全 文 ：中药新药与临床药理 2013年 1月第 24卷第 1期
收稿日期：2012-10-17
作者简介：石瑞丽，女，博士研究生，硕士生导师，教授，研究方向：神经药理生理。Email：ruilishi@sina.com。通讯作者：李培锋，教授，博士
生导师，研究方向：兽医药理学与毒理学。Email：lpfneimeng@163.com。陈乃宏，研究员，博士生导师，研究方向：神经分子生物学和神经药理
学。Email：chennh@ imm.ac.cn。
基金项目：国家自然科学基金项目（U0832008，30973887）。
·药效与毒理学研究·
瓜子金皂苷己神经保护作用的体外研究
石瑞丽 1，2，3，李培锋 1，陈乃宏 2（1. 内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010018； 2. 中国医学科学院药物研究
所，北京 100050；3. 包头医学院，内蒙古 包头 014040）
摘要：目的 观察瓜子金皂苷己（PGSF）对大鼠原代皮层神经细胞和 PC12细胞的保护作用及其机制。方法
建立体外氧糖剥夺/复灌（OGD/R）、氧化应激及去血清模型，以 MTT法检测细胞存活率，光镜下观察细胞形
态，Western blotting法检测蛋白表达。结果 PGSF（10，1，0.1μmol·L-1） 可明显增加 OGD/R、氧化应激和去
血清处理细胞的存活率（P < 0.01，P < 0.05）；在 OGD/R模型中，PGSF（10、1、0.1μmol·L-1）还可改善神经元形
态，减少 Caspase-3活性片段的表达（P < 0.01，P < 0.05），并与 MAPK通路抑制剂协同降低神经元死亡率（P <
0.01，P < 0.05）；PGSF（10，1μmol·L-1）可增加神经元 Bcl-2/Bax表达比值（P < 0.01，P < 0.05），并减少 p53的
表达（P < 0.05）。结论 PGSF对 OGD/R、氧化应激及去血清导致的神经元或 PC12细胞损伤具有保护作用，在
OGD/R模型中，该作用机制与其调节凋亡相关蛋白的表达相关，并可能与其抗氧化应激功能有关。
关键词：瓜子金皂苷己；氧糖剥夺/复灌；去血清；氧化应激；凋亡
中图分类号：R285.5 文献标志码： A 文章编号：1003-9783（2013）01-0001-05
doi：10.3969/j.issn.1003-9783.2013.01.001
Study on Neuroprotective Effect of Polygalasaponin F in Vitro
SHI Ruili1，2，3，LI Peifeng1，CHEN Naihong2（1. Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018 Inner Mon－
golia Autonomous Region，China；2. Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing
100050，China；3. Baotou Medical College，Baotou，Inner Mongolia Autonomous Region 014040，China）
Abstract：Objective To study the protective effect and related mechanism of polygalasaponin F（PGSF）on prima－
ry cultured rat cerebral cortical neurons and PC12 cells. Methods Oxygen -glucose deprivation and reperfusion
（OGD/R），oxidative stress and serum deprivation models in vitro were established respectively. The viability of cells
was determined by MTT assay，cell morphology was observed under light microscopy，and the expression of proteins
was detected by Western blotting. Results PGSF at the concentration of 10，1 or 0.1 μmol·L-1 could increase the via－
bility of neurons or PC12 cells pretreated by OGD/R，oxidative stress or serum deprivation（P < 0.01 or P < 0.05），it
also improved the morphology of neurons and lowered the expression of cleaved Caspase-3 in OGD/R model （P <
0.01，P < 0.05），and showed synergistic action on neuron death rate with specific inhibitors of MAPK signal pathway
（P < 0.01 or P < 0.05）. PGSF at the concentration of 10 or 1 μmol·L -1 could up-r egulate the ratio of Bcl -2/
Bax proteins（P < 0.01 or P < 0.05） and lower the expression of p53 in neurons in jured by OGD/R（both P <
0.05）. Conclusion Our studies have revealed the markedly neuroprotective effect of PGSF in OGD/R，oxidative
stress or serum deprivation model in vitro. The effect of PGSF is performed partly by regulating the expression of
apoptosis-related proteins and is probably associated with antioxidant activity in OGD/R model.
Keywords：Polygalasaponin F；Oxygen -gluc ose deprivation and reperfusi on （OGD/R）； Serum deprivation；
Oxidative stress；Apoptosis
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2013 Janunary，Vol． 24 No． 1
表 1 PGSF对去血清诱导 PC12细胞死亡的影响（x± s，n=6）
Table 1 Effect of Polygalasaponin F on viability of PC12 cells
injured by serum deprivation
组别 剂量/μmol·L-1 OD值 相对存活率/%
空白对照组 0.83±0.07** 100.0
模型组 0.38±0.06 45.8
PGSF组 10 0.63±0.05** 75.4
PGSF组 1 0.60±0.07** 72.1
PGSF组 0.1 0.47±0.03* 56.8
注：与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
瓜子金皂苷己（polygalasaponin，PGSF）是从远志
属中草药瓜子金中分离得到的齐墩果烷型三萜皂苷
单体，具有抗抑郁、镇静、抗焦虑和催眠的作用。最
新研究工作表明，PGSF 对 MPP+所致 PC12 细胞损伤
具有保护作用 [1]，并可能通过增强突触可塑性发挥益
智作用 [2]。本研究旨在探讨 PGSF 对氧糖剥夺/复灌
（OGD/R）、氧化应激和去血清导致的原代神经元或
PC12细胞损伤是否具有保护作用及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 药物及试剂 瓜子金皂苷己（PGSF），由中国医学
科学院药物研究所合成室提供（纯度 > 98 %），用二
甲基亚砜（DMSO）溶解为 1 mol·L-1储备液，用时以培
养基稀释；神经节苷脂，齐鲁制药有限公司，批号：
H20103722。
P53、Bcl-2 和 Bax 一抗、羊抗兔 IgG 抗体，美
国 Santa-Cruz公司；DMEM培养基、DMEM/F-12培
养基、胎牛血清、马血清，美国 Gibco 公司；过氧化
氢（H2O2）、噻唑蓝（MTT）、胰蛋白酶、β-actin抗体，
美国 Sigma公司；Caspase-3抗体，美国 Cell Signaling
Technology；SB203580、PD98059及 SP600125，碧云
天生物技术研究所；ECL化学发光检测试剂盒、BCA
蛋白定量试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司。
1.2 细胞株及动物 PC12细胞，购于中国医学科学
院基础研究所细胞中心；出生当天的清洁级 SD新生
鼠，购于北京维通利华公司，合格证号：SCXX-（京）
2007-0001。
1.3 仪器 Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪，美
国赛默飞世尔公司；Olympus IX70-142倒置显微镜，
日本奥林巴斯公司；FUJI LAS-3000化学发光及影像
分析仪，日本 FUJIFILM公司。
1.4 细胞培养及分组 PC12 细胞用含 5 %胎牛血清
和 5 %马血清的 DMEM培养基常规传代培养，在对
数生长期以 3×103个/孔接种于 96孔培养板培养 24 h，
用于药物处理。参照文献[3]并略作改动进行大鼠大脑
皮层神经元的原代培养：新生鼠断头取脑，分离大脑
皮层并剪碎，于 37 ℃水浴中用 0.125 %胰蛋白酶消
化 30 min，终止消化，离心并吹散细胞，过滤后用
完全培养基（含 10 %FBS和 10 %ES的 DMEM/F-12）
重悬并接种培养板，48 h后换液，第 3天加阿糖胞
苷（终浓度10μmol·L-1）处理细胞24h，第6天用于实验。
实验设空白对照组、模型组和模型加药物组，除
空白对照组外，其余各组给予造模处理。PGSF共设
3 个剂量，分别为 10，1，0.1μmol·L-1；SP600125、
SB203580、PD98059及阳性对照神经节苷脂的终浓度
均为 10 μmol·L-1，药物在造模全过程中给予。
1.5 模型制备 去血清模型：将 PC12细胞的完全培
养基换成无血清培养基，继续培养 48 h。过氧化氢模
型：用含终浓度 200 μmol·L-1过氧化氢的完全培养基处
理 PC12细胞 24 h。OGD/R模型：原代皮层神经元经
漂洗 1次后加入无糖 Earle謘s液，将培养板置于含95 %
氮气和 5 % CO2的缺氧培养箱内 6 h，之后换为完全
培养基于含 5 % CO2的孵箱中复氧培养24 h。
1.6 细胞存活率检测 细胞造模及给药结束后，采用
MTT 法检测细胞存活率。加入终浓度为 5 g·L-1 的
MTT 于 37 ℃孵育 4 h，吸弃上清，加入 DMSO100
μL/孔，震荡至颗粒溶解，10 min 后在酶标仪上测
定 570 nm 处光密度（OD）值。细胞相对存活率=
（实验组平均 OD值/空白对照组平均 OD 值）×100 %
（以不含细胞的培养液为空白组调零）。
1.7 Western blotting法检测蛋白表达 细胞造模及药
物处理结束后，弃上清，收集细胞，4℃，2500 r·min-1
离心 5 min，取沉淀，用 PBS洗 2次，加入细胞裂解
缓冲液 100 μL，冰浴 30 min，收集细胞裂解液，
12000 r·min-1离心 30 min，取上清采用 BSA法进行
蛋白定量。每组取蛋白样品 10 μg 上样，经 SDS-
PAGE电泳分离，然后转移至 PVDF膜上，3 % BSA
室温封闭 2 h，加一抗于 4 ℃孵育过夜，TBST漂洗，
加 HRP 标记羊抗兔二抗室温孵育 2 h，ECL 显色，
化学发光仪成像。实验重复 3次。
1.8 统计学处理方法 数据以均数 ±标准差（x± s）表
示，用 SPSS 12.0 统计软件进行分析。Western blotting
实验条带用 GelPro 3.2软件进行灰度扫描和分析。
2 结果
2.1 PGSF对去血清损伤的 PC12细胞存活率的影响
见表 1。经去血清处理 48 h后，PC12细胞存活率明
显降低；与模型组比较，PGSF 10，1及 0.1 μmol·L-1
都可显著提高细胞存活率，差异均有统计学意义（P <
0.01或 P < 0.05）。
2· ·
中药新药与临床药理 2013年 1月第 24卷第 1期
2.2 PGSF对过氧化氢损伤的 PC12细胞存活率的影
响 见表 2。经 200 μmol·L-1 H2O2 处理 24 h 后，
PC12细胞存活率明显降低；与模型组比较，PGSF各浓
度组的细胞存活率都显著提高，差异均有统计学意义
（P < 0.01或 P < 0.05）。
2.3 PGSF对 OGD/R损伤的原代神经细胞存活率的
影响 见表 3 。OGD/R处理可使原代神经细胞存活
率明显降低；与模型组比较，PGSF各剂量组及阳性
对照神经节苷脂都可显著提高细胞存活率，差异有统
计学意义（P < 0.01），PGSF的细胞保护作用呈现明显
的浓度依赖性。
2.4 PGSF对 OGD/R损伤的原代神经细胞形的影响
见图 1。正常神经元胞体饱满舒展，多呈长梭形，细
胞边界清楚，折光性好，神经突起较长且交织成网，
形成丰富的突触联系。OGD/R损伤后，神经细胞数
量减少，胞体皱缩变圆，细胞间隙增大，折光性降
低，突起变少且细小。PGSF及神经节苷脂作用后，
神经细胞形态改善，神经元突起增加变长，神经元间
网络联系增多。
A.空白对照组；B.模型组；C. 10 μmol·L-1 PGSF组；D. 1 μmol·L-1 PGSF
组；E. 0.1 μmol·L-1 PGSF组；F. 10 μmol·L-1神经节苷脂组
图1 PGSF改善 OGD/R处理的原代神经细胞形态 （×100）
Figure 1 Polygalasaponin F reverses morphology changes induced
by OGD/R in primary cultured neurons（×100）
2.5 PGSF 与 MAPKs 抑制剂联合应用对 OGD/R 损
伤的原代神经元的保护作用 见图 2。与 OGD/R 模
型组比较，SP600125（JNK 抑制剂）、SB203580（p38
抑制剂）及 PD98059（ERK1/2抑制剂）单独应用都可使
细胞存活率显著增加（P < 0.01）；与 PGSF单独用药
组比较，3种抑制剂与 PGSF联合应用后均可提高细
胞存活率（P < 0.01或 P < 0.05）。
注：与 OGD/R组比较，**P ＜ 0.01；与 PGSF 单独用药组比较， #P <
0.05，##P < 0.01。
图2 PGSF 与 MAPKs 抑制剂合用对 OGD/R 诱导原代神经
元死亡的影响（x± s，n=6）
Figure 2 Effects of PGSF combined with specific inhibitors of
MAPK signal pathway on viability of primary cultured neurons in-
jured by OGD/R
2.6 PGSF对 OGD/R损伤的原代神经元凋亡相关蛋
白表达的影响 见图 3。与空白对照组比较，OGD/R
处理可使神经元促凋亡蛋白 Bax表达增加，Bcl-2/Bax
比值明显降低（P ＜ 0.01），10 μmol·L-1和 1 μmol·L-1
PGSF可使原代皮层细胞 Bcl-2/Bax比值分别升高为
模型组的 6.5倍和 3.6倍（P ＜ 0.01，P ＜ 0.05）。
另外，活性 Caspase-3 裂解片段 p17及 p53蛋白
在 OGD/R组表达水平明显升高（P ＜ 0.01），PGSF可
表 2 PGSF对过氧化氢诱导PC12细胞死亡的影响（x±s，n=6）
Table 2 Effect of Polygalasaponin F on viability of PC12 cells
injured by H2O2
组别 剂量/μmol·L-1 OD值 相对存活率/%
空白对照组 0.78±0.03** 100.0
模型组 0.66±0.04 84.6
PGSF组 10 0.77±0.05** 98.4
PGSF组 1 0.73±0.04** 93.1
PGSF组 0.1 0.72±0.06* 92.4
注：与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
表3 PGSF对 OGD/R损伤的原代神经细胞死亡的影响（x ± s，
n=6）
Table 3 EffectofPolygalasaponinFonviabilityofprimarycultured
neurons injured by OGD/R
组 别 剂量/μmol·L-1 OD值 相对存活率/%
空白对照组 0.75±0.04** 100.0
模型组 0.38±0.03 50.2
PGSF组 10 0.66±0.04** 88.2
PGSF组 1 0.57±0.03** 76.2
PGSF组 0.1 0.45±0.02** 59.2
神经节苷脂组 10 0.55±0.03** 72.5
注：与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2013 Janunary，Vol． 24 No． 1
以使二者表达水平明显回落，以 10 μmol·L-1PGSF效
果最为明显，见图 4。
注：与 OGD/R模型组比较，*P < 0. 05，**P < 0. 01。
图3 PGSF上调 OGD/R损伤的原代神经元 Bcl-2/Bax 比值
（x± s， n=3）
Figure 3 Polygalasaponin F up-regulates ratio of Bcl-2/Bax
proteins in primary cultured neurons injured by OGD/R
注：与OGD/R模型组比较，*P < 0. 05，**P < 0. 01。
图4 PGSF下调 OGD/R损伤的原代神经元 p53蛋白及活性
Caspase-3片段表达（x± s， n=3）
Figure 4 Polygalasaponin F down -regulates the expressions of
cleaved Caspase-3 and p53 in primary cultured neurons injured
by OGD/R
3 讨论
脑缺血是一种急性神经退行性改变，再恢复血液
供应后，会发生再灌注损伤，使脑功能会出现更加严
重的障碍，神经细胞表现出坏死和凋亡两种死亡
形式。
本课题建立大鼠原代皮层细胞氧糖剥夺/复灌模
型，用以模拟脑缺血再灌注损伤。经检测后首次证
明，PGSF可明显提高 OGD/R处理后大鼠原代皮层细
胞的存活率，改善细胞形态，说明 PGSF 对 OGD/R
处理的神经细胞具有明显的保护作用。
作为细胞凋亡的调控基因，Bcl-2家族、Caspase
家族及 p53基因等都发挥着重要的功能。Bcl-2家族
基因中，Bcl-2基因是抗细胞凋亡基因的代表，Bax
基因是促细胞凋亡基因的代表。线粒体外膜通透性由
Bcl-2家族成员决定，其中 Bax蛋白可促使线粒体跨
膜通道的形成，促进细胞色素 C的释放，继而激活
Caspase 级联反应介导的凋亡通路。而 Bcl-2 可与
Bax形成异源二聚体，封闭 Bax形成线粒体孔道的活
性，继而抑制 Bax 的促凋亡效应，故有观点认为
Bcl-2是通过 Bax抑制细胞凋亡[4]，Bcl-2和 Bax二者
比例对决定细胞的命运发挥重要作用。Caspases的活
化是导致细胞凋亡的中心环节。其中 Caspase-3是细
胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，因此也被称为
“死亡蛋白酶”。体内外大量实验结果证实，作为一种
诱导细胞凋亡的重要基因，p53与缺血处理导致的神
经细胞死亡密切相关[5]。p53可通过不同的途径诱导
细胞凋亡，一方面可以上调促凋亡基因的表达，表
达产物如 Bax 、PUMA等可以直接作用于线粒体而诱
导细胞凋亡，或通过阻断抗凋亡蛋白 Bcl-2表达，以
及抑制 NF-κB介导的细胞存活通路而实现；另一方
面也可以直接转位至线粒体，与抗凋亡蛋白 Bcl-2等
形成复合物从而抑制后者功能，继而引发细胞色素 C
的释放[6]。
本研究中 OGD/R组原代神经细胞 Bax表达升高，
Bcl-2/Bax比值下降，Caspase 活性裂解片段 p17表达
增多，p53 蛋白表达水平上调，与同类研究结果一
致。PGSF可逆转以上变化，使细胞 Bcl-2/Bax比值升
高，p17和 p53蛋白表达水平下降。结合 PGSF提高
细胞存活率的结果，说明 PGSF可通过调节凋亡相关
蛋白的表达，抑制线粒体途径介导的细胞凋亡，
发挥神经保护作用。有关信号转导通路的研究正在
进行中。
PC12细胞是大鼠嗜铬细胞瘤细胞，具有很多神
经细胞的特性，常代替神经细胞用于研究。去血清损
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中药新药与临床药理 2013年 1月第 24卷第 1期
痛泻要方中配伍“风药”对 PI-IBS模型大鼠 PAR2 mRNA表达
及炎症介质的影响
胡旭光 1，廖淑莉 2，王颖芳 1，龚梦鹃 1，王 %槾 1，刘沙沙 1，韩 %彬 1（1. 广东药学院中药学院，广东 广州
510006；2. 广州市老人院，广东 广州 510550）
摘要：目的 探讨痛泻要方中配伍风药（防风）对感染后肠易激综合征（PI-IBS）大鼠模型 PAR2 mRNA表达和炎
症介质的影响。方法 采用福氏痢疾杆菌灌胃法复制 PI-IBS 大鼠模型，评价痛泻要方原方、痛泻要方无
防风方、防风的疗效及对结肠黏膜 PAR2 mRNA 基因表达和炎症介质 SP、TNF-α、IL-6 的影响。结果 痛
泻要方原方、痛泻要方无防风方、防风可升高感染后 IBS大鼠的内脏痛觉敏感压力阈值，减少大鼠排稀便次数
收稿日期：2012-10-24
作者简介：胡旭光，男，博士，副教授，研究方向：脾胃病的中医药防治。Email：hxguang21@163.com。通讯作者：韩彬，教授，研究方向：代
谢性疾病及消化系统疾病的中药防治。Email：hblz99@21cn.com。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81173194）。
伤模型是一种研究神经营养因子剥夺性损伤的病理模
型，也是体外用于模拟脑缺血的常用模型之一。本研
究用原代细胞制备的 OGD/R细胞模型中包含着去血
清因素，加之用 PC12细胞制备的去血清损伤模型实
验结果，重复验证了 PGSF的细胞保护作用。
脑缺血后血流重建时，氧化应激损害是脑损伤的
重要机制之一。活性氧可引起生物大分子的氧化损
伤，引发膜脂质过氧化、DNA断裂、胞内蛋白质交
联及多肽链断裂等不可逆损伤，最终导致神经元变性
或坏死。H2O2在铁离子（Fe3+）和超氧负离子自由基存
在时，可以转化成毒性更强的羟自由基。本研究首次
证明了 PGSF对 H2O2氧化应激损伤的神经细胞具有
保护作用，提示 PGSF对抗 OGD/R损伤的作用机制
很有可能还与其减轻细胞内活性氧自由基损伤有关，
通过抗氧化应激而降低细胞死亡率。
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein
kinases，MAPK）是真核生物膜受体信号向细胞内转
导的重要途径，细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路、
C-Jun 氨基末端激酶（ JNK）通路、p38 通路都是其重
要组成部分。目前，JNK、p38 的激活在缺血性脑损
伤中的促细胞死亡作用得到普遍公认[7]，本研究中应
用特异性抑制剂得到的结果与此相符；而 ERK在缺
血性脑损伤中的激活表达情况及其功能还存在很多争
议，Xia Z等[7-8 ]认为 ERK 的激活可保护神经细胞免受
缺血再灌注损伤，而 Zhi-Qiu Wang 等 [9-10]的研究表
明 ERK1/2通路的激活加剧缺血性脑损伤。本研究结
果表明应用 PD98059 可显著增加缺血再灌神经细胞
存活率，支持后者观点。另外，PGSF可与 MAPK通
路抑制剂发挥协同效应。
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（编辑：邓响潮）
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