全 文 ：网络出版时间: 2013 － 3 － 7 14: 48 网络出版地址: http: / /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20130307． 1448． 009． html
瓜子金皂苷己对连二亚硫酸钠致氧糖剥夺 /复供
诱导 PC12 细胞凋亡的抑制作用
石瑞丽1，2，3，胡金凤2，孔令雷2，牛 非2，吴苗苗2，何 鑫2，3，李培锋1，陈乃宏2
( 1．内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018; 2．中国医学科学院药物研究所，北京 100050;
3．包头医学院生理教研室，内蒙古 包头 014040)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2013． 03． 009
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2013)03 － 0333 － 04
中国图书分类号:R282． 71;R284． 1;R329． 25
摘要:目的 观察瓜子金皂苷己(polygalasaponin F，PGSF)
对氧糖剥夺 /复供(oxygen-glucose deprivation and reperfusion，
OGD/R)所诱导的 PC12 细胞凋亡的作用及其机制。方法
以连二亚硫酸钠合并无糖 Earle’s 液造成氧糖剥夺，继而恢
复为完全培养基以建立体外 OGD/R 模型，以 Hoechst33342
/ PI双染及流式细胞术观察细胞受损和凋亡情况;以 JC-1
荧光染色法测定细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane
potential，MMP) ;以 Western blot 法检测凋亡相关蛋白的表
达。结果 PGSF可明显改善细胞形态并降低细胞受损和凋
亡百分率，抑制MMP水平的降低，增加 Bcl-2 /Bax表达比值。
结论 PGSF对 OGD/R 诱导的 PC12 细胞凋亡具有明显抑
制作用，机制与其调节 Bcl-2 和 Bax 的表达及稳定 MMP 有
关。
关键词:瓜子金皂苷己;连二亚硫酸钠;氧糖剥夺 /复供;
PC12 细胞;凋亡;线粒体膜电位;Bcl-2;Bax
收稿日期:2012 － 12 － 13，修回日期:2013 － 01 － 20
基金 项 目:国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (No U0832008，
No30973887) ;国 家 科 技 重 大 专 项 ( No
2012ZX09301002-004，2012ZX09103101 － 006)
作者简介:石瑞丽(1971 －) ，女，博士生，教授，硕士生导师，研究方
向:神经药理学和神经生理学，E-mail:ruilishi@ sina． com;
李培锋(1955 －) ，男，教授，博士生导师，研究方向:兽医
药理学与毒理学，通讯作者，E-mail:lpfneimeng @ 163．
com;
陈乃宏(1961 －) ，男，研究员，博士生导师，研究方向:神
经系统疾患创新药物开发及作用机制，通讯作者，Tel /
Fax:010-63165177，E-mail:chennh@ imm． ac． cn
瓜子金皂苷己(polygalasaponin F，PGSF)是从远
志属中草药瓜子金中分离得到的齐墩果烷型三萜皂
苷单体，体内试验表明其具有抗抑郁、镇静、抗焦虑
和催眠的作用。最新报道 PGSF对 MPP +(1-methyl-
4-phenylpyridinium)所致 PC12 细胞损伤具有保护
作用［1］，可通过促进大鼠海马齿状回突触传递发挥
促智功能［2］。提示 PGSF可能具备广泛的神经保护
作用。本研究旨在探讨 PGSF 对氧糖剥夺 /复供
(oxygen-glucose deprivation and reperfusion，OGD /R)
模拟缺血 /再灌注损伤所致的 PC12 细胞凋亡有无
保护作用，作用机制如何。
1 材料
1． 1 试验药物与试剂 PGSF由中国医学科学院药
物研究所合成室提供，二甲基亚砜(dimethyl sulfox-
ide，DMSO)溶解备用;Annexin V-FITC 细胞凋亡检
测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物
技术研究所) ;Bcl-2 和 Bax 一抗(美国 Santa Cruz) ;
ECL发光试剂(北京普利莱公司) ;DMEM 培养基、
胎牛血清、马血清(美国 Gibco 公司);Hochest33342、碘
化丙啶(propidium iodide，PI)、β-actin 抗体(美国
Sigma公司) ;PVDF 膜(美国 Millipore 公司) ;BCA
蛋白浓度测定试剂盒(北京 Vigorous 公司) ;连二亚
硫酸钠(sodium dithionite，Na2S2O4)及其他试剂为国
产分析纯。
1． 2 细胞株 PC12 细胞(pheochromocytoma cells)
由中国医学科学院基础研究所细胞中心提供。
1． 3 仪器 Thermo Scientific Multiskan FC 酶标仪
(美国赛默飞世尔公司) ;BD FACS Calibur流式细胞
仪(美国 BD公司) ;LAS-3000 化学发光及影像分析
仪(日本富士) ;RCM8000 型荧光显微镜(日本 Ni-
kon)。
2 方法
2． 1 模型制备及分组 PC12 细胞用含 5%胎牛血
清和 5%马血清的 DMEM 培养基常规传代培养，在
对数生长期以 5 × 104 个 /孔接种于 6 孔培养板培养
24 h，用于分组处理。造模细胞用含 10 mmol·L －1
Na2S2O4 的无糖 Earle’s液孵育 4 h作为氧糖剥夺处
理，然后换为完全培养基继续培养 24 h 作为复氧复
糖处理。实验分组:正常对照组、OGD /R 模型组、
OGD /R + PGSF(10. 00、1. 00、0. 10 μmol·L －1)组。
给药组在氧糖剥夺过程的 Earle’s 液和复氧复糖过
程的完全培养基中都加入相应药物。
·333·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Mar; 29( 3) : 333 ～ 6
2． 2 Hoechst 33342 / PI荧光染色观察细胞凋亡
造模及给药后，PC12 细胞用 4% 多聚甲醛溶液固
定，加入终浓度各为 10 μmol·L －1的 Hoechst 33342
和 PI，避光染色 20 min，PBS 漂洗两次，在荧光显微
镜下观察拍照并计数。
2． 3 流式细胞术检测细胞凋亡 经 OGD /R 处理
后，收集细胞培养液，用胰酶消化并吹下贴壁细胞，
合并细胞悬液，2 000 r·min －1离心 5 min，弃上清，
按试剂盒说明书进行 Annexin V 和 PI 染色，随即上
机进行流式细胞仪检测，每个样品计数10 000个细
胞。Annexin V-FITC染色阳性为绿色荧光，PI 染色
阳性为红色荧光。
2． 4 JC-1 荧光染色测定线粒体膜电位 (mito-
chondrial membrane potential，MMP)造模结束后，用
PBS 漂洗细胞 1 次，然后加入 PBS溶解的 10 μmol·
L －1 JC-1，37℃、5% CO2 培养箱负载 20 min，PBS漂
洗后于荧光显微镜下拍照。
2． 5 Western blot 检测凋亡蛋白的表达 造模及
药物处理结束后，弃上清，收集细胞，4 ℃，2 500 r·
min －1离心 5 min，取沉淀，经 PBS 漂洗后，加入细胞
裂解缓冲液 100 μl，冰浴 30 min，收集细胞裂解液，
12 000 r·min －1离心 30 min，取上清用 BSA 法进行
蛋白定量。每组取蛋白样品 10 μg 上样，经 10%聚
丙烯酰胺凝胶电泳后转移至 PVDF 膜上，3% BSA
室温封闭 2 h，加一抗于 4℃孵育过夜，TBST 洗膜
后，加相应二抗室温孵育 2 h，ECL显色，化学发光仪
成像。实验重复 3 次。
2． 6 数据分析 实验数据以 珋x ± s 表示，以 SPSS
12. 0 统计软件分析。组间比较用单因素方差分析
(one-way ANOVA)。用 Gel-Pro 3. 2 软件对 Western
blot实验条带进行灰度扫描和分析。
3 结果
3． 1 Hoechst 33342 / PI染色结果 正常对照组细
胞核被 Hoechst 33342 着染后呈均匀蓝色荧光;凋亡
细胞核因染色质凝聚呈现不均匀强蓝色荧光，或因
核碎裂出现凋亡小体;晚期凋亡或坏死细胞因为细
胞膜被破坏，细胞核被 PI 着染而呈强红色荧光。
OGD /R组红色荧光细胞较正常组明显增多，说明大
量细胞死亡;PGSF各剂量组红色荧光细胞都明显少
于模型组，染色质凝聚及细胞核碎裂现象减少，表明
PGSF可明显减少 OGD /R 处理细胞的晚期凋亡或
坏死数量。见 Fig 1 及 Tab 1。
3． 2 细胞凋亡检测结果 流式细胞术检测结果显
示，PGSF 主要影响细胞晚期凋亡 / 坏死百分率。
OGD / R处理使细胞晚期凋亡 /坏死率由正常对
Fig 1 PGSF inhibits OGD / R-induced injury in PC12 cells
Fluorescence micrograph of PC12 stained with Hoechst 33342 and
PI． (A)Control; (B)OGD /R; (C)OGD /R + 10. 00 μmol·L －1
PGSF; (D)OGD /R + 1. 00 μmol·L －1 PGSF; (E)OGD /R + 0. 10
μmol·L －1 PGSF． Bar = 40 μm
Tab 1 Effect of PGSF on PI positive cells induced by OGD/R
Group Dose /μmol·L －1 PI positive cell /%
Control 0． 7 ± 0． 3
OGD /R 57． 3 ± 2． 5##
OGD /R + PGSF 10． 00 26． 4 ± 3． 9＊＊
OGD /R + PGSF 1． 00 44． 4 ± 0． 7＊＊
OGD /R + PGSF 0． 10 47． 5 ± 4． 6*
##P ＜ 0. 01 vs control;* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 vs OGD /R
照组的 4. 04% 增至 28. 24%，PGSF 10. 00、1. 00、
0. 10 μmol·L －1可分别使细胞晚期凋亡 /坏死率降
低至 10. 07%、10. 42%、16. 74%。再次验证了 PGSF
对 OGD /R处理 PC12 细胞具有保护作用，且其作用
具有浓度依赖性。
3． 3 线粒体膜电位检测结果 结果显示:正常组细
胞被激发后多数呈红色荧光，线粒体膜电位正常，呈
绿色荧光细胞仅占(4. 6 ± 0. 1)%;OGD /R处理可使
(82. 8 ± 3. 1)% 的细胞呈绿色荧光，说明多数细胞
线粒体膜电位降低，与正常组差异具有显著性(P ＜
0. 01)。PGSF 10. 00、1. 00、0. 10 μmol·L －1组呈绿
色荧光细胞分别占(17. 7 ± 1. 4)%、(24. 4 ± 3. 4)%
和(59. 3 ± 5. 6)%，与 OGD /R组比较明显减少(P ＜
0. 01，P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05) ，说明 PGSF可浓度依赖性
地抑制 OGD /R 引起的线粒体膜电位的降低。见
Fig 2。
3． 4 细胞凋亡相关蛋白的表达结果 由 Fig 3 可
见，与正常对照组相比，OGD /R可使 PC12 细胞凋亡
相关蛋白 Bcl-2 /Bax 比值明显降低;PGSF 10. 00、
1. 00、0. 10 μmol·L －1分别使 Bcl-2 /Bax比值回升至
模型组的 2. 6 倍、2. 4 倍和 2. 3 倍。
4 讨论
脑缺血后尽快恢复血流是防治缺血损伤的最有
·433· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Mar; 29( 3)
Fig 2 Effect of PGSF on OGD/R-induced changes
of MMP in PC12 cells
A:Control;B:OGD /R;C:OGD /R + 10. 00 μmol·L －1 PGSF;
D:OGD /R + 1. 00 μmol·L －1 PGSF;E:OGD /R + 0. 10 μmol·L －1
PGSF． Bar = 80 μm
Fig 3 PGSF up-regulates ratio of Bcl-2 /Bax proteins
in PC12 cells injured by OGD/R
##P ＜ 0. 01 vs control，* P ＜ 0. 05 vs OGD /R．
效措施，然而再灌注损伤会使脑功能出现更加严重
的障碍。在缺血性脑损伤中神经细胞表现出坏死和
凋亡两种死亡形式，抑制神经细胞凋亡的发生是治
疗缺血性脑血管病的重要着眼点。
PC12 细胞是大鼠嗜铬细胞瘤细胞，具有很多神
经细胞的特性，常代替神经细胞用于研究。Na2S2O4
为氧清除剂，起效迅速且不损伤细胞膜。Na2S2O4
合并低糖常被用来构建简单安全的的低氧低糖模型
以用于实验研究［3］。本课题以此模型为基础模拟
脑缺血 /再灌注损伤，从多个角度证明了 PGSF 对
OGD /R处理的 PC12 细胞具有明显的保护作用。目
前尚未见到其它关于 PGSF 对缺血 /再灌损伤的作
用方面的研究报道。
线粒体是细胞的产能供能中心，正常的 MMP
是维持线粒体功能所必需的。MMP 下降是细胞凋
亡过程中的早期事件，是凋亡的特异性改变。OGD
/ R等因素可使线粒体内外膜交界处存在的线粒体
通透性转换孔以高通透构象持续性开放，膜间隙正
离子不断进入基质，致使内膜两侧电势差减少，
MMP下降或消失，线粒体肿胀，功能受损，细胞色素
C等凋亡相关分子释放到胞质，最终激活 Caspase家
族成员介导的细胞凋亡［4］。JC-1 能渗透到细胞器
内并与线粒体特异性结合，目前作为检测 MMP 最
好的荧光染料而被广泛应用［5 － 6］。在 MMP较低时，
JC-1 以单体存在于胞质，MMP 较高时，JC-1 形成聚
合物聚集在线粒体基质中，被激发后分别产生绿色
和红色荧光。在荧光显微镜下观察细胞颜色即可判
断 MMP的变化。
Bcl-2 家族成员在细胞凋亡的调控过程中发挥
重要作用，并与 MMP 的改变存在密切关系。文献
报道［7］，抗凋亡蛋白 Bcl-2 可能通过保持线粒体内、
外膜的完整性以及增加线粒体基质内质子的外流而
抑制 MMP 的下降，还可通过与 caspase-9 等形成复
合物而抑制 caspase-3 的激活。相反，促凋亡蛋白
Bax等可转位至线粒体而促进线粒体通透性转换孔
开放，诱导凋亡［8］。最终，Bcl-2 和 Bax 通过影响细
胞色素 C 的释放而抑制或促进细胞凋亡［9］。Bcl-2
还可与 Bax 形成异源二聚体，抑制 Bax 的促凋亡效
应［10］，Bcl-2 和 Bax 二者的比例对决定细胞的命运
发挥重要作用。
本研究结果提示 PGSF发挥神经细胞保护作用
的机制与其抑制线粒体介导的细胞凋亡途径相关，
通过调节凋亡蛋白 Bcl-2 和 Bax 的表达，维持了
MMP和细胞能量代谢的稳定，最终阻断了线粒体凋
亡信号的启动，降低了细胞凋亡率。有关信号转导
通路的研究正在进行中。
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Inhibitory effect of Polygalasaponin F on the apoptosis of PC12 cells induced
by sodium dithionite-caused oxygen-glucose deprivation and reperfusion
SHI Rui-li1，2，3，HU Jin-feng2，KONG Ling-lei2，NIU Fei2，WU Miao-miao2，
HE Xin2，3，LI Pei-feng1，CHEN Nai-hong2
(1． College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot Inner Mongolia 010018，China;
2． Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China;
3． Dept of Physiology，Baotou Medical College，Baotou Inner Mongolia 014040，China)
Abstract:Aim To study the effect of Polygalasapo-
nin F (PGSF)on apoptosis of PC12 cells induced by
oxygen-glucose deprivation and reperfusion (OGD /R)
and its mechanism．Methods The OGD /R model was
established by first exposing PC12 cells to sodium di-
thionite (Na2S2O4) in glucose-free Earle’s solution
and then by changing the culture into complete medi-
ums，with the cell injury and apoptosis analyzed by
Hoechst 33342 / PI dual staining and flow cytometry
assay． The mitochondrial membrane potential (MMP)
was determined by JC-1 staining，and the expression of
Bcl-2 and Bax was detected by Western blot． Results
PGSF could significantly improve the morphology of
injured PC12 cells and reduce the percentage of apop-
totic cells，reverse the decrease in MMP and up-regu-
late the ratio of Bcl-2 /Bax proteins． Conclusion
PGSF can markedly inhibit the OGD /R-induced apop-
tosis of PC12 cells by regulating the expression of Bcl-2
and Bax proteins and maintaining the normal MMP．
Key words:Polygalasaponin F;Na2S2O4;OGD /R;
PC12 cells;apoptosis;MMP;Bcl-2;Bax
·633· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Mar; 29( 3)