全 文 ：油柿下胚轴再生植株的培养
谢启鑫,庄东红 *,吴奕恒
(汕头大学生物系,广东汕头 515063)
摘 要:以油柿下胚轴为材料进行了不定芽再生和再生苗生根的研究,旨在建立油柿的离体再生体系,为转基因操
作奠定基础。结果表明,在所试验的所有培养基中,MS(1/2N)+IAA0.1mg/L+ZT2.0mg/L最适合油柿下胚轴培养,
其不定芽再生率和外植体平均不定芽数最高,分别为81.7%和(5.3±2.1)个。再生苗接种于添加IAA和IBA各0.5mg/
L的 MS(1/2N)培养基上生根效果最好,生根率达 100%,平均根数达(3.2±1.4)条,平均根长度为(2.4±1.0)cm,且侧根
较多、植株生长迅速而健壮。再生苗生根后移栽,30d时成活率达96%。
关键词:油柿;下胚轴;再生植株
中图分类号:S665.2 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2007)02-157-05
Regenerationfromhypocotylexplantsofdateplum(Diospyrosoleifera)
XIEQi-xin,ZHUANGDong-hong*,WUYi-heng
(DepartmentofBiology,ShantouUniversity,Shantou,Guangdong515063China)
Abstract:InordertoimprovetheplantregenerationsystemofDiospyrosoleiferaChengandestablishafoundationfortrans-
formation,shootregenerationandrootingfromhypocotylexplantswerestudied.Theresultshowedthatthemodified
MurashigeandSkoog(MS)[MS(1/2N)]containing0.1mg/Lindoleaceticacidand2.0mg/Lzeatinwasthemostoptimumfor
shootregenerationandtheshootpercentageandaverageshootnumberperexplantwere81.7%and(5.3±2.1)respectively.
Asforregeneratedshootrooting,themodifiedMurashigeandSkoogcontaining0.5mg/Lbothindole-aceticacidandindole-
3-butyricacidwasmostefective,inwhichtherootingpercentage,averagerootnumberandlengthpershootreachedupto
100%,(3.2±1.4)and (2.4±1.0)cm respectively.Thereweremanylateralrootsatthecutendsandtheplantletsgrew
rapidlyandvigorously.Afterrooting,theregeneratedplantsweretransplantinpotswhere96%plantssurvivedafterone
month.
Keywords:Dateplum(DiospyrosoleiferaCheng);Hypocotyl;Plantregeneration
柿树(DiospyroskakiThunb.)是柿属植物中作为
果树而被广泛利用的一个代表种。已知柿树为杂性
株,为柿属植物(x=15)中的六倍体种(2n=6x=90),
既有只着生雌花的品种,又有雌雄同株异花或同花
的品种,但优良品种一般只着生雌花,因此常规杂交
育种比较困难[1-3]。生产上也通过芽变选育新的品
系,再进行嫁接繁殖。嫁接用的砧木多方面影响接
穗,制约着柿树的增产和品质的改善,已成为生产上
的主要问题之一。然而,当前学者对砧木的研究主
要集中在快速育苗方面[4-5],利用现代生物技术如转
基因改良砧木品质的研究尚未见报道。开展遗传转
化研究的前提和基础之一便是建立一种有效的离体
再生体系。
以我国中部和南方广泛分布、与柿树嫁接亲和性
较好且抗逆性强的油柿 (DiospyrosoleiferaCheng)[5-6]
未成熟胚的下胚轴为材料,研究了组织培养不同因
素对诱导器官形成和植株再生的影响,同时也对再
生苗生根的相关因素进行了探讨,初步建立了油柿
下胚轴离体再生体系,为进一步开展遗传转化研究
奠定了基础。
1材料和方法
1.1 材料
于6月中旬采自汕头市澄海区栽培的成年油柿
的幼果。
1.2 方法
1.2.1 胚轴培养和不定芽诱导 油柿幼果表面用自
来水冲洗干净,切取种子,移至超净工作台,用70%
的酒精表面消毒30s,0.1%的升汞浸泡15min,中间
不时摇动,无菌水冲洗6次。轻轻用刀片切开种子,
取出幼胚,切除胚根、胚芽和子叶,将胚轴横切几处
伤口后接种于预先配好的培养基上培养[7]。
收稿日期:2006-08-08 接受日期:2006-12-27
作者简介:谢启鑫,男,在读硕士生。Tel:0754-2902083,E-mail:biocrat@126.com.
2 通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:0768-2522088,E-mail:dhzhuang@stu.edu.cn.
果 树 学 报 2007,24(2):157～161
JournalofFruitScience
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2007.02.006
果 树 学 报 24卷
培养基
Basal
medium
不定芽再生率
Shootpercentage
(%)
平均不定芽数
Shootnumber
perexplant
愈伤组织形成率
Caluspercentage
(%)
MS
1/2MS
MS(1/2N)
22.4b
42.9a
48.3a
3.5±1.0b
4.2±1.2a
4.3±1.2a
90.4b
98.2a
100.0a
表1 基础培养基种类对油柿下胚轴不定芽再生的影响
Table1Efectofbasalmediumsonshootregenerationfrom
hypocotylexplantsofD.oleiferaCheng
注:同列内相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在0.05水平上
差异不显著。下同。
Note:MeanseperationwithincolumnsbyDuncan’smultiplerangetest
atP=0.05.Thesameasbelow.
分别以MS、1/2MS、MS(1/2N)为基础培养基,添
加0.05mg/LIAA和2.0mg/LZT,将胚轴切段接种于
培养基上培养,试验基础培养基种类对胚轴不定芽
再生的影响。
以 MS(1/2N)为基础培养基,附加不同的 IAA
(0.01、0.05、0.1mg/L)和ZT(0.5、2.0、5.0mg/L),共9
个组合处理,试验不同质量浓度的IAA与ZT组合
对胚轴不定芽再生的影响。
以1/2MS为基础培养基,添加0.1mg/LIAA和
不同质量浓度的 ZT(0.5、2.0、5.0mg/L)和 BA(2.0、
5.0、10.0mg/L),试验不同种类和质量浓度的细胞分
裂素对胚轴不定芽再生的影响。
以上各处理均接种 35～40个外植体,培养 8周
后统计愈伤组织形成率、不定芽再生率和外植体平
均不定芽数。所有培养基均添加0.8%琼脂、3%蔗糖
和500mg/LPVP(聚乙烯吡咯烷酮),pH调至5.8后
于121℃高温灭菌15min(下同)。培养物置于28
℃、光周期为12h、光照度为60μmol/(m2·s)的条件
下培养。各试验均重复2次。
1.2.2 再生苗生根培养 切取再生芽顶端 15～20
mm长的1段,分别用2种不同的方式诱导不定根
的形成。一种是把再生芽基部浸入250mg/LIBA溶
液中处理不同时间(15、30、45s),待溶液干后接种
于无激素的MS(1/2N)培养基。另一种是直接接种
于添加不同浓度的IAA(0、0.25、0.5、1.0mg/L)、IBA
(0、0.25、0.5、1.0mg/L)、NAA(0、0.5mg/L)的MS(1/
2N)培养基[8]。以上各处理均接种30个再生芽,暗培
养9d后移至光周期为16h的光照下培养,4周后
统计生根率、平均根数和平均根长。试验重复2次。
1.2.3 炼苗及移栽 生根培养4周后,打开培养瓶
盖,在培养室炼苗3d,小心取出小苗,用自来水洗去
基部琼脂,移栽于盛有蛭石、河沙、塘泥各 1份的塑
料杯(直径60mm)中。培养基质用MS培养液(稀释
500倍)湿透,最初1周用塑料薄膜保湿,以后逐渐
打开[1]。30d后以长出新叶新根为植株成活的标志
计算移栽成活率。
1.2.4 数据分析 所有数据均采用 SPSS软件进行
方差分析。外植体平均不定芽数=不定芽总数/再生
外植体数,平均根数=不定根总数/再生苗数,平均根
长=不定根总长度/不定根总数。
2 结果与分析
2.1 胚轴切段不定芽再生
外植体接种后逐渐从乳白色转为暗黄色 (图
版-A),2周左右即有褐色、致密的愈伤组织形成,同
时向周围的培养基分泌褐色物质。3周后开始出现
绿色芽点(图版-B)。大部分不定芽产生于胚轴基部
的伤口末端和侧面,而顶部较少。单个外植体形成的
不定芽数最多可达17个。此后不定芽持续伸长。
2.2 基础培养基对胚轴不定芽再生的影响
不同基础培养基对油柿下胚轴不定芽再生有不
同影响(表1)。3种基础培养基中,MS(1/2N)的培养
效果最好,愈伤组织形成率、不定芽再生率和外植体
平均不定芽数分别达到100%、48.3%和4.3个,但与
1/2MS相比差异不显著。MS培养基效果最差,各指
标均显著低于1/2MS和MS(1/2N)培养基。
2.3 不同浓度的IAA与ZT组合对胚轴不定芽再
生的影响
试验结果表明(表2),在不同浓度的IAA与ZT
组合中,IAA0.1mg/L配合ZT2.0mg/L对胚轴的培
养效果最好,愈伤组织形成率、不定芽再生率和外植
体平均不定芽数分别达到100%、81.7%和5.3个,后
2个指标均显著高于其他各组合。第3、5、6、9组合
(即ZT质量浓度较高时)的不定芽再生率也都超过
40%,平均不定芽数均大于或等于4.0个。随着IAA
质量浓度的增加,外植体形成的愈伤组织也增加,颜
色由浅绿到深褐,说明高质量浓度的 ZT能促进不
定芽的形成,而高质量浓度的生长素能促进愈伤组
织的生长。
2.4 不同种类和质量浓度的细胞分裂素对胚轴不
定芽再生的影响
不同种类和质量浓度的细胞分裂素对油柿胚轴
培养效果明显不同。图1显示,ZT的效果要明显好
于BA。ZT为2.0mg/L时,不定芽再生率和平均不定
芽数分别达到 72.80%和 5.0个,显著高于 ZT0.5
mg/L,略高于ZT5.0mg/L,说明ZT质量浓度过高或
过低均不利于不定芽再生。一定质量浓度的 BA也
158
2期
图1 不同种类和质量浓度的细胞分裂素对油柿
下胚轴不定芽再生的影响
Fig.1Efectofdiferentcytokininconcentrationonshoot
regenerationfromhypocotylexplantsofD.oleiferaCheng
表3 不同生长素及处理方法对诱导再生芽生根的影响
Table3EfectofauxinandusemethodonshootrootingofD.oleiferaCheng
组合
Disposal
生长素Auxin(mg/L) 使用方法
Usemethod
生根时间
Timeforrooting(d)
生根率
Rootingpercentage(%)
平均根条数
Rootnumberpershoot
平均根长度
Lengthperroot(cm)IAA IBA NAA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
0.5
1.0
0.5
0.25
0.5
0.5
250
250
250
0.5
1.0
0.5
0.25
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
基部浸泡15s
Dipbasisfor15s
基部浸泡30s
Dipbasisfor30s
基部浸泡45s
Dipbasisfor45s
加入培养基
Addtomedium
加入培养基
Addtomedium
加入培养基
Addtomedium
加入培养基
Addtomedium
加入培养基
Addtomedium
加入培养基
Addtomedium
加入培养基
Addtomedium
加入培养基
Addtomedium
加入培养基
Addtomedium
加入培养基
Addtomedium
9
7
7
9
9
9
10
9
14
14
17
18
18
97.8a
100.0a
100.0a
95.6a
97.8a
100.0a
86.7bcd
100.0a
91.1abc
85.6cd
81.1d
94.4ab
84.4cd
2.1±0.9de
3.2±2.2a
1.9±0.9e
2.2±1.5d
2.4±1.0cd
1.8±1.1e
2.5±0.9bc
3.2±1.4a
2.6±1.5bc
2.7±1.7b
2.1±1.2de
1.8±0.9e
2.7±1.9bc
3.2±1.3a
2.8±1.5c
3.2±1.4a
2.7±1.1c
2.4±0.9d
3.0±1.0b
2.4±1.3d
2.4±1.0d
1.9±1.2e
1.2±0.6g
1.6±0.8f
1.9±1.1e
0.9±0.5h
组合
Disposal
IAA
(mg/L)
ZT
(mg/L)
再生率
Shootpercentage(%)
平均不定芽数
Shootnumberperexplant
愈伤组织形成率
Caluspercentage(%)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.01
0.05
0.10
0.5
2.0
5.0
0.5
2.0
5.0
0.5
2.0
5.0
29.0c
24.0cd
46.9b
14.2de
45.9b
42.5b
9.2e
81.7a
46.6b
2.3±0.8c
4.3±1.2b
4.0±1.2b
1.8±0.7cd
4.5±1.5b
4.3±1.3b
1.6±0.6d
5.3±2.1a
4.7±1.4b
98.1ab
97.4ab
88.5c
92.5bc
100.0a
93.6abc
94.2abc
100.0a
95.5abc
表2 不同质量浓度的IAA和ZT组合对胚轴再生的影响
Table2EfectofIAAandZTwithdiferentconcentrationcombinationsonshootregeneration
能诱导不定芽再生,从图中可以看到,不定芽再生率
和平均不定芽数均随BA质量浓度升高而下降。BA
质量浓度从2.0mg/L升高到10.0mg/L,不定芽再生
率和平均不定芽数分别从20.5%和2.2个下降到0,
说明BA不适于油柿胚轴不定芽再生。
2.5 再生苗生根培养
不同种类和质量浓度的生长素及处理方法对再
生苗生根的影响见表3。用250mg/LIBA浸泡基部
不同时间对再生苗的生根效果不同。浸泡 30s和
45s时生根较快,第7天有不定根出现,生根率为
100%,而浸泡 15s到第 9天才长出第 1条根,生根
率为97.8%。浸泡30s的平均根数达3.2条,显著高
于15s和45s,但其平均根长仅为2.8cm,显著低于
其他2者。浸泡15s和30s形成的不定根极细、侧
谢启鑫等:油柿下胚轴再生植株的培养 159
果 树 学 报 24卷
根很少,相反,浸泡45s所形成的根系稍粗、侧根稍
多。
将生长素直接加入培养基的实验结果表明,只
用 IAA或 IBA或 2者混合使用时,再生苗生根较
快,平均只需9～10d。生根率高,除组合7外均高于
95%,最高达100%。平均根长均大于2.4cm,不定根
较粗,侧根数量中等或偏多,仅形成少量愈伤组织,
植株生长较快。当 0.5mg/L的 NAA与 IAA和 IBA
配合使用时,再生苗生根较慢,需 14～18d,生根率
低、根长较短,均在 2.0cm以内,显著低于其他组
合,但根系较粗甚至极粗,没有或仅有极少量侧根形
成,切口处形成大量愈伤组织,植株生长缓慢,不够
健壮。
综合考虑各指标,以IAA和IBA各0.5mg/L直
接加入培养基中,再生苗生根较快,生根率和平均根
数分别达到100%和3.2条,均显著高于其他组合。
且形成的愈伤组织少、侧根多、植株生长迅速而健壮
(图版-C),移栽后易成活,为本试验中的最佳组合。
2.6 移栽
再生芽生根培养 4周后移栽至盛有蛭石、河
沙、塘泥各1份的塑料杯(直径60mm)中[1]。经统计,
30d时成活率达96%(图版-D)。
3 讨 论
柿属植物为多年生木本植物,其离体再生常用
的外植体为茎段和幼叶等[9],相对于这些成熟器官
组织而言,未成熟的胚胎组织等幼嫩材料再生能力
更强、培养周期更短。而未成熟胚胎又以下胚轴所占
比例大,且相对于子叶而言,下胚轴组织结构完整坚
实,容易进行离体操作,是较理想的再生材料。
Yamada等[7]以柿品种西条的成熟果实为试材,首次
获得了胚轴培养不定芽的再生,再生率为 65%。此
后孙清荣等[10]报道了甜柿次郎成熟下胚轴再生不定
植株的研究,再生率为33.33%。笔者当前的研究以
油柿未成熟的下胚轴为材料,获得了最高81.7%的
不定芽再生率,外植体平均不定芽数达5.3个,表明
在合适的培养条件下,油柿(D.oleiferaCheng)表现
出较强的离体再生能力。
MS培养基是木本植物组织培养中应用最为广
泛的一种基础培养基,大部分柿组培研究结果表明
1/2MS和MS(1/2N)培养基最适合柿培养[9]。本研究也
得出相似的结论,油柿下胚轴在 1/2MS和 MS(1/2N)
培养基上无论不定芽再生率还是平均不定芽数都显
著高于MS培养基。这说明,柿属植物外植体的再生
需要较低的矿质元素含量,特别是较低的氮元素含
量[11]。
细胞分裂素对于不定芽的再生起着关键的作
用,大部分研究报道均表明ZT对促进柿外植体的
生长和再分化效果最好。Nakamura等[12]比较了不同
质量浓度的 4-CPPU、ZT和 BA对日本柿西条胚轴
再生的影响,结果在附加 ZT2.0mg/L的改良 MS培
养基上不定芽再生率最高。孙清荣等[10]的研究表明,
对于甜柿胚轴培养不定芽的再生,ZT有效,BA完全
无效。也曾比较过不同种类的细胞分裂素对西条胚
轴再生的影响,他们在添加5mg/LBA的培养基上
得到了 65%的不定芽再生率,BA的效果好于 ZT、
2iP和KT-30。本研究中,笔者比较了不同质量浓度
的ZT和BA对油柿下胚轴不定芽再生的影响。结果
显示,一定质量浓度的ZT和BA均能诱导不定芽的
再生,但ZT比BA更有效。ZT为2.0mg/L时再生率
最高,为72.5%,ZT质量浓度过高或过低均不利于
不定芽的再生。这一结果与Yamada等[7]的差异可能
是试验材料和基础培养基的不同所致,他们使用柿
品种西条的成熟胚轴和WPM培养基,而笔者使用
油柿未成熟胚轴和1/2MS培养基。
柿树是木本植物中含酚类物质较多的一种。在
离体繁殖过程中,由于多酚氧化酶被激活,细胞中的
代谢发生改变,酚类物质被氧化后产生棕褐色的醌
类物质,使组织变成褐色,这类物质还能逐渐扩散
到培养基中,致使外植体生长受到抑制,最后衰老死
亡[13]。为了防止外植体褐变死亡,常用的措施是加入
抗氧化剂和酚类物质吸附剂。本实验中,笔者使用
500mg/L的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)来吸附酚类物
质,结果没有观察到外植体褐变死亡的现象(图版-
A)。
对于柿不定梢的生根培养,常用的方式有2种:
一是把新梢基部浸入一定质量浓度的生长素溶液中
一定时间后接种于无激素的培养基上,二是新梢直
接接种于添加一定质量浓度生长素的培养基中诱导
不定根的形成[8]。本研究比较了 2种方式的作用效
果后发现,在合适的条件下,2者都能使油柿再生苗
的生根率达到100%。关于生长素在生根培养中的
作用效果,不同的研究者得出的结论存在一定的差
异。孔祥生等[14]认为,IAA的效果优于 IBA,而马俊
莲等[15]则得出相反的结论。笔者的研究结果表明,
0.5mg/L的IAA和IBA单独加入培养基对不定根的
诱导效果差异不显著。此前的研究一般较少使用
NAA来诱导不定根的形成,本试验结果也表明,
160
2期
1、稿件应来自该学科的重点研究单位,并有一
定研究成果,在全国同类研究中居领先地位;
2、投来的稿件为近两年国内期刊上该学科没有
报道的选题;
3、作者必须在该领域发表过系列研究论文;
4、稿件内容好,文献新,层次清晰,分析得当,有
重要的理论和实际意义。
《果树学报》编辑部
“专论与综述”栏目的稿件要求
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
NAA生根效果不如IAA和IBA,其诱导的不定根更
粗壮、颜色更深、侧根极少,愈伤组织增多,植株不够
健壮,移栽后也不易成活。这说明,不同种类的生长
素对于不定根的形成表现出不同的作用特点。另外,
此前的研究均表明,诱导不定根需要10d以上甚至
更长时间[15],而笔者发现,条件合适时最快 7d就能
生根,这可能与物种间的差异有关。
4 结 论
成功建立了油柿下胚轴植株再生体系,胚轴切
段接种在MS(1/2N)+IAA0.1mg/L+ZT2.0mg/L的
培养基上,不定芽再生率和平均不定芽数最高,分别
为 81.7%和(5.3±2.1)个。再生苗接种于含 IAA和
IBA各 0.5 mg/L的 MS(1/2N)培养基生根率高达
100%,移栽后易成活。(本文图版见封三)
致谢:广东省汕头市果树研究所廖玉章所长提
供了试验材料,汕头大学生物系杜虹博士在数据处
理方面给予帮助,谨致谢意!
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