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飞龙掌血的止血活性及其机制的研究



全 文 :华西药学杂志
W C J·P S 2016,31(2)∶157 ~ 159
基金项目:贵州省科技厅基金项目(黔科合 J字 2013 - 2028 号)
作者简介:刘志刚(1976—),男,博士,副教授,从事天然产物分离、分析相关的教学和科研工作。Email:1623188533@ qq. com
飞龙掌血的止血活性及其机制的研究
刘志刚1,王翔宇2,毛北萍2,谢晓林1
(1.贵阳学院,贵州 贵阳 550005;2.沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 研究民族药飞龙掌血 Toddalia asiatica Lam.的止血活性及其作用机理。方法 采用小鼠出血时间和凝血时间作
为测定指标,进行飞龙掌血提取物止血药的效学研究;连续给药 3 周后,测定大鼠血液凝集参数和血小板形态等指标,继而阐
明其止血作用机理。结果 飞龙掌血氯仿层提取物为最佳止血活性部位,给药大鼠血液的凝血酶时间显著缩短,纤维蛋白原
含量显著增加(P < 0. 05),血小板数目显著增加,血小板形态发生延展,部分生出伪足。结论 通过增加纤维蛋白原含量、促
进内源性凝血途径和改变血小板形态数目可能是飞龙掌血发挥止血活性的主要作用机理。
关键词:飞龙掌血;提取物;止血活性;作用机理;纤维蛋白原;血小板
中图分类号:R96 文献标志码:A 文章编号:1006 - 0103(2016)02 - 0157 - 03
DOI:10. 13375 / j. cnki. wcjps. 2016. 02. 015
Study on the hemostatic mechanism of Toddalia asiatica extracts
LIU Zhigang1,WANG Xiangyu2,MAO Beiping2,XIE Xiaoling1
(1. Guiyang University,Guiyang,Guizhou,550003,P. R. China;2. School of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang,
Liaoning,110016 P. R. China)
Abstract:OBJECTIVE To investigate the hemostatic activities and mechanism of Toddalia asiatica(L.)Lam. extracts. METH-
ODS The hemostatic activities of T. asiatica extracts were investigated by determining the bleeding time and coagulant time of mice.
Blood coagulation parameters of the rats,including PT,APTT,TT,FIB and platelet morphology,were tested after treatment with the
chloroform fraction of T. asiatica extracts for 3 weeks. RESULTS The chloroform layer was found to be the most active fraction with
hemostatic activity. TT was significantly shortened and FIB significantly increased(P < 0. 05). Meanwhile,the platelet number has
increased and the morphology has changed by extension and pseudopodium formation. CONCLUSION Increasing fibrinogen levels,
promoting the endogenous coagulation pathway and increasing the platelet number may be the main mechanism of hemostatic activity of
T. asiatica extracts.
Key words:Toddalia asiatica;Extract;Hemostatic activity;Mechanism;Fibrinogen;Platelet
CLC number:R96 Document code:A Article ID:1006 - 0103(2016)02 - 0157 - 03
飞龙掌血为芸香科飞龙掌血属植物飞龙掌血
Toddalia asiatica(L.)Lam. 的干燥根或根皮,主要
分布于贵州、云南、四川等西南诸省,湖南、福建、台
湾等省区也有分布[1]。飞龙掌血在苗、侗、壮、傣等
少数民族中被广泛地用作止血药物,疗效显著[2],
但对其止血作用机理研究未见文献报道。课题组拟
采用小鼠出血时间和凝血时间为测定指标,对飞龙
掌血不同部位提取物进行止血药效学的筛选,确定
最佳止血活性部位,再过对给药大鼠各项血液凝集
参数和血小板超微形态的研究,揭示飞龙掌血提取
物的止血作用机理。
1 实验部分
1. 1 仪器、试药材与动物
STAGO全自动血栓与止血分析仪(Diagnostica
Stago公司);JEM - 1200EX 透射电镜(日本电子株
式会社)。飞龙掌血采于贵阳市花溪区孟关乡,经
贵阳学院高篷明教授鉴定为飞龙掌血属植物飞龙掌
血 Toddalia asiatica(L.)Lam.的干燥根;凝血活酶
时间(APTT)测定试剂盒(批号:106747)、凝血酶时
间(TT)测定试剂盒(批号:106889)、凝血酶原时间
(PT)测定试剂盒(批号:106917)(法国 Diagnostica
Stago);凝血酶(上海太阳生物技术有限公司,批号:
3032022);云南白药胶囊(云南白药集团股份有限
公司,0. 25 g × 16 粒,批号:20100113);其余试剂为
分析纯。♂Wistar 大鼠(沈阳药科大学实验动物中
心,合格证号:SCXK辽 042 号)200 ± 20 g;昆明种小
鼠(沈阳药科大学实验动物中心,合格证号:SCXK
辽 2008 - 0002 号),♀♂兼用。
1. 2 方法与结果
1. 2. 1 溶液的制备 取飞龙掌血药材适量,以
70%乙醇回流提取 2 次,溶剂的体积为所用药材
12、10 倍,分别提取 2、1 h,合并 2 次提取液,滤过,
减压蒸去溶剂,用适量热水悬浮,分别用氯仿、乙酸
乙酯和正丁醇萃取,减压蒸去溶剂得各萃取部位
(氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层及水层),备用。
1. 2. 2 动物的分组及给药 将健康昆明种小鼠 60
只饲养一周后均分为 6 组,分别为空白组、阳性对照
药组(云南白药胶囊)、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇
层和水层给药组。参照文献给药剂量并根据人每日
服用飞龙掌血药材和云南白药胶囊的剂量进行折
算。按体重分别 ig给药,小鼠每日服飞龙掌血生药
量为 0. 65 g·kg -1,阳性药云南白药胶囊的给药剂量
为 0. 2 g·kg -1,每日一次,连续 7 d,于第 7 天给药 30
min后采用毛细玻管法测定小鼠的凝血时间(CT),
次日采用剪尾法测定出血时间(BT)[4]。
1. 2. 3 飞龙掌血提取物不同部位止血活性的测定
经 One - way Anova 统计分析,结果表明:空白组
与阳性对照组、氯仿层、乙酸乙酯层和正丁醇层给药
组小鼠的 BT 和 CT 之间均存在显著性差异(P <
0. 05)。飞龙掌血药材 70%乙醇提取物的氯仿层、
乙酸乙酯层和正丁醇层均表现出不同程度的缩短小
鼠 BT和 CT的作用,其中以氯仿层提取物的止血作
用最为显著(表 1)。氯仿层给药缩短小鼠 BT 的作
用与阳性对照云南白药胶囊相当,提示飞龙掌血
70%乙醇提取物的氯仿萃取层中可能存在内源性因
素发挥止血作用。
表 1 飞龙掌血各部位提取物对小鼠出血时间、凝血时间的影响
(min,珔x ± s,n =10)
Table 1 Effects of different fractions of 70% ethanol extract on
blooding time(BT)and coagulant time(CT)of mice
(min,珔x ± s,n =10)
Groups BT CT
空白 38. 0 ± 8. 2 143. 2 ± 11. 1
云南白药 23. 7 ± 5. 8* 80. 7 ± 18. 6*
氯仿层 22. 0 ± 7. 1* 85. 5 ± 20. 3*
乙酸乙酯层 23. 6 ± 5. 1* 89. 4 ± 12. 7*
正丁醇层 25. 0 ± 5. 1* 94. 0 ± 17. 7*
水层 38. 7 ± 10. 8 120. 7 ± 20. 0*
Compared with blank group:* P < 0. 05
1. 2. 4 飞龙掌血提取物止血的作用机理 按
“1. 2. 1”项下方法制备溶液,取氯仿层提取物备用。
取健康 Wistar大鼠 72 只,饲养一周后随机均分为 3
批,每批再随机均分为 3 组,分别为空白组及低、高
剂量给药组。低、高剂量给药组大鼠每日分别 ig 飞
龙掌血氯仿层提取物(折合生药量为 1. 2、3. 6 g·
kg -1),每天 1 次,连续 3 周,分别于给药第 7、14、21
天,给药 1 h后从大鼠颈动脉取血 2. 0 mL注入真空
采血管中,轻轻摇匀,用于血液凝集参数的测定。采
用血液自动生化测定仪测定大鼠血浆的凝血酶原时
间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时
间(TT)和纤维蛋白原含量(FIB),结果见表 2 ~ 5。
结果表明:大鼠连续给药 3 周后,给药组与空白对照
组比较,PT、APTT 值总体上有不同程度的缩短趋
势,但经 One - way ANOVA 统计分析,与空白组间
不存在显著性差异;TT值在连续给药 3 周后显著缩
短,给药组的 FIB 值均显著增加,提取物高、低剂量
给药组的 FIB值和给药 3 周后的 TT 值与对照组间
均存在显著性差异(P < 0. 05),但高、低剂量给药组
之间无显著性差异。
表 2 飞龙掌血提取物对大鼠血浆 PT的影响(s,珔x ± s,n =8)
Table 2 Effects of chloroform fraction of 70% ethanol extracts on
PT of the rats(s,珔x ± s,n =8)
Groups 7 d 14 d 21 d
Blank 18. 70 ± 1. 49 18. 39 ± 2. 62 17. 05 ± 1. 61
Low dose 18. 25 ± 1. 23 18. 71 ± 2. 79 16. 36 ± 1. 70
High dose 18. 55 ± 1. 08 18. 31 ± 2. 20 16. 31 ± 1. 82
表 3 飞龙掌血提取物对大鼠血浆 APTT的影响(s,珔x ± s,n =8)
Table 3 Effects of chloroform fraction of 70% ethanol extracts on
APTT of rats(s,珔x ± s,n =8)
Groups 7 d 14 d 21 d
Blank 21. 38 ± 1. 75 22. 25 ± 3. 12 22. 75 ± 1. 28
Low dose 21. 03 ± 3. 49 21. 93 ± 2. 35 22. 67 ± 3. 37
High dose 20. 91 ± 2. 47 21. 48 ± 2. 56 22. 38 ± 2. 60
表 4 飞龙掌血提取物对大鼠血浆 TT的影响(s,珔x ± s,n =8)
Table 4 Effects of chloroform fraction of 70% ethanol extracts on
TT of rats(s,珔x ± s,n =8)
Groups 7 d 14 d 21 d
Blank 21. 11 ± 3. 10 21. 65 ± 3. 81 22. 27 ± 4. 24
Low dose 19. 24 ± 4. 26 20. 80 ± 2. 08 16. 65 ± 3. 50*
High dose 19. 28 ± 3. 72 20. 93 ± 3. 04 16. 20 ± 2. 93*
Compared with blank group:* P < 0. 05
表 5 飞龙掌血提取物对大鼠血浆 FIB的影响(g·L -1,珔x ± s,n =8)
Table 5 Effects of chloroform fraction of 70% ethanol extracts on
FIB of rats(g·L -1,珔x ± s,n =8)
Groups 7 d 14 d 21 d
Blank 0. 85 ± 0. 11 1. 13 ± 0. 47 1. 23 ± 0. 58
Low dose 1. 40 ± 0. 42* 1. 45 ± 0. 69* 2. 05 ± 0. 44*
High dose 1. 58 ± 0. 66* 1. 35 ± 0. 71* 2. 12 ± 0. 37*
Compared with blank group:* P < 0. 05
1. 2. 5 血小板超微形态的研究 取 1∶9 柠檬酸钠
抗凝大鼠血样 2. 0 mL,于 800 r·min -1离心 10 min,
分取上清液,制得富血小板血浆(PRP),加入 0. 2%
戊二醛 1 mL,轻轻摇匀,室温下预固定 30 min,于
800 r·min -1离心 15 min,弃上清液,将提取后的血小
851 华 西 药 学 杂 志 第 31 卷
板置 2. 5%戊二醛中,在室温下固定 2 h,用0. 1 mol·
L -1磷酸盐缓冲液进行漂洗,再用 1%锇酸固定,用
酒精梯度脱水后,经过 Epon812 包埋、超薄切片和乙
酸铀 -柠檬酸铅染色等步骤处理,最后于 JEM -
1200EX透射电镜下观察血小板的形态。分别取空
白组的大鼠血浆和连续给药 3 周后大鼠血浆制备检
材,于透射电镜下观察血小板形态(图 1)。通过比
较空白组和飞龙掌血提取物给药组大鼠血小板形态
可看出:ig大鼠飞龙掌血提取物后,血小板的数目和
形态发生明显变化,在血小板数目显著增加,血小板
形态发生延展,部分生出伪足,同时诱导了血小板发
生聚集。
图 1 空白组(A)及低剂量组(B)大鼠血浆的超微形态(1. × 5 × 103;2. × 8 × 103;3. × 1 × 104)
Figure 1 Platelet morphology of the blank group(A)and low dose group(B)(1. × 5 × 103;2. × 8 × 103;3. × 1 × 104)
1. 2. 6 统计学分析 结果采用统计学软件 SPSS
17. 0 处理,所有数据均以 Anova(one - way)进行统
计学分析,P < 0. 05 为有显著性差异。
2 讨论
临床上常使用的止血中药主要是通过缩短凝血
时间、抑制纤溶过程、增加血小板数目和缩短凝血酶
生成时间等途径来达到止血目的[3]。活化部分凝
血活酶时间(APTT)可反映出内源性凝血因素是否
出现异常,凝血酶原时间(PT)可反映外源性凝血因
素是否出现异常,而凝血酶时间(TT)则反映凝血共
同途径纤维蛋白原转变成为纤维蛋白(FIB)过程
中,是否存在异常的抗凝血现象[4 - 5]。文中结果显
示,飞龙掌血提取物氯仿层部位 ig 大鼠 3 周后,可
显著缩短 TT,并显著增加 FIB,该结果与文献[5]报
道藏药独一味的止血作用有共同之处,即通过增加
FIB,缩短 TT,从而影响抗凝和纤溶系统,上述途径
可能是飞龙掌血提取物发挥止血作用的主要机理。
血小板是许多止血药物发挥止血作用的重要因
素[6],通过电子显微镜技术可直接观察血小板的聚
集情况,同时对血小板外形及内部结构变化进行研
究是研究药物止血和凝血功能的重要手段。文中采
用电子显微镜研究了给药大鼠血小板的超微结构,
通过对比空白组和飞龙掌血提取物氯仿层部位给药
大鼠的血小板形态可看出:予大鼠 ig 飞龙掌血提取
物氯仿层部位后,血小板数目和形态发生了显著变
化,具体表现在血小板数目显著增加,血小板形态发
生延展,部分生出伪足,由此可确定:血小板形态和
数目的变化可能是飞龙掌血发挥止血作用的另一个
重要途径。
致谢:承沈阳军区总医院检验科在血液生化指标检测、
中国医科大学电镜室在电子显微镜测试中给予帮助。
参考文献:
[1] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草,苗药卷[M].
贵阳:贵州科技出版社,2005.
[2] 黄江红,谢楷标,邓永福,等. 飞龙掌血提取物止血作用初步
研究[J].浙江中医杂志,2013,48(10):773 - 774.
[3] 陈奇.中药药理研究方法学[M]. 第 2 版. 北京:人民卫生出
版社,2006.
[4] 李茂星,贾正平,沈涛,等. 口服独一味水提取物对大鼠血液
凝集参数的影响[J].中药材,2006,29(2):160 - 163.
[5] Osoniyi O,Onajobi F. Coagulant and anticoagulant activities in
Jatropha curcas latex[J]. J Ethnopharmacology,2003,89:101 -
105.
[6] 唐正龙,王兴,伊彪,等. 云南白药对血小板的释放与代谢反
应的影响[J].贵阳医学院学报,2009,10(3):87 - 89.
收稿日期:2014 - 09 - 01
951第 2 期 刘志刚,等。飞龙掌血止血活性及机制的研究