放置在有两层湿润
的无菌滤纸的培养皿中 10h，再进行第二次消毒，用
10%NaClO溶液处理 8min，无菌水冲洗 5 次，再将其在
无激素的 MS 培养基中培养即可获得大量无菌苗;下
胚轴愈伤组织诱导的最优培养基为 MS +3． 0mg /L 6 －
BA +1． 7mg /L 2，4 － D。消毒是植物组织培养中无菌
苗培养的首要工作，而 NaClO、HgCl2是常用的两种消
毒剂，本实验 0． 1% HgCl2溶液处理后的无菌苗虽然无
污染，但发芽时间长，发芽率低，可能 0． 1% HgCl2对毛
脉酸模种子有较强的毒害作用，从而抑制其萌发［11］。
汞胁迫对毛脉酸模种子生长发育有抑制作用，查阅文
献［12］发现，其机理可能是重金属元素 Hg 对植物体内
酶活性有影响，根据这一现象推测毛脉酸模可能作为
汞胁迫的指示植物。从无菌苗上获得的组织器官作为
外植体进行愈伤组织、丛生芽诱导时无需消毒，活力
高。从笔者前期实验研究对比发现，诱导率明显提高，
愈伤组织长势好，可以为悬浮细胞培养提供大量的材
料，为今后内生真菌与细胞或者组培苗相互作用，可能
产生有效药物成分奠定基础。
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