全 文 ：能源植物石栗 ISSR- PCR体系的建立与优化
周 浩， 欧 婵， 郭伦发， 王新桂， 何金祥
（广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所， 广西 桂林 541006）
摘 要：对能源植物石栗种质资源的遗传多样性进行研究，建立了其 ISSR-PCR 分子标记体系。 应用 CTAB 法提取石栗叶片
基因组 DNA， 用正交设计和单因素水平优化的方法对 ISSR-PCR 反应程序中的一些重要参数进行筛选和优化。 结果表明，25 μL
ISSR-PCR反应体系的最优条件为：DNA模板 20 ng、Mg2+ 1.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1.5 U，引物 0.40 μmol/L，dNTP 200 μmol/L。
关键词：石栗； ISSR； 能源植物
中图分类号：Q949.753.5 文献标识码：A 文章编号：1004-874X(2011)16-0121-03
Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction
system for energy plant Aleurites moluccana
ZHOU Hao， OU Chan， GUO Lun-fa， WANG Xin-gui， HE Jin-xiang
(Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and Academia Sinica, Guilin 541006， China)
Abatract: In order to study the genetic diversity of energy plant Aleurites moluccana，ISSR -PCR system of A. moluccana was
estabilished and optimized. The genomic DNAs prepared by the method of CTAB，orthogonal design and single-factor gradient test were
used to optimize ISSR-PCR amplification system. The results showed that the optimum conditions for ISSR-PCR were 20 ng templates
DNA，1.5 mmol/L Mg2+，1.5 U DNA polymerase，200 μmol/L dNTPs，0.4 μmol/L primers.
Key words: Aleurites moluccana; ISSR; energy plant
石栗（Aleurites moluccana）属于大戟科（Euphorbiace-
ae）石栗属，又名烛果树、黑桐油树、铁桐和油果等，是一种
阔叶常绿多年生野生树木。 主要分布于亚洲，在我国境内
广西、广东、云南及海南等地也有分布，资源十分丰富。 我
国南部将其作为行道树或庭园绿化树种。 石栗花后结核
果，果实具木质种皮，十分坚硬，内藏种子 1～2粒。 石栗原
果的核或油可作缓泻剂， 而且果核和果肉可制成外敷止
痛膏，叶外敷可治疗关节肌肉酸痛，树皮可治疗哮喘，花
或果壳炭可治疗咽喉肿痛，此药还可作为一般的补药。 另
外石栗还用于治疗风湿、 溃疡、 痔疮、 狂犬病、 肿瘤、
发热、 头痛等 [1]。 石栗油的不饱和脂肪酸含量高，亚油酸
含量为 34.6%，亚麻酸为 22.8%，是一种潜在的优质油脂
资源[2]。
简单序列重复区间扩增多态性(inter simple sequence
repeat，简称 ISSR)是一种基于微卫星序列 SSR(simpleseque
nce repeat)和 PCR 技术的 DNA 分子标记，由 Zietkiewiez
等[3]创建。 ISSR 具有无需知道研究材料的基因组序列、引
物序列较长、退火温度较高、成本低、灵敏性高、重复性
好、操作简单、多态性好等特点，已在 DNA植物图谱绘制、
物种鉴定、 植物遗传多样性与亲缘关系和演化分析上得
到了广泛的应用[4-10]。 进行 ISSR 分子标记时，首先需要对
反应体系进行优化，建立稳定的反应体系，以确保结果的
稳定可靠。
本研究对石栗 ISSR体系中的模板 DNA浓度、引物浓
度、dNTP 浓度、Mg2+浓度和 Taq DNA 聚合酶浓度等因素
进行优化， 初步建立稳定性好、 重复性高的 ISSR 反应体
系，为后续石栗遗传连锁图谱的构建、种质资源的优选和
种群遗传分析等研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
石栗嫩叶采集于广西西南地区， 带回实验室洗净晾
干，用于 DNA的提取。
Taq DNA聚合酶（EP0402）为 Feremtas公司产品；dNTP
和 DNA Ladder（D0107）购于上海碧云天生物技术公司；
ISSR 引物采用加拿大哥伦比亚大学（University of British
Columbia，UBC）所设计的第 9 套引物，由上海生物工程技
术服务公司合成 。 经过筛选用于体系构建的引物为
UBC809，在 MyCyclerTM PCR 仪（BIO-RAD）上扩增。
1.2 试验方法
1.2.1 石栗叶片基因组总 DNA 的提取及检测 取 1 g
石栗叶片，采用 CTAB 法提取石栗基因组 DNA，用 TE（pH
8.0）溶解，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 ISSR-PCR 优化试验设计与 PCR 扩增 用核酸
分析仪测定提取的 DNA浓度，将其稀释到特定浓度后，置
于-20℃保存，用于 ISSR分析。
参照张春平等 [11]的方法，在 25 μL 反应体系中，设置
Taq DNA 聚合酶与 Mg2+二因素梯度试验 ， 模板浓度 、
dNTP、引物单因子梯度试验。 在 Taq聚合酶与 Mg2+二因素
梯度试验中，Taq 聚合酶和 Mg2+分别设置 4 个浓度梯度，
二因素交叉共 16个处理（表 1）。
收稿日期：2011-06-22
基金项目：广西自然科学基金 (2011GXNSFA018090)；广西科技
攻关项目（桂科攻 0815008-1-6）
作者简介：周浩（1982-），男，硕士，助理研究员，E-mail：htmyth@
yahoo.com.cn
通讯作者：郭伦发（1973-），男，硕士，副研究员，E-mail：lunfa@
gxib.cn
广东农业科学 2011 年第 16 期 121
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2011.16.069
M 1 2 3 4 5 6 7 8
泳道 1～8：dNTP 浓度依次为 25、50、100、200、300、
400、500、600 μmol/L；M：DL10000
图 4 dNTP 浓度对 ISSR-PCR 扩增的影响
M 1 2 3 4 5
泳道 1～5:DNA 模板量依次为：5、10、20、40、80 ng；
M：DL10000
图 5 DNA 模板浓度对 ISSR-PCR 扩增的影响
M 1 2 3 4 5 6 7 8
泳道 1～8：引物浓度依次为 0.05、0.10、0.20、0.30、
0.40、0.60、0.80、1.0 μmol/L；M：DL10000
图 3 引物浓度对 ISSR-PCR 扩增的影响
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
泳道 1～4：Mg2+ 0.5 mmol/L，Taq 酶依次为 0.5、1、1.5、2.0 U；
泳道 5～8：Mg2+ 1.0 mmol/L，Taq 酶依次为 0.5、1、1.5、2.0 U；
泳道 9～12：Mg2+ 1.5 mmol/L，Taq 酶依次为 0.5、1、1.5、2.0 U；
泳道 13～16：Mg2+ 2.0 mmol/L，Taq 酶依次为 0.5、1、1.5、2.0 U；
M：DL10000
图 2 Mg2+和 Taq 酶正交试验结果
表 1 ISSR-PCR 反应体系的试验设计
反应成分
Mg2+(mmol/L)
Taq 酶(U)
dNTPs(μmol/L)
引物(μmol/L)
DNA(ng)
0.5
0.5
25
0.05
5
1.0
1.0
50
0.10
10
1.5
1.5
100
0.20
20
2.0
2.0
200
0.30
40
300
0.40
80
400
0.60
500
0.80
600
1.00
反应浓度
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
图 1 石栗基因组 DNA
2 结果与分析
2.1 基因组 DNA的提取
由图 1可知，基因组 DNA能显示出清晰的条带，说明
CTAB法可较好地提取石栗基因组 DNA。
2.2 反应体系的优化
2.2.1 Taq 酶与 Mg2+对 ISSR-PCR 扩增效果的影响 从
图 2 可以看出，在 25 μL的扩增体系中，当 Mg2+浓度固定
为 0.5 mmol/L，Taq 酶为 0.5~1.0 U 时，没有条带出现；Taq
酶为 1.5 U时，有微弱不清晰的条带出现；Taq 酶为 2.0 U
时，有明亮的条带出现，但有轻微的拖尾现象。 当 Mg2+浓
度为 1.0 mmol/L，Taq 酶为 1.0~2.0 U 时， 有条带出现，泳
道 7 清晰明亮， 泳道 6、8 相对模糊。 当 Mg2+浓度固定为
1.5 mmol/L，Taq 酶为 0.5 U 时， 没有条带出现；Taq 酶为
1.0~2.0 U 时，有条带出现，泳道 11 清晰明亮，泳道 10 条
带少，泳道 12 较模糊。 当 Mg2+浓度为 2.0 mmol/L，Taq 酶
为 0.5~2.0 U 时，有条带出现，泳道 13、14 条带不清晰，泳
道 15、16的条带出现不同程度的拖尾现象。 综上所述，在
25 μL反应体系中， 选择 1.5 mmol/L Mg2+、1.5 U Taq 酶
较好。
2.2.2 引物浓度的优化 用筛选出的 U809 作为引物，共
设置了 8 个浓度梯度。 由图 3 可知，8 个浓度的引物均可
扩增出条带。 当引物浓度为 0.05~0.10 μmol/L 时，条带少
且不清晰；当引物浓度为 0.40 μmol/L 时，条带清晰明亮；
当引物浓度为 0.20~0.30、0.60~1.00 μmol/L 时， 条带相对
泳道 5稍显模糊。 在本试验中选择 0.40 μmol/L作为引物
的最佳反应浓度。
2.2.3 dNTP浓度的优化 由图 4可知，8 个浓度的 dNTP
均可扩增出条带。当 dNTP浓度为 25~50、300~600 μmol/L
时，条带少且模糊不清；当 dNTP 浓度为 100~200 μmol/L
时， 条带最多且清晰。 在本试验中选择 200 μmol/L 作为
dNTP的最佳反应浓度。
2.2.4 模板浓度的优化 从图 5 可以看出， 在 25 μL 的
扩增体系中，当 DNA模板量为 5 ng 时，条带略显模糊；当
DNA模板量介于 10~80 ng 之间时，均可扩增出较清晰明
亮的条带， 说明在石栗的 I SSR-PCR 反应体系中，DNA
模板量对 ISSR-PCR扩增效果影响不大。在本试验中选择
20 ng 作为 DNA模板的最佳反应浓度。
122
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
图 6 优化体系下 22个石栗样品的 PCR 电泳结果
2.3 优化反应体系和扩增程序的建立
通过对各个反应条件进行分析， 最终确定 25 μL 石
栗 ISSR-PCR的优化反应体系为：DNA模板 20 ng、Mg2+浓
度 1.5 mmol/L、Taq酶 1.5 U、引物浓度 0.40 μmol/L、dNTP
浓度 200 μmol/L。 扩增程序为：94℃预变性 7 min；94℃变
性 30 s，56℃复性 45 s(根据不同引物设定)，72℃延伸 2 min，
35个循环；72℃延伸 10 min，4℃保存。
2.4 石栗优化体系的扩增效果
采用引物 UBC809， 运用建立的优化体系对 22 个来
自不同地区的石栗基因组 DNA进行扩增。由图 6可知，在
此优化体系下，22个样品均能扩增出清晰的条带，获得了
较好的指纹图谱，表明建立的优化 ISSR-PCR 反应体系稳
定可靠，可用于石栗品种的分子标记研究。
3 结论与讨论
ISSR-PCR 结果受多种因素的影响， 如模板 DNA、
Taq 酶、Mg2+浓度、dNTP 浓度、 引物浓度以及退火温度
等，在研究时应针对不同的物种筛选反应条件，优化和建
立反应体系。本研究利用正交试验设计具有均衡分散、综
合可比、伸缩性强、效应明显的特点，对影响 ISSR-PCR
反应体系的主要因素进行优化分析，选出最佳试验组合。
高质量的模板是保证 ISSR 反应成功的基础， 结果表明，
运用 CTAB 法提取植物 DNA 可得到质量较好的 DNA 样
品。石栗模板 DNA 和引物浓度对 ISSR 反应影响最小，在
所设置的几个浓度梯度中均能扩增出清晰的条带 ，而
Taq 酶、Mg2+浓度、dNTP 浓度对 ISSR 结果的影响较为明
显。
Taq 酶的用量直接关系到扩增结果，量多不仅增加试
验成本而且容易产生非特异性扩增产物， 量少则会使酶
过早地消耗完，产物合成效率低，而 Mg2+浓度的大小直接
影响酶活性的发挥，Mg2+浓度过高， 反应特异性降低，Mg2+
浓度过低，产物产量减少。 引物浓度的高低关系到扩增产
物的质量，浓度太低不能进行有效的扩增，浓度太高会增
加引物二聚体的形成， 导致条带不稳定及清晰度下降。
dNTP 作为 PCR 反应的底物原料，选择合适的浓度非常重
要。 由于 ISSR-PCR 所用的每条引物碱基组成和数量不
同，使得引物的退火温度也不尽相同。 所以，研究中采用
Taq酶与 Mg2+二因素梯度试验，模板浓度、dNTP、引物单因
子梯度试验，建立优化反应体系。 通过对各个反应条件进
行分析， 最终确定 25 μL 石栗 ISSR-PCR 反应体系为：
DNA 模板 20 ng、Mg2+ 1.5 mmol/L、Taq 酶 1.5 U、引物 0.4
μmol/L、dNTP 200 μmol/L。 扩增程序为 ：94℃预变性 7
min；94℃变性 30 s，复性 45 s(退火温度根据不同引物设
定 )，72℃延伸 2 min，35 个循环；72℃延伸 10 min，4℃保
存。 该反应体系的建立将为石栗的后续试验和遗传分析
奠定基础。
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