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神经药理学报
Acta Neuropharmacologica
第 3 卷第 1 期
2013 年 2 月
Vol. 3 No. 1
Feb. 2013
瓜子金皂苷己对鱼藤酮损伤PC-12 细胞的
保护作用及其对CREB的影响
基金项目： 国家自然科学基金项目（No.81274122、No.81102831、No.81173578），创新药物研究开发技术平台建设项目（No.2012ZX09301002-
004、No.2012ZX09103101-006）
作者简介：吴苗苗，女，助教，硕士；研究方向：神经药理学；Tel：+86-0313-4025966，E-mail：miaomiao2076924@126.com
通讯作者：陈乃宏，男，研究员，博士生导师；Tel.：+86-010-63165177，Fax：+86-010-63165177，E-mail：chennh@imm.ac.cn
吴苗苗 1  苑玉和 2  陈乃宏 2
1. 河北北方学院药学系，张家口，075000，中国
2. 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院药物研究所，北京，100050，中国
【摘要】 目的：观察瓜子金皂苷己（polygalasaponin F，PS-F）对鱼藤酮损伤的 PC-12 细胞的保护作用及其对
cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）表达的影响。方法：以鱼藤酮损伤的
PC-12 细胞为模型，通过倒置显微镜观察细胞形态，caspase 3 活性检测试剂盒测定 caspase 3 活性，荧光素酶报
告基因技术检测 CREB 表达的变化。结果：PC-12 细胞在 4 μmol·L-1 鱼藤酮损伤后，细胞出现萎缩变圆，折光
率降低，caspase 3 活性显著升高，呈现凋亡的现象。不同浓度（0.1，1.0，10.0 μmol·L-1）瓜子金皂苷己能够剂量
依赖性的减轻对细胞形态的影响，降低 caspase 3 活性。荧光素酶报告基因标记显示，瓜子金皂苷己能够增加报
告基因 CREB 的表达。结论：瓜子金皂苷己能够抑制鱼藤酮诱导的 PC-12 细胞凋亡，其机制可能与增加 CREB
的表达有关。
【关键词】 瓜子金皂苷己；鱼藤酮；凋亡；caspase 3；cAMP 反应元件结合蛋白
【中图分类号】 R965 【文献标识码】 A 文章编号：2095-1396（2013）01-0012-005
The Effect of Polygalasaponin F on Rotenone-induced PC-12
Cells and the Expression of CREB
WU Miao-miao1, YUAN Yu-he2, CHEN Nai-hong2
1. Department of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou, 075000, China
2. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica,
Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Beijing, 100050, China
【ABSTRACT】 Objective：To investigate the effect of polygalasaponin F（PS-F） on the PC-
12 cells insulted by rotenone and the expression of CREB. Methods：The cell morphology was
observed by inverted microscope. Caspase 3 activity was determined by caspase 3 activity assay
kit. The expression of CREB was examined by luciferase reporter assay system. Results：When
exposed to 4 μmol·L-1 rotenone，a lot of PC-12 cells were apoptotic，and the activity of caspase
3 was increased significantly. When treated with PS-F，the damage of the cells was reduced
significantly and the caspase 3 activity was decreased significantly. PS-F could increase the
expression of CREB. Conclusion：PS-F protects PC-12 cells against apoptosis induced by
rotenone and the neuroprotective effect may be related to increasing the expression of CREB.
【KEY WORDS】 polygalasaponin F（PS-F）；rotenone；apoptosis；caspase 3；cAMP response
element binding protein （CREB）
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帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是发生在中、
老年期的一种常见神经退行性疾病［1］，其病理变化主
要为黑质致密区（substantia nigra，SN）多巴胺能神经元
进行性死亡或缺失［2］。目前该病的发病机制尚不明确，
但有研究表明，在 PD 中选择性多巴胺能神经元损伤与
细胞凋亡密切相关［3］。cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP
response element binding protein，CREB）作为一种重
要的真核细胞内核转录调节因子，具有多种生理功能，
包括调节基因的转录、细胞的发育与生存等。有研究报
道，CREB 在细胞调亡过程中也起重要作用［4-5］。
瓜子金皂苷己（polygalasaponin F，PS-F）是从远志
科植物瓜子金中提取的齐墩果烷型三萜皂苷。有研究发
现，PS-F 对 1- 甲基 -4- 苯基吡啶（1-methyl-4-phenylpyrid
inium ion，MPP+）、β淀粉样蛋白（ amyloid beta protein，
Aβ）等神经毒性剂损伤的细胞具有较好的神经保护作
用［6-9］，但具体的作用机制还不明确。本研究通过鱼藤酮
（rotenone）诱导 PC-12 细胞损伤建立 PD 细胞模型［10］，
探讨瓜子金皂苷己的神经保护作用及其机制，为其应用
于 PD 的临床治疗提供理论依据。
1  材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞及质粒
PC-12 细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所
细胞中心，由本实验室传代并保存。质粒：pCREB-luc，
购自 Strategene 公司；内参质粒 pRL-TK，购自 Promega
公司。
1.1.2 药品及试剂
鱼藤酮，购自 sigma 公司，DMEM，马血清，均购自
Gibco 公司；胎牛血清，购自 Hyclone 公司；caspase 3 活
性检测试剂盒，购自上海碧云天生物所；单荧光素酶报
告基因检测试剂盒，购自北京原平皓生物技术有限公
司；转染试剂 LipofectimeTM 2000，购自 Invitrogen公司；
其他试剂为国产或进口分析纯试剂。
1.1.3 仪器
Lmax REF 型化学发光酶标检测仪，Molecular
Devices；IX70-142 倒置显微镜，Olympu；SKANIT
SOFTWARE 3.2 酶标仪，Thermo。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
PC-12 细胞用含 5% 胎牛血清、5% 马血清的高糖
DMEM 培养基，于 37℃、5% CO2、饱和湿度的孵育箱
中培养，每隔 48 h 换培养液，当单层培养细胞汇合 80%
以后，传代培养。实验时将 PC-12 细胞传入培养板中，
待细胞进入对数生长期进行实验。
1.2.2 细胞形态的观察
PC-12 细胞按 5×104 个·mL-1 浓度接种于 96 孔
板中，每孔 100 μL（约 5 000 细胞），贴壁 24 h 后，倒置
显微镜下观察细胞的贴壁性、生长状态良好，按照空白
对照组、鱼藤酮（4 μmol·L-1）处理组、鱼藤酮 + 瓜子金
皂苷己（0.1，1.0，10.0 μmol·L-1）处理组更换培养基，继
续培养 48 h 后，倒置显微镜下观察细胞的形态特征，并
拍照记录。
1.2.3 Caspase 3 活性的检测
Casepase 3 可以催化底物 Ac-DEVD-pNA（acetyl-
Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide）产生黄色的 pNA （p-
nitroaniline），从而可以通过测定吸光度来检测 caspase 3
的活性。PC-12 细胞接种于 6 孔板中，贴壁 24 h 后，倒
置显微镜下观察细胞的贴壁性、生长状态，按照空白对
照组、鱼藤酮（4 μmol·L-1）处理组、鱼藤酮（4 μmol·L-1+
瓜子金皂苷己（0.1，1.0，10.0 μmol·L-1）处理组更换培
养基，继续培养48 h后，600 g、4℃离心5 min收集细胞。
冰浴裂解细胞 15 min，4℃ 16 000 g 离心 15 min，取上
清液检测蛋白浓度，测定相同蛋白浓度下 caspase 3 的
活性。按照 80 μL 检测缓冲液、10 μL 待测样品、10 μL
Ac-DEVD-pNA 反应体系，37℃孵育 2 h 后，发现颜色
变化比较明显，于 405 nm 处测吸光度值（A）。
1.2.4 荧光素酶报告基因检测 CREB 表达
转录因子与启动子结合后能够促进基因的表达，
根据这一原理在报告基因如荧光素酶（luciferase）前
加入与某一转录因子能够特异结合的启动子，利用该
报告基因的表达情况，可检测该转录因子的活性及调
节其活性信号通路的变化，同时也能够检测外界刺激
或某一基因表达产物对该信号通路的影响。PC-12
细胞接种于 24 孔板中，贴壁 24 h 后，用脂质体法将
pCREB-luc 报告基因质粒 400 ng、 pRL-TK 40 ng 在
LipofectimeTM 2000 介导下瞬时转染 PC-12 细胞，8 h 后
更换培养基，加入不同浓度（0.1，1.0，10.0 μmol·L-1）的
瓜子金皂苷己刺激细胞 24 h 后裂解细胞，取裂解的上
清液根据试剂盒说明书进行检测。
1.3 统计学方法
所有数据采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计，以单
因素方差分析（One-Way ANOVA）进行统计学显著性
分析，实验结果以均数±标准差（x-±s）表示，以 P<0.05
认为差异有显著性。
2  结果
2.1 瓜子金皂苷己对鱼藤酮损伤 PC-12 细胞的保护作用
如 Fig.1 所示，空白组细胞饱满、呈不规则状、折光
度较好，视野中死亡细胞较少。鱼藤酮模型组细胞皱缩
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变圆、折光率下降、视野中凋亡细胞显著增多。不同浓
度 PS-F 作用后能明显改善鱼藤酮损伤后 PC-12 细胞
的状态，增加细胞存活率。
2.2 瓜子金皂苷己对降低 caspase 3 的影响
与空白对照组比较，鱼藤酮处理后，caspase 3 的活
性显著升高（P<0.001），而同时加入不同浓度瓜子金皂
苷己后，caspase 3 的活性明显降低（P<0.01，P<0.001），
且具有一定的浓度依赖性（Fig.2）。
2.3 瓜子金皂苷己对 CREB 的影响
瓜子金皂苷己能浓度依赖性的增强 CREB 介导的
基因转录的活性（Fig.3），当浓度为 1.00，10.00 μmol·L-1
差异具有显著性（P<0.01，P<0.001）。
3  讨论
PD 是一种以多巴胺能神经元选择性丢失引发的
运动功能障碍性疾病。PC-12 细胞是大鼠肾上腺髓质
能分泌儿茶酚胺的嗜铬细胞瘤细胞，广泛用于神经元
特别是多巴胺能神经细胞损伤及保护的作用研究［11］。
鱼藤酮是线粒体呼吸链复合物Ⅰ抑制剂，能够通过引起
线粒体功能障碍，氧化应激、能量缺乏以及激活凋亡相
关基因等方式导致神经元死亡，是 PD 细胞模型的常用
的神经毒素［12］。本研究在体外采用鱼藤酮诱导 PC-12
细胞损伤为模型，研究 PS-F 的神经保护作用，具有一
定的说服力。倒置显微镜下观察细胞形态，鱼藤酮处理
后，PC-12 细胞皱缩变圆、折光率下降、视野中凋亡细胞
增多，细胞处于损伤状态。PS-F 能够浓度依赖性的改
善鱼藤酮诱导的 PC-12 细胞损伤。
Caspase 是近年来发现的一组存在于胞质中的半
胱氨酸蛋白水解酶，能够特异的水解天冬氨酸残基后
的肽键，导致细胞凋亡［13］。在细胞中，caspase 均以无
Fig. 1 The cell morphology was observed
by inverted microscope
A：Control；B：Rotenone （4 μmol·L-1）
C：Rotenone （4 μmol·L-1） + PS-F（0.1 μmol·L-1）
D：Rotenone （4 μmol·L-1） + PS-F（1.0 μmol·L-1）
E：Rotenone （4 μmol·L-1） + PS-F（10.0 μmol·L-1）
A B
C
E
D
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活性的酶原状态存在，caspase 蛋白家族一旦被激活后
便不可逆的启动细胞死亡程序［14］。其中，caspase 3 作
为细胞发生凋亡的重要执行蛋白之一，是 PD 患者与动
物模型脑中黑质多巴胺能神经元凋亡的易感因子和最
终效应器［15］。在正常细胞主要以其前体 procaspase 3
的形式存在，无酶活性，细胞凋亡后形成有活性的
caspase 3。本研究通过 caspase 3 活性检测发现，PC-12
细胞被鱼藤酮损伤后，细胞中 caspase 3 的活性显著
升高，而 PS-F 能够浓度依赖性的降低 PC-12 细胞中
caspase 3 的活性，说明 PS-F 对鱼藤酮诱导的 PC-12 细
胞凋亡有一定的保护作用。
CREB 作为一种重要的真核细胞内核转录调节因
子，是调节中枢神经系统功能的关键性因子之一，在神
经系统应激性损伤后提供神经保护信号。这种神经保
护信号是在 CREB 被激活后，通过直接或间接的激活
相关基因的转录，调控某些神经营养因子（神经生长因
子、脑源性神经营养因子等）及蛋白分子（c-fos、Bcl-2
等）的表达来抑制神经元的凋亡和促进细胞的修复和
存活。目前的研究显示，BDNF/TrkB/CREB 信号通路，
MAPK 途径、PKA 途径和 Ca2+/CaMK 途径等多种途径
能够调节 CREB 的活性，增加 Bcl-2 与 Bax 比值并抑
制 caspase 3 的活性进而抑制神经细胞的凋亡［16-20］。本
研究显示，PS-F 能显著增加 CREB 的表达，且能够抑制
鱼藤酮诱导的 caspase 3 活性增加。提示，PS-F 可能是
通过促进 CREB 的表达而发挥其神经保护作用的。
综上所述，PS-F 能够抑制鱼藤酮诱导的 PC-12 细
胞的凋亡，其作用机制可能与 PS-F 促进 CREB 的表达
相关。虽然 PS-F 激活 CREB 的具体机制尚需要进行
进一步说明，但本研究也为深入研究 PS-F 的神经保护
作用及其机制提供了理论依据和思路。
参  考  文  献
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Fig. 2 Effects of PS-F on the activity of caspase 3 in
PC-12 cells induced by 4 μmol·L-1 rotenone
n=6，x-±s，###P<0.005 vs control group，**P<0.01，***P<
0.001 vs rotenone group.
Fig. 3 PS-F increased the expression of CREB
examined by luciferase reporter assay system
n=6，x-±s，**P<0.01，***P<0.001 vs control group.
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