全 文 ：浙江大学学报 (农业与生命科学版 )　 26( 6): 588～ 592, 2000
Journal of Zhejiang Un iversity ( Ag ric. & Life Sci. )
　　收稿日期: 2000-03-26
基金项目: 国家九五重点科技攻关项目 ( 96-015-01)
作者简介: 谢建坤 ( 1965- ) ,男 ,江西临川县人 ,助理研究
员 ,博士生 ,主要从事农业生物技术研究工作 .
文章编号: 1008-9209( 2000) 06-0588-05
青菜子叶离体再生体系的建立
谢建坤1 , 崔海瑞 1 , 舒庆尧 1 , 夏英武 1 , 寿森炎 2
( 1. 浙江大学 原子核农业科学研究所 , 浙江杭州 310029; 2. 浙江大学园艺系 , 浙江杭州 310029)
摘　要: 以子叶为外植体 ,研究了苗龄、培养基中 Aga r浓度、 BA与 N AA的组配和添加 AgNO3、 GA3对
子叶产生不定芽的影响 . 结果表明 , 5～ 9 d苗龄的外植体最易诱导出不定芽 ;培养基中 BA浓度是影响
不定芽形成的关键 , BA浓度低于 2 mg /L , 不定芽难以发生 , BA 6 mg / L与 NAA 0. 05 mg /L的搭配有
利于不定芽形成 ; 在一定范围内不定芽发生频率随着 Aga r浓度的提高而提高 ;培养基中添加 5 mg /L
AgNO3 , 2～ 3 mg /L GA3可以提高不定芽的发生频率 ;在此基础上建立了青菜离体再生体系 ,利用该体
系能够获得较高的芽苗再生频率 ,但存在着青菜基因型间的差异 .
关　键　词: 青菜 ; 子叶 ; 再生体系
中图分类号: 　　　文献标识码: A
X IE Jian-kun1 , CU I Hai-rui1, SHU Qing-yao1 , X IA Ying-wu1 , SHOU Sen-yan2 ( 1. Institute of Nucle-
ar Agricultural Sciences, Zhejiang Univ . , Hangz hou 310029, China; 2. Horticulture Department,
Zhejiang Univ. , Hangzhou 310029, China )
In v itro plant regenerat ion system from cotyledon of Ch inese cabbage (Brassica campestris ssp. chinensis
L. ) . Journal of Zhejiang Univ er sity ( Ag ric. & Life Sci. ) , 2000, 26( 6): 588～ 592
Abstract: The effec ts o f facto rs including seedling age, differ ent combina tions of BA and NAA concen-
trations, Agar concentra tion, AgNO3 and GA3 on bud induction fr om coty ledon a re ana ly sed. The re-
sults indicate tha t the explants fr om 5-9 day s o ld seedling a re th e most efficient to induce adventious
buds. The concentra tion of BA is the key fac to r to adventious buds diffe rentiation. BA low er than 2
mg /L , is harder to induce adventious buds. The com bina tions of 6 mg /L BA and 0. 05 mg / L NAA can
improve adventious buds induction. The cultur e medium with 12 g /L Aga r, 5 mg /L AgNO3 and 2-3
mg /L GA3 can inc rease the frequence of differ entiation. Acco rding to these r esults, a pro cedure fo r in-
duction of adventious buds and regeneration sy stem for Chinese cabbage is estabished. By using this
sy stem , high r egenera tion fr equence can be obtained, but could be affected by geno types.
Key words: Brassica campestris ssp. chinensis L; co tyledon ; r egenera tion sy stem
　 　 青 菜 ( B rassica. campestris ssp.
chinensis ) ,属十字花科芸苔属植物 ,是我国南
方主要蔬菜 .长期以来由于病虫的危害 ,造成青
菜产量下降 ,品质变劣 ,影响市场的供应 ,因而
急需培育出抗病虫害的青菜品种 .
　　向青菜体内导入抗病抗虫基因 ,使其具有
天然抗性 ,是培育抗病虫青菜品种的重要技术
之一 .但是 ,青菜的植株再生较之其他芸苔属植
物困难 ,从而严重地制约了转基因技术在青菜
品种改良上的应用 . 近年来国内外学者在青菜
离体再生方面作了许多探索 ,但高频率的再生
体系报道极少 . Rat tanaw ongna ra S. 从不结球
白菜叶片、叶柄愈伤组织获得少量的再生植
株 [1 ] . 我国蔡小宁等通过不同细胞分裂素对外
植体的愈伤组织进行诱导 ,植株再生频率最高
可达 10% [2 ] . 目前关于青菜离体再生频率仍以
侯喜林、曹寿春的报道为最高 ,他们以矮脚黄的
子叶为外植体 ,得到 70%的芽苗分化频率 [3 ] .
随后张智奇等、王凌建等报道的再生频率分别
为 50%及 56. 3% ,他们均认为 AgNO3可以提
高青菜的离体再生频率 [4, 5 ] .唐慧、肖兴国、陈珈
报道了 GA3能促进小白菜芽苗分化 ,他们以苏
州青、香港菜心的子叶为外植体得到了 65%的
芽苗再生频率 [6 ] .
　　本试验以杭州油冬儿等 8个基因型的子叶
为外植体 ,通过研究培养基中 BA与 NAA的
组配、 Agar的使用浓度以及 AgNO3和 GA3等
因素对青菜离体培养的影响 ,建立了一个较高
频率的青菜离体再生体系 ,从而为青菜的基因
转化提供了一个理想的转化受体培养方法 .
1　材料与方法
1. 1　供试材料　　以油冬儿、苏州青、香港菜
心等 8个基因型的种子为材料 ,以其无菌实生
苗的子叶为外植体 .
1. 2　无菌苗的培养　　种子先用 75%的酒精
浸泡 0. 5 min,无菌水冲洗两次 ,每次 2 min,随
后用 0. 1%的升汞浸泡 15 min,无菌水冲洗五
次 ,每次 5 min.将消毒种子接种于无激素的 1 /
2 M S培养基上先进行暗培养 ,发芽后培养条
件为 16 h光照 ,光强 2 000～ 3 000 lx ,温度为
25℃ . 接种后 3 d种子萌发 ,开始形成无菌苗 .
1. 3　不定芽诱导　　取 3、 5、 7、 9、 11 d苗龄的
无菌苗 ,用手术刀切下带 2 mm子叶柄的子叶 ,
将子叶柄基部插入含不同浓度的 BA与 NAA
组配 (表 1)、不同浓度的 Agar ( 8, 10, 12 g /L ) ,
AgNO3 ( 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 mg /L )以及 GA3 ( 0,
1, 2, 3, 4, 5 mg /L )的分化培养基 ,接种后置于
培养室 ,每日光照 16 h ,温度为 25℃ ,培养 20 d
后调查不定芽数 .
2　结果与分析
2. 1　子叶柄对离体培养的反应
　　在 MS的分化培养基上接种不同苗龄的子
叶 , 3 d后子叶开始膨大 , 10 d后在子叶柄切口
处有小芽产生 ,每个外植体可长出 1～ 5个小
芽 . 子叶柄长度为 2 mm时有利于不定芽的形
成 ,子叶柄过长 ,会因顶芽的生长抑制不定芽的
产生 ,过短亦不利于不定芽的形成 . 另外 ,从本
试验还观察到外植体的生理状态对不定芽的发
生有影响 ,无菌苗生长健壮 ,较易诱导出不
定芽 .
2. 2　分化培养基中 BA与 NAA浓度的筛选
　　我们仍选用 BA与 NAA两种常用的激素
对油冬儿子叶进行不定芽的诱导 ,以筛选出最
佳使用浓度 . BA与 N AA浓度组配及筛选结果
见表 1,由表 1可见 BA为 2 mg /L的 4个组合
均未能诱导出不定芽 ; BA为 4 mg /L的 4个
组合中 ,以 4mg / L BA与 0. 1mg / LN AA的组
表 1　 BA与 NAA配比对油冬儿不定芽诱导效果的影响
Table 1　 Ef fect on adventiou s bud induction of com binated
BA and N AA
BA /
mg /L- 1
N AA
mg /L- 1
外植体
数 /个
不定芽外
植体数 /个
芽诱导
频率 /%
2 0 72 0 0
2 0. 05 72 0 0
2 0. 1 72 0 0
2 0. 2 72 0 0
4 0 72 1 1. 4
4 0. 05 72 4 5. 6
4 0. 1 72 13 18. 1
4 0. 2 72 2 2. 8
6 0 72 12 16. 7
6 0. 05 72 22 30. 6
6 0. 1 72 21 29. 2
6 0. 2 72 14 19. 4
8 0 72 9 12. 5
8 0. 05 72 16 22. 2
8 0. 1 72 15 20. 8
8 0. 2 72 9 12. 5
10 0 72 6 8. 3
10 0. 05 72 11 15. 3
10 0. 1 72 14 19. 47
10 0. 2 72 8 11. 1
589　第 6期 　 谢建坤 ,等　　青菜子叶离体再生体系的建立 　 　　　　
合诱导频率较高 ,为 18. 1% ;而当 BA为 6 mg /
L时 ,诱导效果最佳 ,平均诱导率为 24. 0% ,且
以 6 mg /L BA与 0. 05 mg /L N AA的组配不
定芽的发生频率最高 ,为 30. 6% ; BA为 8 mg /
L时诱导效果亦较好 ,其频率变幅为 12. 5%～
22. 2% ; BA为 10 mg /L时 ,诱导效果较差且形
成白色棉花状愈伤组织 . 在使用的 3个 NAA
浓度中 ,以 NAA为 0. 2 mg /L的效果较差 ,但
该 3种 NAA浓度均易于发根 . 由此可见 ,在对
子叶进行不定芽诱导时 , BA为关键因子 , BA
浓度低于 2 mg /L ,不定芽较难形成 . 就本实验
所选用的基因型油冬儿而言 ,以 6 mg /L BA与
0. 05 mg /L N AA的组配能获得较高频率的不
定芽 .
2. 3　 Agar浓度对不定芽分化的影响
　　以品种油冬儿为材料 ,培养基中 Agar浓
度对不定芽分化的影响见图 1,由图 1可知 ,在
本实验使用的 3种 Aga r浓度中 ,不定芽诱导
频率随着 Agar浓度的提高而提高 ,当 Agar浓
度为 12 g /L时 ,不定芽诱导频率明显高于 8 g /
L的处理 ,其再生频率提高了 6. 1% ,但 Agar
浓度为 10 g /L的处理与 12 g /L的处理芽再生
频率相差不大 ,分别为 33. 2%和 33. 8% .
图 1　 Agar浓度对不定芽诱导的影响
Fig. 1　 Ef fect of agar concen t ration on
induction f requence of bud
2. 4　 AgNO3在分化中的作用
　　在 MS+ 6 mg /L BA+ 0. 05 mg /L N AA
的培养基上添加一定浓度的 AgNO3能显著地
提高芽苗的再生 (表 2) ,且这种效益在两个品
种上的反应基本一致 . 添加 3～ 7 mg /L的 Ag-
NO3均能提高芽的诱导频率 ,但以 5 mg /L的
AgN O3效果最佳 . 油冬儿在添加 5 mg /L的
AgN O3时 ,其芽的再生频率提高一倍 ,高华白
菜则提高一倍多 .
表 2　 AgNO3对分化的影响
Table 2　 Ef fect of Ag NO3 on adventious bud induction
品 种 AgNO3 /
mg L- l
外植体
数 /个
不定芽外
植体数 /个
芽诱导
频率 /%
油冬儿 0 72 20 27. 8
3 72 28 38. 9
5 72 40 55. 6
7 72 35 48. 6
9 72 19 26. 4
高华白菜 0 72 24 33. 3
3 72 31 43. 1
5 72 42 58. 3
7 72 41 56. 9
9 72 24 33. 3
图 2　 GA3对不定芽诱导的影响
Fig. 2　 Ef f fect of GA3 on induction f requence of bud
2. 5　 GA3对不定芽的分化的影响
　　以油冬儿为材料 , GA3对芽的诱导作用明
显 (图 2) .通常在不含 GA3的分化培养基中 ,由
子叶诱导出不定芽所需的时间大约为 10～ 20
d,而当培养基中添加一定浓度的 GA3时 , 7 d
后可以看到子叶柄切口处有小芽产生 ,随后每
个外植体产生出多个不定芽 ,最高达 16个 . 在
提高芽的诱导频率上 , GA3的作用亦十分明
显 , GA3为 1 mg /L时 ,芽诱导频率为 59. 3% ,
与对照基本相近 ;当 GA3为 2 mg /L时 ,芽的分
化频率则显著地提高 ,为 72. 2% ,较对照提高
了 16. 6% ,在培养基中添加 3 mg /L的 GA3
时 ,芽的发生频率最高 ,为 77. 8% ,较对照增加
了 22. 2% .因此在分化培养基中添加 2～ 3 mg /
L的 GA3可以使子叶柄较快地分化出不定芽 ,
590　　　　 　 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 ) 　 第 2 6卷　
且能提高不定芽的发生频率和每个外植体诱导
的不定芽个数 .
2. 6　最佳苗龄的确定
　　苗龄对子叶不定芽诱导的影响见图 3,由
图 3可以看出苗龄是影响不定芽形成的关键因
素 . 5～ 9 d苗龄的外植体可以获得较高的芽苗
再生 ,苗龄过长、过短对不定芽的形成均不利 .
品种油冬儿以 7 d苗龄的子叶对不定芽的诱导
效果最佳 , 5 d的次之 ;高华白菜亦以 7 d的苗
龄最好 , 9 d的次之 ;香港菜心则以 9 d苗龄的
外植体最适于不定芽的诱导 , 5～ 7 d苗龄的外
植体不定芽发生频率亦较高 .
图 3　苗龄对不定芽诱导的影响
Fig. 3　 Ef fect of s eedling age on bud induction
图 4　基因型间的差异
Fig. 4　 Ef fect of genotype on bud induction
2. 7　基因型间的差异
　　根据上述结果 ,我们建立了青菜离体再生
体系 ,并以油冬儿、高华白菜、香港菜心等八个
品种进行离体培养比较 ,结果以苏州青不定芽
诱导频率为最高 ,为 77. 1% ; 高华白菜次之 ,随
后依次为香港菜心、油冬儿、矮蒲头、矮抗青、五
月蔓 ,以四月蔓不定芽发生频率最低 ( 43. 5% ).
上述结果表明该再生体系能较好地诱导出不定
芽 ,但基因型间存在着一定的差异 (图 4) .
2. 8　生根与驯化移栽
　　将分化的不定芽移至 1 /2 M S+ 0. 1N AA
的生根培养基上 ,几乎 90%的不定芽在 10 d左
右开始长根 , 20 d后植株叶片展开 ,长势良好 .
开瓶练苗 5 d左右移至网室营养钵 ,苗生长
正常 .
3　讨　论
　　青菜离体再生较其他芸苔属作物困难 ,我
们以青菜子叶为外植体 ,选用 BA和 NAA这
两种常用的激素诱导不定芽再生植株 . 通过
BA与 NAA的组配筛选 ,认为 6 mg /L BA与
0. 05 mg /L N AA的组配有利于不定芽的的形
成 . 在此基础上对培养基中 Agar浓度进行试
验 ,得出较高浓度的 Aga r可以提高青菜离体
再生频率的结论 . 该结果与 F. L. Zhang.的报
道 [ 7]相似 . Agar主要用来使培养基凝固 , Aga r
浓度的提高 ,从而改变培养基中水份的存在状
态 ,同时培养皿中湿度下降 ,改变了离体再生的
小气候而使再生频率提高 .
　　 AgNO3对芸苔属作物离体再生的作用巳
有较多研究 ,但使用的浓度因基因型而
异 [ 8～ 12] . 我们的试验结果认为 5 mg /L 的
AgN O3有利于青菜的芽苗再生 . GA3是高等植
物中存在较为普遍的一种赤霉素 ,有较强的生
理活性 ,其对植物的离体再生作用在波菜上曾
有报道 [13 ] ,而对小白菜的离体再生作用仅见唐
慧等的报道 [6 ] . 我们在青菜离体再生培养基中
加入 2～ 3 mg /L的 GA3 ,可使青菜的再生频率
大幅度地提高 ,且每个外植体产生芽的个数增
加 ,其作用机制有待于进一步研究 .
　　不同苗龄的无菌苗对芽苗的再生有较大的
影响 ,且因基因型而异 [ 14] . 本试验在对油冬儿、
高华白菜、香港菜心三个基因型进行试验的基
础上认为对青菜子叶进行不定芽的诱导应以 5
～ 9 d的苗龄为宜 ,苗龄过长或过短均使再生
频率下降 .
　　在考虑培养基成份、外植体生长状态等诸
多因素的基础上 ,我们建立了苏州青、油冬儿、
591　第 6期 　 谢建坤 ,等　　青菜子叶离体再生体系的建立 　 　　　　
高华白菜、香港菜心等青菜子叶为外植体的离
体再生体系: 选用苗期为一周龄的无菌苗 ,切取
其子叶 ,带柄约 2 mm ,子叶柄基部插入含 12
g /L的 Agar, 6 mg /L BA, 0. 05 mg /L N AA, 5
mg /L AgNO3 , 3 mg /L GA3的 MS培养基中进
行不定芽的诱导 ,一周后可见不定芽的发生 ,且
每个外植体可产生多个不定芽 ,将不定芽移到
1 /2 M S+ 0. 1 mg /L N AA的培养基上诱导成
幼苗 ,得到完整的再生植株 ,并在此基础上对八
个基因型进行实验 ,均得到较高的芽苗再生频
率 . 该再生体系应有利于转化的顺利进行 . 因
此 ,我们认为在青菜难以通过愈伤组织诱导成
苗的情况下 ,以其子叶为外植体建立离体再生
体系是完全可行的 . 但由于基因型间存在着一
定的差异 ,因此对不同的基因型应选择不同的
诱导培养基以最大限度地提高其再生频率 .
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(责任编辑　邓君奇 )　　
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