全 文 ：上海中医药大学学报 第 26 卷 第 1 期 2012年 1月
方药研究
酸性染料比色法测定飞龙掌血
提取物中总生物碱的含量
范圣洁 李文龙 崔文霞 钟伟才 杨延龙 朱国福
上海中医药大学中药学院 (上海 201203)
【摘 要】 目的:建立飞龙掌血提取物中总生物碱含量测定的方法。方法:通过酸性染料比色法，利用紫
外分光光度计进行飞龙掌血总生物碱的含量测定，并进行方法学考察，建立适宜的含量测定方法。结果:建
立了飞龙掌血总生物碱含量测定方法;于 330 nm的检测波长下，以氯化两面针碱(Nitidine Chloride)为对照
品，在 1． 497 6 ～ 5． 990 4 μg /ml范围内对照品含量与吸光度呈良好的线性关系;回归方程为 A =0． 115 9c +
0． 137 6(r = 0． 999 7) ;日内精密度 RSD = 0． 53%、日间精密度 RSD = 2． 57%;加样回收率为 100． 08%，
RSD = 3． 30%。结论:该方法回收率、稳定性、重现性、精密度良好，可用于飞龙掌血总生物碱的含量测定。
【关键词】 飞龙掌血;总生物碱;酸性染料比色法;含量测定
【中图分类号】 R284． 1 【文献标志码】A 【文章编号】1008-861X(2012)01-0085-05
［基金项目］ 上海中医药大学名师传承工程项目(Z0907104);
国家中医药管理局名老中医药专家传承工作室建设项目
［作者简介］ 范圣洁，女，在读博士生，主要从事抗肿瘤中药
学研究。
［通讯简介］ 朱国福，教授，博士生导师。
E-mail:zhuguofush@ yahoo． com． cn
飞龙掌血(Radix Toddaliae Asiaticae)为芸香科
植物飞龙掌血 Toddalia asiatica Lam． 的干燥根［1］。
在我国［2］、印度等亚洲地区及非洲、大洋洲［3］均有
分布。为苗医常用药，味辛，微苦，性温，有小毒。有
祛风止痛、化瘀止血、解毒消肿之功［4］。现代研究
发现其具有镇痛、抗炎、抑菌、抗病毒、保护心血管系
统等作用。该药材主要含有生物碱类等成分［5］。
目前尚无飞龙掌血总生物碱含量测定方法的报道，
本文通过对酸性染料比色法［6］的考察首次建立了
飞龙掌血总生物碱含量测定的方法。
1 材料
1． 1 药物与试剂 飞龙掌血饮片购于河北省安国
市冷背药材有限公司，并经上海中医药大学生药教
研室赵志礼教授鉴定为飞龙掌血 Toddalia asiatica
Lam．的根。氯化两面针碱对照标准品，购自中国药
品生物制品检定所，编号:110848-200502，供含量测定
用。溴百里香草酚蓝(染色剂)、溴酚蓝(染色剂)、溴
甲酚绿(染色剂)、柠檬酸(分析纯)、十二水合磷酸氢
二钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、乙醇(分析纯、工业
级)等试剂，均购自国药集团化学试剂有限公司。
1． 2 仪器 UV Agilent 8453 紫外-可见分光光度
计，Agilent 公司;恒温水浴锅，北京国华医疗器械
厂;R 系列旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司;
XS105DU 电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司;
BS124S赛多利斯电子天平，北京赛多利斯仪器系统
有限公司。
2 方法与结果
2． 1 飞龙掌血总生物碱含量测定方法的建立
2． 1． 1 对照品溶液的制备 精密称取氯化两面针
碱标准品 7． 488 mg，用 100 ml 甲醇定容，制成
0． 074 88 mg /ml(即 74． 88 μg /ml)的氯化两面针碱
对照品溶液。
2． 1． 2 供试品溶液的制备 称取粉碎后的飞龙掌
血饮片(约 20 目)20 g，用 10 倍量 75%乙醇，80℃水
浴回流 2 次，每次 2 h，回收乙醇，减压干燥得飞龙掌
血醇提物干粉;依实验需要精密称取飞龙掌血醇提
物干粉，加入 10 ～ 100 ml甲醇定容，略微超声振荡，
使之充分溶解，用 0． 24 μm 滤膜过滤残渣，再加入
甲醇补齐至刻度，制成所需浓度的供试品溶液，于
4 ℃冰箱储存，备用。
2． 1． 3 酸性染料的配制 选用溴百里香草酚蓝、溴
酚蓝、溴甲酚绿为筛选对象。
溴百里香草酚蓝:称取 0． 1 g 溴百里香草酚蓝
粉末于研钵中，加入 3． 2 ml的 0． 05 mol /L NaOH，研
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DOI:10.16306/j.1008-861x.2012.01.028
ACTA UNIVERSITATIS TRADITIONIS MEDICALIS SINENSIS PHARMACOLOGIAEQUE SHANGHAI Vol． 26 No． 1 Jan．，2012
磨至粉末充分溶解后，加入 200 ml 的蒸馏水稀释，
移入具塞的广口瓶中备用;溴酚蓝:称取 0． 1 g 溴酚
蓝粉末，于研钵中，加入 3． 0 ml 的 0． 05 mol /L
NaOH，研磨至粉末充分溶解后，加入 200 ml 的蒸馏
水稀释，移入具塞的广口瓶中备用;溴甲酚绿:称取
0． 1 g 溴甲酚绿粉末，于研钵中，加入 2． 8 ml 的
0． 05 mol /L NaOH，研磨至粉末充分溶解后，加入
200 ml的蒸馏水稀释，移入具塞的广口瓶中备用。
2． 1． 4 缓冲溶液的配制 称取十二水合磷酸氢二
钠(Na2HPO4·12H2O)和柠檬酸(2-hydroxy-1，2，3-
propanetricarboxylic acid)固体，分别用蒸馏水充分溶
解。将十二水合磷酸氢二钠作为碱溶液缓缓加入柠
檬酸溶液中以调配不同 pH 值的缓冲液。本文以
pH 3． 5、4． 0、4． 5、5． 0 和 5． 5 为筛选对象，研究不同
pH值的缓冲液对含量测定的影响。
2． 2 测试波长的选择 精密吸取对照品溶液和供
试品溶液各 400 μl，分别放入已盛有 5． 0 ml pH =
4． 0缓冲液的分液漏斗，再分别加入溴百里香草酚
蓝、溴酚蓝、溴甲酚绿 3 种酸性染料溶液各 3． 0 ml，
经 10 ml氯仿分 2 次萃取，氯仿定容至 10 ml，氯仿
萃取液作为 3 种酸性染料的测试溶液，于 200 ～
800 nm范围内进行全波长扫描，发现在 330 nm 处不
同染料与标准品溶液和供试品溶液中的生物碱形成
的络合物均具有稳定吸收，因此选择测试波长为
330 nm。见图 1、图 2。
2． 3 酸性染料比色法的建立
2． 3． 1 染色剂与缓冲溶液 pH 的考察 在分液漏
斗中分别加入不同 pH 值的缓冲液 5． 0 ml，然后分
别加入溴百里香草酚蓝、溴酚蓝、溴甲酚绿 3 种酸性
染料溶液各 3． 0 ml，以及对照品溶液 300 μl，10 ml
氯仿振荡摇匀后分 2 次萃取后，用氯仿定容至
10 ml。氯仿萃取液作为 3 种酸性染料的测试溶液，
于 330 nm处进行固定波长检测，随行氯仿作空白，
对照品溶液在不同染料、不同 pH 值缓冲液中的吸
光度值见表 1。
注:A为溴百里香草酚蓝-生物碱络合物;B为溴甲酚绿-生物碱络合物;C为溴酚蓝-生物碱络合物
图 1 不同染料与氯化两面针碱形成的络合物溶液全波长紫外扫描图
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图 2 飞龙掌血提取物中总生物碱与溴百里香草酚蓝染色剂形成的络合物在 330 nm处有吸收
表 1 酸性染料与缓冲溶液 pH的考察
pH
吸光度(A)
溴百里香草酚蓝 溴酚蓝 溴甲酚绿
3． 5 0． 364 5 0． 341 7 0． 382 5
4． 0 0． 345 1 0． 350 2 0． 390 0
4． 5 0． 387 9 0． 340 9 0． 373 6
5． 0 0． 397 7 0． 366 3 0． 378 7
5． 5 0． 572 2 0． 332 5 0． 391 4
结果显示，对照品溶液和溴百里香草酚蓝染料
形成的络合物在缓冲液 pH = 5． 5 的条件下具有最
高的吸光度值(0． 57) ，因此选择以溴百里香草酚蓝
为酸性染料，以 pH = 5． 5 作为缓冲体系的 pH 值进
行 UV测定条件。
2． 3． 2 染色剂用量的考察 在分液漏斗中分别加
入 pH = 5． 5 的缓冲液 5． 0 ml、不同体积(2． 0 ml、
3． 0 ml、4． 0 ml、5． 0 ml)的溴百里香草酚蓝染料溶
液，以及对照品溶液 300 μl，10 ml 氯仿振荡摇匀后
分 2 次萃取后，用氯仿定容至 10 ml。氯仿萃取液作
为测试溶液，于 330 nm处进行固定波长检测。结果
显示，在其他条件不变的情况下，染色剂体积为 4 ml
时，对照品与染色剂形成的络合物吸光度值最大，因
此确定溴百里香草酚蓝染色剂用量为 4 ml。
2． 3． 3 缓冲液用量的考察 在分液漏斗中分别加
入不同体积(3． 0 ml、4． 0 ml、5． 0 ml)的 pH = 5． 5 的
缓冲液、溴百里香草酚蓝染料溶液 4． 0 ml，以及对照
品溶液 300 μl，10 ml 氯仿振荡摇匀后分 2 次萃取
后，用氯仿定容至 10 ml。氯仿萃取液作为测试溶
液，于 330 nm处进行固定波长检测。结果显示，缓
冲液用量为 4 ml 时，测定样品的吸光度最大，因此
选择缓冲液用量为 4 ml。
2． 4 酸性染料比色法的方法学考察
2． 4． 1 线性关系的考察 精密移取浓度为 74． 88
μg /ml的氯化两面针碱对照品溶液 200 μl、300 μl、
400 μl、600 μl、800 μl，于分液漏斗中，与溴百里香
草酚蓝 4． 0 ml和 pH =5． 5 的缓冲液 4． 0 ml充分混
合后，10 ml氯仿振荡摇匀后分 2 次萃取。用氯仿定
容至 10 ml，氯仿萃取液作为测试溶液，于 330 nm处
进行固定波长扫描，随行氯仿作空白，平行 2 份，以
吸光度为纵坐标，以氯化两面针碱的浓度(μg /ml)
为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y = 0． 115 9X
+0． 137 6，r = 0． 999 7，氯化两面针碱对照品溶液在
1． 497 6 ～ 5． 990 4 μg /ml范围内线性关系良好。
2． 4． 2 稳定性考察 取对照品溶液 300 μl，按
2． 4． 1项下方法制成标准品供试液(浓度为 74． 88
μg /ml) ，于 330 nm处进行固定波长检测，随行氯仿
作空白，每 5 ～ 20 min 测定 1 次，连续测定 10 次。
结果表明，待测液在 100 min 内稳定，其 RSD =
2． 59% (n = 10)。
2． 4． 3 精密度考察
2． 4． 3． 1 日内精密度 取对照品溶液 400 μl，按
2． 4． 1项下方法制成标准品供试液，于 330 nm 处进
行固定波长扫描，随行氯仿作空白，重复测定 6 次。
RSD =0． 53% (n =6) ，证明该方法日内精密度很好。
2． 4． 3． 2 日间精密度 取对照品溶液，选取“线性
关系考察”项下高、中、低 3 个浓度，按 2． 4． 1 项下方
法制成 3 个浓度的标准品供试液。于 330 nm 处进
行固定波长扫描，随行氯仿作空白，每个浓度每天重
复测定 3 次，连续测定 3 d(每天重新制备样本)。
总 RSD =2． 57% (n = 27) ，证明该方法的日间精密
度良好。
2． 4． 4 加样回收率 精密吸取飞龙掌血样品溶液
500 μl(浓度为 0． 714 mg /ml)9 份，置于分液漏斗中，
分别加入标准品溶液 420 μl、280 μl、140 μl，然后按
2． 4． 1项下方法制成待测液。于 330 nm处进行固定
波长扫描，随行氯仿作空白，每组平行 3 份，平行测定
3次，得吸光度值。计算得到加样回收率，其平均值
为 100． 08%，平均 RSD =3． 30%(n = 9) ，表示该方法
对氯化两面针碱的加样回收率较好。见表 2。
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ACTA UNIVERSITATIS TRADITIONIS MEDICALIS SINENSIS PHARMACOLOGIAEQUE SHANGHAI Vol． 26 No． 1 Jan．，2012
表 2 加样回收率的考察
实验号 原药材(μg) 对照品(μg) 测得量(μg) 回收率(%) 平均值(%) RSD(%)
1 21． 35 32． 82 53． 13 96． 83
2 21． 35 32． 82 55． 11 102． 86 99． 54 3． 08
3 21． 35 32． 82 53． 82 98． 93
4 21． 35 21． 35 43． 11 101． 92
5 21． 35 21． 35 43． 69 104． 64 101． 58 3． 20
6 21． 35 21． 35 42． 31 98． 17
7 21． 35 10． 75 31． 59 95． 26
8 21． 35 10． 75 32． 35 102． 33 99． 11 3． 61
9 21． 35 10． 75 32． 07 99． 72
上表中“原药材”即为原药材中氯化两面针碱
的含量。
回收率的计算方法:回收率% =(C － A)/B ×
100%，式中 A为供试品所含被测成分量;B 为加入
对照品量;C为实测值。
2． 4． 5 重复性实验 精密称取飞龙掌血粗提物，按
“供试品溶液”项下配制溶液，每份样品溶于 10 ml
甲醇中，平行 5 份，取该供试品溶液 500 μl 于分液
漏斗中，按 2． 4． 1 项下方法制成样品供试液，于
330 nm处进行固定波长扫描，随行氯仿作空白。
RSD =3． 76%(n = 5) ，证明该方法重复性较好。见
表 3。
表 3 重复性实验
实验号 样品浓度(mg /ml) 生物碱含量(%) RSD(%)
1 0． 136 61． 90
2 0． 134 58． 77
3 0． 161 60． 00 3． 76
4 0． 181 61． 46
5 0． 179 57． 55
3 讨论
由于目前对飞龙掌血提取物总生物碱含量测定
方法的报道极少，所以结合相关文献中总生物碱含
量测定方法［7］，本课题采用酸性染料比色法［6］来进
行飞龙掌血总生物碱的含量测定。其原理是:生物
碱类与氢离子生成阳离子，一些酸性染料在此条件
下可解离成阴离子而与上述阳离子定量结合成有色
络合物，可被有机溶剂定量提取，并在一定的波长处
测定该溶液有色离子对的吸收度，即可计算出总生
物碱的含量［8］。目前含量测定较为常用的方
法———高效液相色谱法，多用来测定提取物中某一
已知的单一化合物的含量，却无法对总有效部位进
行含量测定，而酸性染料比色法刚好弥补了这一不
足，对于中药提取物来讲，有效部位的含量测定是必
不可少的。
本实验选择以氯化两面针碱作为对照品，在
pH =5． 5的条件下，用溴百里香草酚蓝进行染色，而
后用氯仿进行 2 次萃取，于 330 nm处测定紫外吸光
度，从而得到飞龙掌血总生物碱的含量。该方法灵
敏度高，在 100 min内较稳定，精密度、加样回收率、
重复性均较好，可以用于飞龙掌血总生物碱的含量
测定。
运用此方法需按步骤严格操作，尽可能减少人
为误差，得到较真实的数据。由于实验操作过程中
会用到氯仿，因此需要做好相关防护，最好在通风橱
中操作。萃取过程中要不断的振荡分液漏斗，以保
证水层与氯仿层充分接触，如果萃取不完全，会造成
结果偏低。振荡后要给予足够的时间使之分层，待
两相彻底分开后再接取氯仿层，以防止水中染料进
入萃取液中，造成结果偏高，之后用氯仿补齐 10 ml
体积，使测量结果更接近于真实值。另外，生物碱与
酸性染料形成的络合物见光容易分解，为保持其稳
定，在操作过程中要注意避光，在测量过程中也应注
意，否则容易造成数据的偏差。染色剂须在 2 周内
使用，超过 2 周就应重新配置。水相的 pH 也须严
格控制，不同 pH对结果影响很大。
参考文献:
［1］国家中医药管理局中华本草编委会． 中华本草·傣药卷［M］．
上海:上海科学技术出版社，2005:108．
［2］江苏新医学院． 中药大辞典［M］． 上海:上海科学技术出版社，
1986:279．
［3］司书毅，生田安喜良． 芸香科植物飞龙掌血愈伤组织细胞培养
物生物碱成分的研究［J］． 中草药，2000，31(8) :573-574．
［4］黄璐琦． 中草药与民族药药材图谱［M］． 北京:北京大学医学出
版社，2005:16．
［5］莫单丹，袁经权，周小雷，等． 瑶药飞龙掌血的研究进展［J］．
中国民族民间医药，2010，19(21) :5-6．
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上海中医药大学学报 第 26 卷 第 1 期 2012年 1月
［6］龙盛京，陈瑶，彭兴． 酸性染料比色法测定两面针药材总生物
碱的含量［J］．食品科学，2007，28(11) :443-445．
［7］刘喜纲，刘翠哲，常金花． 应用酸性染料比色法测定总生物碱
的含量［J］． 中国药房，2007，18(11) :875-876
［8］石雪萍，张宇思． 酸性染料比色法测定花椒总生物碱的含量
［J］． 中国野生植物资源，2008，27(6) :62-64．
编辑:季春来
收稿日期:2011-07-25
Determination of Total Alkaloids in Radix Toddaliae
Asiaticae by Acid Dye Colorimetry
FAN Sheng-jie LI Wen-long CUI Wen-xia ZHONG Wei-cai YANG Yan-long ZHU Guo-fu
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
ABSTRACT Objective:To establish a method for quantitative determination of the total alkaloids in Radix Toddaliae Asiaticae．
Methods:Acid dye colorimetry and ultraviolet spectrophotometer were used to detect the content of total alkaloid in Radix Toddali-
ae Asiaticae with methodology research． The proper method for the determination was established． Results:The method for total al-
kaloid content determination was established;the result showed a good linear relationship between the absorbance and quantity of
Nitidine Chloride to the total alkaloids by acid dye colorimetry at 330 nm wavelength． Within the range of (1． 497 6 ～ 5． 990 4)
μg /ml，the regression equation was A = 0． 115 9c + 0． 137 6(r = 0． 999 7) ;the RSD of within-day precision was 0． 53%，day to
day precision was 2． 57%;average recovery was 100． 08%，RSD was 3． 30% ． Conclusion:This method is accurate，reliable and
simple，which can be used for content determination of total alkaloids in Radix Toddaliae Asiaticae．
KEY WORDS Radix Toddaliae Asiaticae;total alkaloid;acid dye colorimetry;
櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊
content determination
·简讯·
上海中医药大学 4 项科研项目获 2011 年度
教育部高等学校科学研究优秀成果奖
2011 年 11 月 30 日，教育部科技发展中心发布 2011 年度高等学校科学研究优秀成果奖(科学技术)授
奖公告，上海中医药大学有 4 个项目获奖，包括自然科学一等奖 1 项、自然科学二等奖 1 项、科技进步二等奖
2 项。
获得自然科学一等奖的项目是王峥涛教授领衔研究的项目“含有肝毒吡咯里西啶生物碱中药的毒性与
安全性评价研究”。该项目以广泛分布于近百种中草药中毒性最强的植物性肝毒物质———吡咯里西啶生物
碱(HPAs)为研究对象，在我国率先开展含 HPAs 中草药资源、化学、毒理、代谢、安全标准系统研究，建立了
含 HPAs中草药安全性评价方法学体系，在代表性 HPAs 毒性成分、致毒机制、代谢途径、中草药中 HPAs 检
测分析方法、安全标准建立、解毒药物发现等方面取得了突破性进展。
获得自然科学二等奖的项目是刘平教授领衔研究的项目“基于方-效-证相关的肝硬化病证病机的病理
生物学基础研究”;获得科技进步二等奖的项目分别是何立群教授领衔研究的项目“抗纤灵及衍生复方延缓
慢性肾衰进展临床疗效评价和多靶点作用途径”和李斌教授领衔研究的项目“祛瘀生肌中药促进创面愈合
的临床与基础研究”。
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