全 文 ：熊 宏，陈海涛，宋 健，等． 麻风树油质蛋白 JcOle16． 6 基因克隆及序列分析［J］． 江苏农业科学，2016，44(6):84 － 89．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 06． 021
麻风树油质蛋白 JcOle16． 6 基因克隆及序列分析
熊 宏，陈海涛，宋 健，余进德，丁 勇
(西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224)
摘要:分离克隆麻风树油质蛋白基因家族成员 JcOle16． 6 基因的 DNA 序列(GenBank 序列号为 JX073622． 1)。
JcOle16． 6 基因全长 601 bp，没有内含子，转录的 JcOle16． 6 mＲNA具有 468 bp 的完整开放阅读框，编码含 155 个氨基
酸残基、分子量为 16． 6 ku、等电点为 9． 99 的 JcOle16． 6 蛋白(GenBank序列号为 AFP19884)，属于植物油体结合蛋白
油质蛋白家族的新成员。JcOle16． 6 属于稳定的两性蛋白质，具有 3 个结构域，即 N端约 30 个氨基酸残基组成的含 1
个 α －螺旋的亲水性结构域，肽链中间约 78 个氨基酸残基组成的含 3 个 α －螺旋的高度疏水性跨膜结构域，C端约 47
个氨基酸组成的含 1 个 α －螺旋的两亲性结构域。N 端亲水性结构域和 C 端两亲性结构域分布于油体朝向胞浆一
面，中间疏水跨膜结构域分布于油体半单位膜内，存在于中间疏水跨膜结构域中的由 3 个脯氨酸和 1 个丝氨酸组成的
Pro － Knot高度保守结构域在 JcOle16． 6 蛋白与油体半单位膜准确定位和稳定维持油体结构方面起着重要作用。研究
结果为 JcOle16． 6 基因表达调控和生理功能等研究奠定了基础。
关键词:麻风树;种子;油体;油质蛋白;基因克隆;序列分析
中图分类号:Q785 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)06 － 0084 － 06
收稿日期:2015 － 10 － 28
基金项目:国家自然科学基金(编号:31460076);云南省高校优势特
色重点学科建设项目(编号:50097505);云南省高校林下生物资源
保护及利用科技创新团队项目。
作者简介:熊 宏(1994—)，男，江西宜春人，硕士研究生，研究方向
为代谢途径与分子生物学。E － mail:1570530221@ qq． com。
通信作者:丁 勇，高级实验师，硕士生导师，研究方向为分子生物
学。E － mail:dingyong@ swfu． edu． cn。
可作为现代生物质能源的植物油广泛存在于植物种子
中［1 － 2］，植物油是植物种子最有效的能量储备形式，其主要以
三酰甘油(triglycerides，TAGs)液态基质形式存在于植物亚细
胞器颗粒 －油体中，可为随后的代谢过程和其他生命活动提
供能量和碳水化合物［3 － 4］。研究认为，TAGs 位于油体内部，
油体外部为由磷脂单分子层(phospholipids，PL)和油体结合
蛋白组成的半单位膜结构［5］。油体结合蛋白包括大量的油
质蛋白和微量的油体钙蛋白、油体固醇蛋白 Steroleosin － A 和
Steroleosin － B［6 － 9］。研究推测油质蛋白作为最丰富的油体结
合蛋白在油体的发生到分解消失过程中起着重要的生物学功
能［1，10 － 11］。目前在油桐(Verniciafordii)［12］、油菜(Brassica
campestris)［13 － 16］、芝麻(Sesamumindicum)［17 － 18］和拟南芥(Ara-
bidopsis thaliana)［19］等物种中油质蛋白基因已被克隆，其生物
学功能也得到了一定研究，同时发现在各物种中油质蛋白以
多个异构体蛋白形式存在。
麻风树(Jatropha curcas L．)别称小桐子或膏桐，是大戟
科(Euphorbiaceae)多年生落叶灌木或小乔木，其果实采摘期
长达 50 年，种仁的含油率高达 60% ～70%［20 － 21］，麻风树已经
作为生物质能源植物得到了一定的开发与利用［22 － 24］。研究
麻风树油质蛋白及其基因将有助于揭示麻风树种子油体形成
与稳定机制，并可为麻风树种子在新型生物能源及植物生物
反应器方面深入开发与利用提供理论依据。本研究从
GenBank 数据库中搜索得到已知登录的麻风树油质蛋白家族
基因 mＲNA 全长序列(GenBank 序列号为 EU234462． 2、
EU234463． 2、EU234464． 2)，但有关麻风树油质蛋白基因
DNA序列克隆和序列分析的相关报道还未发现。笔者所在
课题组根据 EU234464． 2 序列设计特异性引物，克隆了麻风
树油质蛋白家族基因 JcOle14． 3 在染色体上的 DNA 序列
(GenBank序列号为 JX073623． 1)。本研究根据 EU234463． 2
序列设计特异性引物，克隆麻风树油质蛋白家族基因
JcOle16． 6 在染色体上的 DNA 序列(GenBank 序列号为
JX073622． 1)，并对该基因序列及其推测编码的 JcOle16． 6 蛋
白进行生物信息学分析。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
试验材料为三年生麻风树植株，取其未成熟种子和幼叶
于液氮中速冻后置于 － 80 ℃冰箱中保存备用。
植物总 ＲNA 提取试剂盒(ＲNAiso Plus)、M － MLV 反转
录试剂盒和 pMD18 － T 载体均为 TaKaＲa 产品，植物基因组
DNA提取试剂盒为北京天根生物技术有限公司产品，胶回收
试剂盒为 Omega 产品，大肠杆菌 DH5α 为实验室保存菌种，
其他化学试剂均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 总 ＲNA提取与检测 麻风树幼叶基因组 DNA 提取
按照植物基因组 DNA提取试剂盒说明书完成，麻风树种子总
ＲNA提取参照丁勇等方法［25］完成;DNA 完整性和纯度分别
采用 1． 0%琼脂糖凝胶糖电泳和紫外分光光度计检测，ＲNA
完整性和纯度分别采用 1． 2%琼脂糖凝胶糖电泳和紫外分光
光度计检测。
1． 2． 2 麻风树 JcOle16． 6 基因克隆 在已知麻风树油质蛋白
基因 mＲNA 全长序列(GenBank 序列号为 EU234463． 2)的
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OＲF区外侧设计引物，上游引物为 JcOle16． 6F:5 － CTTTCT-
CACACTTATCATCAAC －3，下游引物为 JcOle16． 6Ｒ:5 － TA-
AACCAACTCAACTACCTCAA －3，并由生工生物工程(上海)
股份有限公司完成序列合成。以提取的总 ＲNA为模板，采用
反转录试剂盒合成第一链 cDNA，取第一链 cDNA 2 μL，上下
游引物各 1 μL，2 × Taq PCＲ Master Mix 12． 5 μL，ddH2O
8． 5 μL，建立 25μL 的 ＲT － PCＲ 反应体系，克隆目的基因
cDNA序列，反应条件为:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s，
48 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 个循环;72 ℃ 延伸
10 min。取 2 μL DNA 为模板，上下游引物各 1 μL，2 × Taq
PCＲ Master Mix 12． 5 μL，ddH2O 8． 5 μL，建立 25 μL 的 PCＲ
反应体系，克隆目的基因在染色体上的 DNA 序列，反应条件
为:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 30 s，48 ℃退火 30 s，72 ℃
延伸 1 min，35 个循环;72 ℃延伸 10 min。
1． 2． 3 PCＲ 产物检测、回收、T /A 克隆与测序 应用 1． 2%
琼脂糖凝胶电泳检测 PCＲ 产物，目的片段回收后连接到
pMD18 － T载体上，将重组子转化大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞，转化复苏后的菌液涂布在含有 Amp、IPTG 和 X － Gal 的
LB固体培养基上，过夜培养后随机筛选白色菌落，将阳性克
隆菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。
1． 2． 4 序列的生物信息学分析 生物信息学分析参照已知
文献报道的方法［15，26 － 27］进行，包括 mＲNA及推导的蛋白质氨
基酸序列相似性搜索，mＲNA开放阅读框查找，蛋白理论分子
量、等电点、氨基酸含量和稳定性分析，系统发生树构建，蛋白
质亲水 /疏水性特性、跨膜结构、信号肽及功能域预测，目的蛋
白二级、三级结构预测。
2 结果与分析
2． 1 麻风树油质蛋白 JcOle16． 6 基因克隆
本研究以提取的总 ＲNA和基因组 DNA为模板分别进行
ＲT － PCＲ和普通 PCＲ试验，均获得 1 条位于 500 ～ 750 bp 区
间的特异性 cDNA和 DNA条带(图 1)，将目的 cDNA 和 DNA
条带进行胶回收、TA克隆和测序，结果表明，本研究克隆到的
麻风树油质蛋白基因 cDNA 序列长 601 bp，序列与 GenBank
数据库 中 登 录的 麻 风 树 油 质 蛋 白 基 因 mＲNA 序 列
EU234463． 2 具有 100%的相似性，本研究克隆到的麻风树油
质蛋白基因 DNA序列也为 601 bp，序列与 601 bp的 cDNA序
列完全一致。根据生物信息学分析结果，本研究将该目的基
因命名为麻风树油质蛋白 JcOle16． 6 基因，其 601 bp 的 DNA
序列登录 GenBank的序列号为 JX073622。表明 JcOle16． 6 基
因只包含 1 个外显子，没有内含子。
2． 2 序列分析
本研究克隆获得麻风树 JcOle16． 6 基因 601 bp的基因组
DNA序列，其转录的 601 bp的 mＲNA具有完整的 OＲF，位于
第 25 至第 492 bp区域，第 1 至第 24 bp区域为 5UTＲ，第 493
至第 601 bp区域为3 UTＲ。OＲF推测编码的麻风树油质蛋
白 JcOle16． 6(GenBank序列号为 AFP19884)由 155 个氨基酸
残基组成，相对分子质量为 16． 6 ku，带负电荷的氨基酸残基
(天冬氨酸 +谷氨酸)为 9 个，带正电荷的氨基酸残基(精氨
酸 +赖氨酸)为 16 个，pI为 9． 99，推测 JcOle16． 6 在生理条件
下为碱性蛋白。除谷氨酰胺和半胱氨酸之外，JcOle16． 6 含有
其他 18 种常见的氨基酸残基，色氨酸含量最低，为 0． 6%，天
冬氨酸、酪氨酸含量也较低，均为 1． 3%，亮氨酸含量最高，为
12． 9%，其他氨基酸含量在 2． 6% ～ 10． 3%之间。因其具有
38． 97 的不稳定系数值，推测 JcOle16． 6 为稳定性蛋白质。
蛋白质相似性分析结果见(图 2)显示，麻风树 JcOle16． 6
含有“油质蛋白”保守结构域，属于油质蛋白超家族蛋白之
一。JcOle16． 6 蛋白与油桐(Vernicia fordii)的油质蛋白Ⅱ、胡
杨(Populus euphratica)的油质蛋白 18． 2 ku － like、毛果杨(P．
trichocarpa)油质蛋白家族蛋白、蓖麻(Ｒicinus communis)的油
质蛋白 1、川桑(Morus notabilis)的油质蛋白 5、爱玉子(Ficus
pumila var．)的油质蛋白高分子量异构体、醉蝶花(Tarenaya
hassleriana)的油质蛋白 5 异构体、亚麻(Linum usitatissimum)
的油质蛋白高分子量异构体、胡萝卜(Daucus carota)的脂质
体膜蛋白、油茶(Camellia oleifera)的 Ole Ⅳ蛋白、烟草(Nicoti-
ana sylvestris)的油质蛋白 5 － like、甜橙(Citrus sinensis)的油
质蛋白 18． 2 ku － like 等都具有较高的相似性，E 值从 9 ×
10 －75 ～ 3 × 10 －56，一致性60% ～ 83%，相似度 74% ～ 91%(表
1)。但 JcOle16. 6 蛋白与该课题组克隆的另一个麻风树油质
蛋白家族基因 JcOle14． 3(GenBank 序列号为 JX073623)编码
的异构体 JcOle14． 3 蛋白(GenBank 登录号为 AFP19885)之
间的相似度较低，以致分析结果未能显示出。表明本研究克
隆的 JcOle16． 6 基因编码的 JcOle16． 6 蛋白属于麻风树油质
蛋白异构体之一。
将 13种不同植物的油质蛋白进行序列比对分析，结果见
图 3，显示麻风树 JcOle16． 6蛋白与其他的油质蛋白在肽链中
间序列具有较高的一致性，而在肽链两端序列却存在较大差
异性。1个丝氨酸和3个脯氨酸组成的脯氨酸结(Pro － Knot)
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表 1 JcOle16． 6 蛋白与其他已知功能蛋白同源性比较
GenBank序列号 同源蛋白 拉丁名 长度
(个)
S值 E值 一致性
(%)
相似度
(%)
间隔
(%)
ADB03185． 1 油质蛋白Ⅱ Vernicia fordii 154 232 bits(592) 9 × 10 －75 83 91 1
XP_011005135． 1 油质蛋白 18． 2 ku － like Populus euphratica 149 231 bits (588) 2 × 10 －74 77 85 8
XP_002323804． 1 油质蛋白 family protein Populus trichocarpa 149 226 bits (575) 3 × 10 －72 73 83 8
XP_002521458． 1 油质蛋白 1 Ｒicinus communis 153 218 bits (556) 2 × 10 －69 69 84 6
XP_010108818． 1 油质蛋白 5 Morus notabilis 157 210 bits (535) 3 × 10 －66 66 80 4
ABQ57396． 1 油质蛋白 H － isoform Ficus pumila var． 155 205 bits (521) 4 × 10 －64 63 80 2
XP_010524296． 1 油质蛋白 5 isoform X1 VTarenaya hasslerianaV 161 196 bits (497) 2 × 10 －60 62 79 3
ABB01616． 1 油质蛋白 high molecular weight isoform Linum usitatissimum 180 196 bits (499) 2 × 10 －60 63 74 21
AAB24078． 1 Lipid body membrane protein Daucus carota 180 191 bits (485) 2 × 10 －58 63 75 5
ABF57561． 1 OleIV Camellia oleifera 154 190 bits(483) 3 × 10 －58 63 77 2
XP_009772501． 1 油质蛋白 5 － like Nicotiana sylvestris 166 187 bits(476) 3 × 10 －57 60 74 8
XP_006470260． 1 油质蛋白 18． 2 ku － like Citrus sinensis 166 185 bits(470) 3 × 10 －56 62 75 7
为已知植物油质蛋白序列的标志性结构［12，28］，该保守结构域
也存在于麻风树 JcOle16． 6 和其他参比的油质蛋白序列中。
油质蛋白进化树分析结果见图 4，大戟科麻风树 JcOle
16. 6 和大戟科油桐油质蛋白Ⅱ(ADB03185． 1)亲缘关系最
近，聚为一支，和大戟科蓖麻油质蛋白 1(EEF40948． 1)聚为
一个大支;同样来自麻风树的 JcOle14． 3(AFP19885． 1)和油
质蛋白1 － like(NP_001295613． 1)聚为一支，二者与爱玉子
(Ficus pumila var．)的油质蛋白高分子量异构体(ABQ57396．
1)、醉蝶花(Tarenaya hassleriana)的油质蛋白 5 异构体(XP_
010524296． 1)属于一个大分支，但与 JcOle16. 6 的系统发育
进化距离较远。推测来自不同植物的同一种油质蛋白异构体
基因具有较近的进化关系，而来自同一植物的不同油质蛋白
异构体基因具有较远的进化关系。
信号肽分析结果未发现可能的信号肽序列存在于
JcOle16． 6 蛋白中，表明该蛋白为非分泌性蛋白。疏水性分析
结果见图 5，显示 JcOle16． 6 蛋白质肽链在 N端 1 ～ 31 位和 C
端 109 ～ 155 位氨基酸残基区域都表现为高度亲水性，而中间
32 ～ 108 位氨基酸残基区域表现为高度疏水性，表明麻风树
JcOle16． 6 蛋白为两亲性蛋白质，即蛋白的两末端区域为亲水
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性，中间区域为疏水性。蛋白质跨膜结构分析结果见图 6，显
示 JcOle16． 6 蛋白在中间疏水区域存在 2 个潜在的跨膜螺旋
结构域，第 49 ～ 72 位的 24 个氨基酸残基形成第 1 个跨膜螺
旋结构域，方向为从膜外到膜内螺旋;第 80 ～ 101 位的 22 个
氨基酸残基形成第二个跨膜螺旋结构域，方向为从膜内到膜
外螺旋。表明麻风树 JcOle16． 6 蛋白质为含有 2 个跨膜螺旋
结构域的两亲性蛋白质，中间高度疏水区域位于油体半单位
膜内，N －末端和 C －末端 2 个高度亲水区域位于油体半单位
膜外，即位于胞质内。
功能蛋白质分子在生物体内都会执行特定的生命活动，
其多肽链翻译后通常折叠和盘曲成比较稳定的二级结构，并
进一步形成高级结构，完成活性功能域构象的构建。二级结
构分析结果见图 7，显示麻风树 JcOle16． 6 蛋白可能含有 3 种
二级结构类型，分别为 α － 螺旋占 72． 26%、随机卷曲占
23. 87%，少量延伸链占 3． 87%。可见 α －螺旋为 JcOle16． 6
蛋白主要二级结构，约占整个肽链的 3 /4，分别位于 18 ～ 22
位(α1)、31 ～ 42位(α2)、45 ～ 68位(α3)、75 ～ 93位(α4)、
98 ～ 152 位(α5)氨基酸残基区域。推测 JcOle16． 6 蛋白 α －
helix的形成可能与预测的 2 个跨膜螺旋结构域的形成及与
油体半单位膜的定位结合有着密切的关系。JcOle16． 6 蛋白
二级结构，尤其是 α －螺旋结构在应用 I － TASSEＲ 程序预测
的高级结构(图 8)中可清晰显示出。GO 功能分类结果显示
JcOle16． 6 与磷脂单分子层膜的油脂储藏体(GO:0012511)相
关，并能整合到单分子层膜上(GO:0016021)。因此，根据蛋
白质疏水性、跨膜结构、二级结构、高级结构和功能分析结果，
推测 JcOle16． 6 蛋白在结构上可分为 3 个部分:(1)N端约 30
个氨基酸残基组成的亲水性区域，分布于油体朝向胞浆一面，
α1位于此结构域;(2)C端约 47 个氨基酸组成的 α －螺旋两
亲性结构域，也分布于油体朝向胞浆一面，α5 位于此结构域;
(3)肽链中间约 78 个氨基酸残基组成的高度疏水性跨膜区
域，分布于油体半单位膜内，α2、α3、α4 位于此结构域，α3、α4
之间存在着由 3 个脯氨酸和 1 个丝氨酸组成的 Pro － Knot 高
度保守结构域(图 8)，这与 JcOle16． 6 蛋白向油体半单位膜的
正确定位和油体结构的稳定维持密切相关。
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3 结论与讨论
油质蛋白是与植物油体特异性结合的主要蛋白质，在油
料植物种子中普遍存在［29］，在植物种子成熟过程中油质蛋白
几乎覆盖整个油体表面，使得油体虽以互相积压形式充满整
个细胞但从不相互聚合，推测油质蛋白与植物油体的形成和
稳定有着密切的关系［30 － 32］。油质蛋白及其基因已在多种植
物中得到了一定的研究［33 － 37］。本研究分离克隆了麻风树油
质蛋白基因家族成员 JcOle16． 6 基因长 601 bp 的 DNA 序列
(GenBank 序列号为 JX073622． 1)，JcOle16． 6 基因在染色体
水平上没有内含子，转录的 JcOle16． 6 mＲNA 具有468 bp 的
完整开放阅读框，编码含 155 个氨基酸残基、分子量为
16． 6 ku 的 JcOle16． 6 蛋白(GenBank 序列号为 AFP19884)，
属于植物油体结合蛋白油质蛋白家族的新成员。
不同植物来源的油质蛋白在分子量上具有较大的变化。
研究表明，特异性存在于植物种子中的油质蛋白分子量在
15 ～ 26 ku 之间变化［2］。本研究从麻风树种子中分离克隆的
JcOle16． 6 基因表达的 JcOle16． 6 蛋白分子量也在此范围之
内，为 16． 6 ku，符合 Anthony 和 Huang 的分析结果。在蛋白
质结构上 JcOle16． 6 可分为 3 个结构区域，即 N 端约 30 个氨
基酸残基组成的含 1 个 α －螺旋的亲水性结构域，肽链中间
约 78 个氨基酸残基组成的含 3 个 α －螺旋的高度疏水性跨
膜结构域，C端约 47 个氨基酸组成的含 1 个 α －螺旋的两亲
性结构域。N端亲水性结构域和 C端两亲性结构域均分布于
油体朝向胞浆一面，中间疏水跨膜结构域分布于油体半单位
膜内，存在于中间疏水跨膜结构域中的由 3 个脯氨酸和 1 个
丝氨酸组成的 Pro － Knot 高度保守结构域在 JcOle16． 6 蛋白
与油体半单位膜准确定位和稳定维持油体结构方面起着重要
作用。与相关研究关于油质蛋白结构和功能的论述［35］一致，
表明油质蛋白基因在不同植物中表达的油质蛋白能形成类似
的结构特性并发挥相同的生物学功能。
油质蛋白基因常以为数不多的基因家族形式存在。在裸
子植物中只发现 1 种油质蛋白［36］，在已研究的被子植物中发
现在同一植物中存在氨基酸序列和分子量大小都明显不同的
多种油质蛋白异构体［37 － 38］。刘玉君等对麻风树种子油体蛋
白进行电泳分析，发现分子量分别为 20、24 ku 的 2 种油质蛋
白异构体可能存在于麻风树种子油体中［39］。本研究从麻风
树种子中分离克隆的 JcOle16． 6 基因产物推测为 16． 6 ku 的
油质蛋白，同时笔者从麻风树种子中成功克隆的 JcOle14． 3
基因产物推测为 14． 4 ku的油质蛋白。推测麻风树油质蛋白
基因也以基因家族形式存在，其表达产物可能以不同分子量
油质蛋白异构体形式同时存在于同一油体中。
油质蛋白作为植物油体中发现最早、含量最丰富的油体
结合蛋白被认为是需要长期贮藏的油体所必需的［40］，推测从
油体的发生到分解消失过程中发挥重要的生物学功能。研究
推测油质蛋白在植物种子发育及成熟过程中直接影响油体的
形成、稳定性以及大小［41］，在种子萌发、油体动员与解体过程
中可作为酯酶识别并结合油体的特殊信号［42 － 43］。但
JcOle16． 6 及其他异构体蛋白在麻风树种子油体的发生到分
解消失过程中的具体生物学功能还有待于进一步研究阐明。
本研究分离克隆了麻风树油质蛋白基因家族成员
JcOle16． 6 基因长 601 bp 的 DNA 序列(GenBank 序列号为
JX073622． 1)，JcOle16． 6 基因没有内含子，转录的 JcOle16． 6
mＲNA具有 468 bp的完整开放阅读框，编码含 155 个氨基酸
残基、分子量为 16． 6 ku 的 JcOle16． 6 蛋白(GenBank 序列号
为 AFP19884)，属于植物油体结合蛋白油质蛋白家族的新成
员。JcOle16． 6 具有 3 个结构域，即 N 端约 30 个氨基酸残基
组成的含 1 个 α －螺旋的亲水性结构域，肽链中间约 78 个氨
基酸残基组成的含 3 个 α －螺旋的高度疏水性跨膜结构域，C
端约 47 个氨基酸组成的含 1 个 α －螺旋的两亲性结构域。N
端亲水性结构域和 C 端两亲性结构域分布于油体朝向胞浆
一面，中间疏水跨膜结构域分布于油体半单位膜内，存在于中
间疏水跨膜结构域中的由 3 个脯氨酸和 1 个丝氨酸组成的
Pro － Knot 高度保守结构域在 JcOle16． 6 蛋白与油体半单位
膜准确定位和稳定维持油体结构方面起着重要作用。
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