全 文 ：第巧卷第 1期
1 98 9年 3月
湖 南 农 学 院 学 报
J r n o u al
o
f H n n o a A gr , e u l t u r a 工 C o l一e g c M a r . 1 9 8 日
山靛几个性别类型生殖器官胞质
P 0 1y ( A )
+
R N A的研究
.
1
. 同源和异源分子杂交
余 龙 .
(基础科学部 )
I 摘 要 】 应用核酸分子 杂交技术对雌雄 异株植物 山靛几个性别类型生殖器 官细胞质 p ol 以 A +) RN A进行了
复性动力学的研究 , 结果 表明 , 雄性不育系 、 雄性恢复系和雄性可育系相比 , p o1 y( A +) RN A 碱基数 和 序列
种数均以恢复系为高 , 不育系次之 , 雄性可育系最低 · 异源杂交结果表明 , 各系均有自己独特的序列 , 不育系
与恢复系的序列差异 , 主要位于中度重复序列 和单拷贝序列类 、 不育系与可育系的差异 ,则从高度重 复序列开
始就表现出来 , 且这种差异一直持续到中度重复序列 类和单拷贝序列 . 恢复系与可育系相 比 , 虽然其表现型一
致 , 但它们 具有不同 的 p o1 y( A +) RN A群体 , 表明二者在信使核绪核酸转录与加工过程中 , 仍然存在着差 异 ·
【主 . 润 】 大戟科 ; 分子杂交 : D N A . R N人杂交 : 同源 , 异源
【自由饲 】 山旋
傀
复性动力学的研究 , 作为分子生物学的一个重要手段 , 对于探讨同种生物的不同个体和
同一个体 的不同器官发生的基因表达 一与调控方面的差异起了重要的作用 ( iB s h o p等 , 19 7 4 ) .
这类研究工作开始只在动物 上进行 . 而 民局限于 D N A . 后来 , 有 人以高等植物为材料 , 将枚
D N人与细胞质 m R N A 进行分子杂交 , 获得了一些有价值的科学数据 . J a eq u ” t等 人 ( 1 9 7 8 )将
这种技术发展为 以oP ly ( A ) 十 R N A 为模板 , 利用逆转录酶合成互补 D N A , 丛后将互 补D N A
和其合成模板进行杂交 , 用 以研究真核生物体内不同的 p ol y ( A ) ` R N A 群休复杂 度及其序
列种类组成 · 本文采用这种方法 , 以雌雄异株植物— 山靛 ( M er cu r i时 沁 an o u a L . ) 为材料 . 研究不同性别类型的p ol y ( A ) ` R N A 群体 . 以探讨高等植物性别分化的基因 表 达 与调控
过程 , 这无论对于缺础理论的研究或是农业生产实际应用 , 均有一定的科学价值 .
1 材料和方法
试钱材料
本文于 1 , . 3年 3月 22日收到 侈
DOI : 10. 13331 /j . cnki . jhau. 1989. 01. 008
绍巧游第 1期 余龙喜 山艘几个性别类型生殖器官胞质 pl o y(人 ) +R N A的研究 ( 1 )
,
!
巷
本试验所采用的材料均系纯系材料 , 由法国奥尔良大学植物生物学实验室 L o iu s J . P .
博士等培育而成 . 其基本情况如下 :
1
.
1颤 雄性可育系 由野生雄株选育而成 , 染色体 2n = 1 6 , 含 10 肠的可 育 花粉 , 具有决
定性别的核基A 和 B和 N 型细胞质 .
1
.
1
.
2 雄性恢复系 由雌性化的不育系与可育系杂交而来 , Z n = 1 6 , 含 1 0 肠的 一可育花粉 ,
除带有基因A 和 B 外 , 还 带有不育系的基 因型 I l/ , R l / R ; , R : / R : 以及 s 型细胞质 ·
1
.
1
.
3 雄性不育系 从野生株选育而成 , 2n 二 1 6 , 属无花粉型 , 除带有 基因A 和B外 , 还具
有墓因型 I l/ , r l r/ : , r : r/ : 以及 s 型细胞质 .
所有材料均在人工气候室 内种植 , 光照 25 0 o L x八 6 h / d , 温度 20 ℃ .
1
.
2 细胞质总R N A 的提取
花序顶端的幼嫩部分 ( 0 . 25 、 o . s c m 长 ) 采摘后 亿即投入 4 ℃双蒸水中 , 取出 吸 千表而
水分 , 称重后立即置入盛有 L ar ik n s ( 19 76 ) 改良液 ( 5 m l / g鲜承 )的研林内 , 以无菌枫丹 白露
细砂在 4℃下研磨呈匀浆 . 后 以 1 0 0 0 9在 4℃下离心 5 m in , 以除去细胞核和细 atJ 碎 )乍, 再以
30 0 0 0 9离心 15 m ln , 以除去叶绿体 、 线粒体等细胞器 . 上清液用等体积的酚提取液 ( 酚 : 斌
仿 , 异戊醇 = 5 小 5 。 : 2 ) 反复提取 3 次 , 每次离心 1 2 。。 0 9 5 m in . 小心吸取 淡黄 色 _ l二清液用
S e p h a d e x G 2 5层析柱层析 , 用 1 0 m M T r i s 一 H C I ( pH g ) , 0 . 5肠 S D s洗脱液洗脱 , 收集 2 5 4人
处的流出液 , 加。 . 2 M醋酸钠 , 并以 2 倍体积的 95 呱 乙醇在一 20 ℃沉淀过夜 . 以 15 0 0 0 9离心
15 m i n
, 收集 R N A 沉淀 , 并用 7 0肠冷乙醇洗涤几次 , 真空干燥后按所需浓度 溶解 在无菌水
中 , 一 8 0 ℃ 下保存 .
1
.
3 p o l y ( A )
十R N A 的分离和纯化
按 A v i v & L e d e x ( 1 9 7 2 )的方法用 o l i g o d ( T ) 一纤维素 亲和层析法分离出p o l y ( A ) 十 R N A .
为了保证所 分离的p ol y (A ) + R N A 的质量和 杂交所需的合适长度 ( 约 1 0 0个碱基长 ) , 在此
墓础上采取三步分离法 , 洗脱时采取逐步降低洗脱液中N a CI 的浓度的方法 , 收集 N a C I 浓度
为 O时 2 5 4人处流 出液 . 沉淀方法等 与总R N A 沉淀方法相同 ,
所得的pOl y( A ) + R N A 溶解在适量的无菌水中 , 取出 l 时 进行定量分析 , 方法是用过量的
s H p o l v ( u ) ( l o o n s
, 一 6 s m e i / m g ) 与它杂交 . 以 1 0 协g核酸酶消化 . 除去非杂交部分 . 并
用 7 肠的冷T C A沉淀在 G F / C w h at m a n 滤纸上 , 然后进行放射性闪烁计数 , 根据标准 曲线计
算出 p ol y ( A ) 十 R N A 的精确浓度 . 而 p o1 y( A ) + R N A 的链长则以蔗糖密度梯度离心法 ( T ar c y
& K o h n e
, 一9 5 0 ) 进行测定 ( 图 z ) .
1
·
4 c D N A 的合成
以所得p ol y (A ) + R N A 为模板 , 用 M M L v 逆转录酶 ( B . R . L . ) 合成互补 D N A . 合成条件
为 5 0 m M T r x s 一H c l ( p H s . s ) , 3 M M g C 12 , 7 5 m M K c x , l o m M D T T , 一。 协g / m l的 放线
菌 D , 1 0 协g / m l 0 1 9 。 一 d ( T ) 1 2一 1 8 . 1 m M 氧钒核符复合物 . 温度 37 ℃ , 时间 1 h . 为了使所合
成的 e D N A 具有放射性标记 , 在作为合成底物的d N T p 中 , 加 入了。 · 1 2 m M sH 一 d c T p ( 2 0 c i
/ m M ol
,
A m e r hs
a m )
.所得 c D N A , R N A 混合液中的 R N A 用碱解法在 65 ℃ 下进行分解 , 并
以酚提取液 ( 见上文 ) 提取 c D N A , 用 s e p h ad e x G 一 5 。层析 , 用醋酸钠 + 乙醇进行沉淀收集 .
所合成 的单链 c D N A 质量好坏是后一步分子杂交的关键 , 故需对其进行分析 . 方法是琼醋糖
平板 电泳法 . 以几 D N A E o R I + H in d l 片断为标志 , 得到 c D N A 的链 长 ( 图 2 ) . c D N A浓度
浏定可直接用放射性闪烁计数仪进行计数 ,
湖 甫 农 学 院 学 报 一 9 8年 3月
呜 s , 弓一 J , `兑 二` ,
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示与 . H p ol y ( u )杂交后再 以5~ 2Q 肠蔗糖密度禅度离心的沉淀分布
图 1 p o l y (A ) ` R N A 完整性浏 定
1
.
5 e D N A / p o l y ( A )
+ R N ^ 分子杂交
同源杂交在 c D N A和它的合成模板 p ol y (A ) + R N A 之间进行 ; 异源杂 交 则 以一况: 系 的
c D N A和另一品系的 p ol y ( A ) ` R N A进行杂交 . 无论同源或异源杂交 , 所用的p ol y ( A ) ` R N A
的量均为 c D N A 的 1 0 。倍到 2 0 。倍 . 杂交在 1 0闪的毛细管中进行 , 每组实验一般选取 30 个左
右测试点 , 即 30 个左右的毛细管 , 每管内 c D N A 和 p ol y ( A ) + R N A 的浓度不变 , 而 改 变杂
交时间 ( 从 3 0 5到硅s h ) , 得到不 同的 R o t值 ( R o t = R N A m o l八 x t ( S ) 〕 . 杂交 停 止后 , 用 s :
核酸酶消化未杂交部分 , 并进行放射性闪烁计数 , 求出每点的杂交率 . 用下 列 动态数学模型
进行计算 :
也
。 / 。 o 一 l一 a 一乒( a 。。 一 K 五R 。 , )
式中 H / 0 0 = 在时间 t内 c D N A杂交部分
i = 分量指 数 ’
a ,二 分量 i的可杂交部分
K , = 分量东的一阶动态常数
a = 未杂交的 c D N A 部分
所得数据用计算机进行处理 , 程序为H a us s 5 9 一 J ol ive t ( 1 9 83 ) , 并绘制出动力 学杂交
曲线 ,
咨
第 15澎第1期 余龙喜 山健几个性别类型生殖器官施质 po l以人) 十 R NA 的研究 1 () 3 3
ù叮ù厂一
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一
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卜州嘴,ūù了ō勺一
.
艺 ! ! } , 。 、 、 ` 弓 , 、 、。 d . ; : 〔 “ O R “ ’兮、
卜Z二勺
名.
乡 脸 ( l , 〕 e m )
图 2 合 成的 c D N A 单链长度测 定 ( 1呱琼 醋糖 电泳 )
表 1 山很各性别类型 p ol y ( A ) + R N A 群体序列等级 及复杂度
性别类型 级别 Ro 亡 1 / 2 c D N A可杂交部分 ( a i ) 碱 基 复杂度 ( a ) 信使核箱核酸种数 ( b )
A 2
.
56 X 10 4 2 0
雄性不育系
R
O
。
0 7 8
1
·
38 0
2 0
。
3 9 0
0
。
2 7 0
.
1
。
7 8 0
36
.
4 8 0
0
.
2 2 4
2
。
70 8
4 6
.
2 10
0
。
19 0
0
.
3 2D
0
。
4 4 0
5
.
0 0 2士( e )
o
·
50 2土。 · 0 8 7
O
·
0 3 4士0 . 0 2 2
3
·
0 3琴 10 .
1
.
6 3 X 10下
6 5 0
1 3 0 0 0
士9 5
土5 0 00
人
雄性恢倪系
。
1 90
。
3 9 0
R
2
·
5 50 士( c )
o
·
3 00 土。 · 14 0
0
·
0 19士0 · 0 0 8
9
。
3 8 X 10 4
1
·
27 X I O .
2
.
16 x 10 ,
7 3
1 0 0 0土 2 50
一7 50 0土 5 0 0 0
3
·
10 0士 ( e )
o
·
2 5 6士。 · 1 76
O
·
0 15土0 · 0 0 9
1
。
4 7 X 10 6
2
.
0 5 X 10 .
1
.
0肠X 10 7
1 20
1 6 4 0士6 7 0
8 ` 0 0士 3 2 0 0
306姗120000
A
雄性可育系
R
x 10 .仓
a
·旅羞复杂度 = a K s / K , 其中K s二 1 2 00 ( a + 日球蛋白的二R N A的碱甚数 ) x 1 . 5 0 (球蛋白m R N A的 K 值) “ 1 · 2 6
m o l一 1
·
l
·
-S
, ( aJ
e q o e t等 , 1 0 7 5 ) : b ·二RN A种数 = 复杂度 / 1 2 5 0 ( p o l y ( A ) + R N A平均长度 ) , e ·无确定的傅 .人·减度皿滚序列中 : 卜重度复序列 : R ·单拷贝序列 ,
口
湖 甫 农 学 院 学 报 , 。 , 9年 ?月
2 结果与讨论
同源杂交结果表明 , 无论是雄性不
育系 、 雄性恢复系 , 还是雄性可育系 , 其
p o l y ( A )
` R N A 群体均可 分为三种 序 列
类型 ,即高度重复序列 、 中度重复序列和
单拷贝序列 ( 图 3 , 表 l ) . 高度重复序
列以可育系为最高 , 约 1 20 种 , 恢 复 系
次之 , 不育系最低 , 仅 20 种左右 ; 中度
重复序列也是如此 ; 而单拷贝序列则以
恢复系为最高 ( 17 5 0 0种左右 ) , 不育
系次之 , 可育系最低 . 从各系总的序列
数和碱基数来看 , 则以恢复系为最高 ,
不育系次之 , 可育系最低 , 其差异是显
著的 . 为了更准确起见 , 我们使从雄性
不育系的 p ol y ( A ) + R N A 逆转 录而来
的。 D N A 分别与恢复系和可育系的 p ol y
( A )
+
R N A 进行了异源杂交 ( 图4 ) .
所得曲线与不 育系的同源杂交曲线相比
较的结果表明 , 与恢复系的异源杂交曲
线前半部基本上和同源杂交曲线重叠 ,
说明前半部二者杂交速率基本相等 , 也
就是说 , 不育系和恢复系 的p ol y ( A ) +
R N A群体具有相类似的高度重复 序 列
和部分中度重复序列 . 两曲线的后半部
逐渐分离 , 异源杂交速率逐渐下降 , 表
明从部分中度重复序列开始出现差异 ,
巨这种差异一直持续到曲线未端 . 这似
乎与恢复基因的恢复作用有关 , 由于恢
复基因的作用 , 使恢 复 系 p ol y ( 人 ) 十
R N A 群体中出现了不 同的中度重复序列
和单拷贝序列 . 同源杂交结果也证实了
这一点 .
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OO -L , ~ 一~ “ = = 二二石一` -一 3一 0 0 一 2 . n o 一 0 0
A
·不育系 eD N A / p o l y ( A )+ RN A
B
·恢复系 e D N A / p o l y ( A )+ RN A
C
· 可育系 e D N A / p o l y ( A )+ RN A
图 3 同源分子杂交
不 育系与可育系异源杂交曲线则从第一个测试点就 与同源杂交曲线分离 , 一直到最末一
个测试点都表现分离 . 这表明二者序列上的差异从高度重复序列就已出现 , 一直延续到中度
重复序列和单拷贝序列 . 它们之间差异明显大于不育系和恢复系之间的差异 , 这可能与可育
基 因和不育基因的作用有关 . 并月. 二者细胞质类型也不相同 : 可育系为N 型 , 不育系为 s 型 .
从理论上来讲 , 细胞质的类型虽然不影响核基因表达 , 但实际上也起到一定的调节作用 ,
公
如 15卷第 l 期 奈龙喜 山姚几个性别类型生班器官自质p川双人 ) +RN人的研究 ( I ) 3 5
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( 欢0 . t )
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山 ) 一 止 . 川 一 1 . U J 勺, ) J O J 2 . 的
十 示不育系同源杂交曲线
x 示不育系cD N A /恢复系p ol y (人 +) R N A异源杂交曲线
口 示不育系 c D N 人/ 可育系p o1 y( 人+) R N A 异源杂交曲线
图4 异源分子杂交与同源分子杂交曲线比较
考虑到并非所有的OP ly (A ) + R N A 都会转译成蛋 白质 , 我们进一步将各系的p ol y ( A ) ` R N人
以小麦胚无细胞体系进行了蛋 白质体外翻译 , 然后将翻译产物 以单向和双向电泳进行 分析 :
结 果表明 , 各系都具有不同的特殊多肤 . 关于这部分结果将在本文的第 I 报 中报 i趁.
( 待 扮 )
本文系笔者在法国奥尔良大学D盯如 d实验室所做博士论文的一部分 , 承象 B . R . D ur an d教授指导并提供实验条件 ,
谨致谢忱 .
,
参 考 文 献
1 A u g i e r S e t a l
.
S e q u e n e e C o m p l e x i t i e s o f T M E P o l了 ( A )十 C o n t a i n i n g m RN A、 i n u n i n f e e t e d
5 0了 b e a n r o o t a n d t五e n o d u l e t i s s u e d e, e lo p e d d u e t o t h , i n f e e t i o o b了 R h i : o b i u 口 . B i o e h i m B i o p h r s
A e亡一 , 一9 7。 , ( 6 6 3 ) : 4 9 6~ 50 7
2 B i
s
h
o P J Q e t a 1
.
T h r e e a b u o d a n c e c 1a s s e s i n H e Ia C e l l m e s s e n g e r R N A
.
N a t u r e
, 10 7一 ; ( 2 5 0 ) . 10 9~ 2 0 `
3 B u f f a r d D
.
C o n t , i b u t i。 n 蔺 l , 万亡u d e d e l , e x p r e s s i o n d 。 `百n o m e r 。 。 i n a i r e d 。 v 三。 i。 r a b。 , T h石s e 3 厄m e
C y
e l e
, u n i , e r s i t 色 P a r i s 顶 , 立9 8 0 : 1~ 4 3 .
一 B u f f a r d D e t a l . C o m p l e x i t了 o f p o l了 s o m a l p o l r a d e n y l a t e d R N A s i n V i c i a f a ba m e r i s f e口 a t i e r o o t
e e l ls E u r J B i o c h e m
·
1 0 5 2 ; ( 一2 9 ) : 一2。~ 1 3`
5 D u r a n d B & L o u i s J一 P
·
M a 1e s t e r i 1e a n d C y t o k i n i n a c t i o n i n m e r e u r i a 1 i s a n n u a L
.
( Z n = 1 6 ) i
n
L i n s k e n s H F ( E d ) N
o r t h H o l la n d P u b l i s il i n g C o m p a g n 了 A m s t e r d a m , 10 74 : 3 2 7~ 5 3 `
e G o l d b e r g R B e t a l
·
A b u n d a n e e d i v e r s i t r a n d r e g o l a t i o n o f 口R N A S e q u e n s e t s i n S o y b e a n
e m b r y o g e n e s i s D e 下 B i o l , 19 5 1 ; (名3 ) : 2 0 1~ 2 1 7
了 Ja c q牡 e t M e t a l · oC m p l e x i t y
o
f
n u e l e a r a n d P 0 1y s o m a l p o l y a d e n y l a t e d R N A i n a p lu r i p o t o n t
e m b r 了o n a l C a r c i no m a c e l l l i n e · B I O e h e m 1 9 7 8 ; ( 1 7 ) . 69
5 Y o L o n g X i
.
P o P吐 la t i o n s d ’ A RN s p o l r ( A ) + C了t o p l a s m i q u e s S P万e i f i q u e s d e la s t e r i l i t 亡 m a l e C h e z
M e r c u r i a l i s a o n u a L
.
( Z
n ` 一6 ) C R A e a d . S e i . Pa r i s , 19 8 7 ; t . 3 o s , S补 i e l , 5 0 3~ 5 0 6
李
么心 湖 南 农 学 院 学 报 105 。年 3月
S T D UI E S O FC Y TO P LA S M IC PO LY (A )
+ R NA
O F RE O P R DC UI T VEA O G R NS I N
.
S E VE RA S LE X UA L TY PE S
HO M O O G O L USA N DE H TE RO O LG O US M O E LC L UA R HY B RI DI ZA TI O NS
Y u Lo ng xi
( T五e De pa r tm e n to f Ba s ic S c i e nc e s )
A A S C B T R T
T he K i ne ti e re a s s o e i a ti o n be t we e e ny to p la s m i e po ly (A )
+ RA Ns f ro m f lo we r
bu ds a n d t he i re o m P le m e n ta ry DA N ha s be e ns tu i de di s e n ve ra ls e xu a l ty Pe ,
o f 洲以e r e“ r宕a 艺15 “ 九“ a ( Z n = 16 ) . H o m o Io g O u s h y b r i d i z a t i o n s b e tw e e n e D N A s
a n d t h e i r e o m P l e t s s h o w e d t h a t t h e r e s t o r e d m a l e h a d t h e m o s t e o m P l e x i t v i n
n u e l e o t i d a n d m o s t s P e e i e s o f m e s s e n g e r R N A ; t h e s t e r i l e m a l e w a s t h e s e e o n d
a n d t h e f e r t i l e m a l e w a s t h e l e s t
.
H e t e r o l o g o u s h y b r i d i z a t i o n s h o w e d t h a t
t h e r e w e r e d i f f e r e n t s e q u e n e e s i n t h e i n t e r m e d i a t e c l a s s a n d i n t h e r a v e c l a s s
b e t w e e n s t e r i l e m a l e a n d r e s t o r i n g m a l e
.
A n o b v i o u s d i f f e r e n c e a P P e a r e d i n
t h e a b a n t a n t e l a s s b e tw e e n s t e r i l e m a l e a n d f e r t i l e m a l e
,
a n d t h i s d i f f e r e n e e
w a s m a i n t a i n e d t o t h e i n t e r m i d a t e e l a s s a n d t h e r a r e e la s s
.
D i s P i t e t h e P h y 一
n o t i p e o f f e r t i l e m a l e a n d r e s t o r e d m a l e w a s i d e n t i e
,
b u t t h e i r p o l y ( A )
+ R N A s
w e r e d i f f e r e n t
.
I t i n d i e t e d t h a t t h e d i f f e r e n e e a PP e a n e d i n t r a n s c r i P t i o n o r i n
P r e t r a n e r i P t i o n o f m R N A b e t w e e n t w o t y P e s
.
S U B J EC T W O R D S E
u P h o r b i a e e a e
:
M o l e e u l a r h y b r i d i z a t i o n
;
D N A 一 R N A h y b r i -
d i劝 t i o n ; H O m o l og y ; H e t e r o l o g y
F R E E T E RM S M君 r e u r 玄a 乙艺5 a n九 u a I J .
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