全 文 ：雷红灵 ,薛　华 ,朱雄峰 ,等.硒与碎米荠叶片谷胱甘肽过氧化物酶活性的相关性 [ J] .江苏农业科学 , 2010(4):406-408.
硒与恩施碎米荠叶片谷胱甘肽过氧化物酶活性的相关性
雷红灵 1, 2 , 薛　华 3 , 朱雄峰4 , 吴永尧 2
(1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室 /湖北民族学院生物科学技术学院,湖北恩施 445000;2.湖南农业大学生物科学技术学院 ,湖南长沙 410128;
3.湖北省恩施州产品质量监督检验所 ,湖北恩施 445000;4.湖北省武汉市环境监测中心站 ,湖北武汉 430015)
　　摘要:以恩施碎米荠中的含硒抗氧化酶 GSH-Px为研究对象 , 以 Na2SeO3作为硒源 ,分析了 0、10、20、 30、40、50、
60mg/L等 7个不同 Na2SeO3浓度营养液对碎米荠含硒量及 GSH-Px活性的影响。结果表明:碎米荠叶片中的含硒
量随着硒浓度的增大而增加 , 在 30 mg/L后 , 增加趋势减缓;加硒处理后 , GSH-Px活性高于对照 , 硒处理浓度达到
30mg/L时 ,酶的活力最大;GSH-Px的活性(y)与外源硒浓度(x1)及植物含硒量(x2)的相关性拟合曲线方程分别为:
y=24.424 3+10.500 4x1 -0.152 7x1 2 , r2 =0.884 9;y=43.407 1-1.411 4x1 +0.008 2x22 -0.000 012x32 , r2 =0.986 3。
　　关键词:富硒植物;碎米荠;硒;谷胱甘肽过氧化物酶;相关性
　　中图分类号:Q946.5　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)04-0406-03
收稿日期:2009-11-25
基金项目:国家民委 2007年度科研项目(编号:07HB03);生物资源
保护与利用湖北省重点实验室开放课题(编号:2007001);湖北省
教育厅 2010年科学研究计划重点项目(编号:D20101905)。
作者简介:雷红灵(1967—),女 ,湖北鹤峰人 ,博士研究生 ,副教授 ,主
要从事生物化学与分子生物学研究。 E-mail:leihl123366@ 163.
com。
通信作者:吴永尧 ,男 ,教授 ,博士生导师。 E-mail:yywu357@sohu.
com。
　　谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathioneperoxidase, GSH-Px)
是生物体内一种重要的抗氧化酶 ,它是一种含硒酶 ,硒以硒代
半胱氨酸的形式存在于酶分子的活性中心 ,对酶的合成及其
活性的调节起着重要作用 [ 1 ] 。已有研究表明 ,高等植物中存
在活跃的 GSH-Px,其活性依赖于硒的存在 [ 2] ,在一定浓度
范围内 ,硒可以明显增强酶的活性 [3 -5] 。植物中硒的抗氧化
功能也主要是通过促进 GSH-Px活性而实现 [ 6 ] 。不同的植
物耐硒及富硒能力都不一样 ,硒对不同植物的生长发育 、生理
生化过程影响都会有不同的特点 ,研究植物中 GSH-Px活性
的变化 ,可以帮助了解硒对某一植物的生理生化性质影响及
硒进入植物体内后的形式转化 。
恩施碎米荠是在恩施高硒区发现的一种具有超富硒能力
的可食 用 植物 [7 ] , 幼苗 期 叶 片的 含 硒 量可 以 超过
1 000 mg/kg。硒如何影响该植物生长发育及生理生化特点还
少有报道 ,所以本研究在探索该植物 GSH-Px活性检测方法
的基础上 ,就外源施硒对 GSH-Px活性的影响及植物含硒量
与酶活性之间的相关性作了初步探讨 ,为更深入研究该植物
富硒及耐硒机理 、硒在植物体内的动态变化提供参考 。
1　材料、仪器与试剂
1.1　试验材料
恩施碎米荠(Cardamineenshiensis):恩施高硒区鱼塘坝生
长的富硒植物的种子 ,采集后在实验室进行液体培养 。
1.2　主要仪器与试剂
BeckmanAvanti30 Centrifuge高速冷冻离心机;北京科创
海光仪器有限公司生产的 AFS-2202EX型双道原子荧光光
度计;ETHOSPLUS微波消解系统(意大利);北京普析通用仪
器有限责任公司生产的 TU-1810紫外 /可见分光光度计 。
还原型谷胱甘肽(GSH)、5, 5-二硫代对二硝基苯甲酸
(DTNB)、考马斯亮 G-250为进口分装;H2O2 、HCl、HNO3 、
HClO4 为 优级 纯;硒 标 准 液 (GSB07 -1253 -2000 ,
100μg/mL)来自国家环保总局标准样品研究所;牛血清白蛋
白为生化试剂;其他试剂为国产分析纯 。
2　方法
2.1　恩施碎米荠的液体培养
将当年的恩施碎米荠种子洗净 , 75%乙醇浸泡 5 min,纯
净水冲洗干净 ,浸泡 24 h。播撒种子于消毒的纱布上进行萌
发 ,待长至 3 ～ 5片叶时 ,转于日本园艺配方均衡营养液中培
养 。打孔泡沫定植 ,苗以下部分遮光 ,自然光照 。待苗长至一
定大小后 , 选取长势一致的苗分成平行的 7组 , 分别用含
Na2 SeO3 0、10、20、30、40、50、60mg/L等 7个浓度的营养液培
养幼苗 。半个月更换 1次营养液 , 1个月后进行测定 。
2.2　GSH-Px活性的测定
2.2.1　酶液提取及蛋白质的定量　准确称取鲜叶 1.000 g,
加适量 25 mmol/LPBS(pH值 =7.0 , 内含 0.1%PVP、
1 mmol/LAsA、1 mmol/LEDTA-Na2 ),冰浴研磨 , 4 ℃下
10 000 r/min离心 20min,取上清定容 ,于 0 ～ 4 ℃保存备用。
蛋白质以牛血清白蛋白为标准 ,考马斯亮蓝 G-250法
测定 。
2.2.2　酶活性的测定　取酶液及煮死的酶液各 0.2 mL,分
别加入 1.0 mmol/LGSH0.2 mL, 混匀 , 另取一试管加 PBS
0.4mL作为调零管 ,在 37 ℃水浴 5min。再加入经 37 ℃预
热的 1.5mmol/LH2 O2 0.1mL,于 37 ℃下反应 3 min后分别
加入 2mL50 g/LTCA,混匀 ,放置 10 min, 3 000 r/min离心
10 min。取上清液 1.0mL,加入 0.32mol/LNa2 HPO4 1.25 mL、
DTNB显色剂 0.25 mL。加入显色剂后 ,利用光度扫描 ,寻找
最大的吸收波长;再在最大吸收波长下进行时间扫描 ,确定最
佳显色和比色时间 。
—406— 江苏农业科学　2010年第 4期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.04.122
以每分钟催化氧化 1 μmolGSH为 1个活性单位(1 U)。
GSH-Px的活性以单位鲜物质的量及可溶性蛋白所具的活性
单位 2种方式表示 ,即 U/(g· min)和 U/(mg蛋白质 · min)。
2.3　硒的质量分数的测定
2.3.1　样品处理　碎米荠叶片用蒸馏水漂洗干净 , 105 ℃杀
青 , 55℃烘干 ,称取粉碎样品 0.010 0g,加 4 mLHNO3 、1 mL
H2O2 , 200℃微波消解 50 min。冷却后在电热板上控制在
120℃除去 NOx, 冷却 ,再加入 5 mL6 mol/LHCl, 沸水浴
10 min,冷却后用 5% HCl定容至 50 mL。
2.3.2　仪器工作条件及样品的测定　原子荧光光度计的工
作及测量条件:B道 Se高性能空心阴极灯 ,灯电流 80 mA,光
电倍增管负高压 300V,原子化器温度 200 ℃,原子化器高度
8 mm,载气流速 400mL/min,屏蔽气流量 1 000mL/min,延迟
时间 1.0s,读数时间 10s,载流:5%盐酸。
配制 0.000、2.000、4.000、6.000、8.000、10.000 μg/L的
标准工作液 ,在上述工作条件下绘制标准曲线 ,并进行样品
测量 。
2.4　数据处理
数据处理采用 DPS6.2统计软件 , Duncan新复极差法多
重比较 。
3　结果与分析
3.1　恩施碎米荠 GSH-Px活性测定的最大吸收波长及显色
时间的确定
按 “2.2.2”节方法 ,加入显色剂后 ,在 400 ～ 423 nm之间
进行光度扫描 ,结果如图 1-a。可见 , 3次重复最大吸收峰均
出现在波长 412 ～ 414nm处 。选择波长 412 nm,按 “2.2.2”
节方法 ,加入显色剂后进行时间扫描 ,由图 1-b可见 , 3次重
复加入显色剂后 ,溶液的吸光值在 1 ～ 2 min内有 1个短暂的
相对稳定 ,然后随着显色时间的延长逐渐下降 。
3.2　硒对恩施碎米荠 GSH-Px活性的影响
以谷胱甘肽作标准曲线 ,选择在 412 nm比色 ,加入显色
剂后即刻比色读数 ,得到线性回归方程为:y=243.556 3x+
0.591 0 , r2 =0.999 6。可以看出 ,谷胱甘肽与过氧化氢的反
应有非常好的线性关系 。
采用含 0、10、20、30、40、50、60 mg/LNa2SeO3的培养液
培养的碎米荠叶片内的蛋白质质量分数及 GSH-Px活性变
化分别见图 2、图 3。
由图 2可见 , 10 ～ 60mg/L的施硒处理 ,碎米荠叶片中蛋
白质的合成增加 ,在硒处理 30 mg/L时蛋白质含量最高 。
由图 3可见 ,各硒浓度处理的 GSH-Px活力均高于对
照 ,在硒处理 30mg/L达到最高 ,然后随着硒浓度的增加 ,酶
活力增大的百分比逐渐减小 ,而以蛋白质计的酶活力则在
20 ～ 60 mg/L无显著性差异 。 GSH-Px活力与外源硒浓度的
拟合曲线方程为 y=24.424 3+10.500 4x-0.152 7x2 , r2 =
0.884 9 , P=0.0133<0.05。
3.3　恩施碎米荠叶片硒含量与营养液硒浓度的关系
根据原子荧光测标准硒绘制标准曲线 ,得到硒浓度与吸
光度的线性回归方程:y=0.007 1x+0.050 2 , r2 =0.999 8。
不同施硒浓度培养的恩施碎米荠叶片中硒含量的变化见
图 4。
　　由图 4可见 ,在 0 ～ 60 mg/L内 ,恩施碎米荠叶片内的含
硒量随着外源硒浓度的增大而增加 ,只是在 20mg/L以后 ,增
加幅度略有减小 ,说明该植物能有效富集低硒环境中的硒 。
植物 叶 片 的 含 硒 量 与 外 源 硒 浓 度 拟 合 方 程 为
y=148.765 7+14.131 6x, r2 =0.901 6 , P=0.001 1<0.01。
—407—雷红灵等:硒与恩施碎米荠叶片谷胱甘肽过氧化物酶活性的相关性
4　讨论
4.1　恩施碎米荠 GSH-Px活性的测定
GSH-Px活性的检测有直接法和间接法 2类 [ 8 ] ,对于植
物中 GSH-Px活性的检测 ,多采用 DTNB比色法 [ 8 -10] ,但由
于不同植物组成成分和含量不一样 ,导致了干扰物质的影响
不同 ,所以检测不同植物的 GSH-Px活性时 ,最大吸收波长
及显色时间会有一定的差异。
郭静成等在 422nm处比色 ,测定了小麦、水稻 、丝瓜 、黄
瓜 、大白菜中的 GSH-Px活性 [ 3 ] ;而对水稻 [ 9]和枸杞 [ 10 ]中
GSH-Px活性测定条件探讨表明 , 412 nm是比色的最适波
长 。本试验也表明 ,恩施碎米荠 GSH-Px活性检测时的最适
波长是 412 ～ 414 nm。本研究显示 ,加入显色剂后吸收峰稳
定时间较短 ,会随着显色时间延长而减小 ,所以 ,要在加入显
色剂后 1 ～ 2 min内进行比色 。对于沉淀剂的选择 ,黄爱缨等
的研究表明 ,采用 HPO3作沉淀剂的酶活性比 TCA高 19% ～
53%[ 9] ;但由于偏磷酸难溶解 ,配制困难 ,所以本研究还是选
用 TCA作为沉淀剂 ,仍然取得了较好的结果 。
4.2　GSH-Px活性与外源硒浓度及植物含硒量的关系
GSH-Px是一种含硒酶 ,硒以硒代半胱氨酸的形式存在
于是该酶的活性中心 , 硒进入植物体内可以直接掺入到
GSH-Px的结构中去 ,促进 GSH-Px的合成 ,所以增加外源
硒可以提高植物中 GSH-Px的活性 。但是当外源硒达到一
定浓度后 ,随着硒浓度的增大 ,受耐硒能力的限制 ,植物的生
长发育会开始受到影响 ,蛋白质的合成开始减少 ,从而降低
GSH-Px的活性 。随着外源硒浓度的增大 ,叶片中硒含量仍
有所增加 ,也说明硒进入植物体内 ,可以以多种形式赋存于植
物体内 ,如硒氨基酸 、硒核酸 、硒多糖和其他硒蛋白 [ 11] 。碎米
荠中 GSH-Px的活力与含硒量的拟合曲线方程为 y=
43.407 1-1.41 14x+0.008 2x2 -0.000 012x3 , r2 =0.986 3 ,
P=0.027 2<0.05。
GSH-Px是高等植物中硒的赋存形式之一 [ 2] 。测定植
物体内 GSH-Px活性及其与外源硒的关系 ,有助于了解硒对
植物的抗氧化作用机理 。本研究表明:采用 DTNB比色法测
定恩施碎米荠的 GSH-Px活性时 ,可以 TCA作为沉淀剂 ,最
适波长 412 nm,加入显色剂后即刻比色;在营养液中添加
Na2 SeO3 ,可以促进恩施碎米荠 GSH-Px的合成 , 提高其活
性 ,当营养液中 Na2SeO3浓度为 30 mg/L时 ,酶的活力最高 。
当营养液中 Na2 SeO3浓度为 0 ～ 60 mg/L,酶活力与外源硒浓
度的拟合方程为:y=24.424 3 +10.500 4x-0.152 7x2 ,与碎
米荠叶片含硒量的拟合方程为:y=43.407 1 -1.411 4x+
0.008 2x2 -0.000 012x3。
恩施碎米荠是一种具有超富硒能力的 、可食用的野生植
物 ,本试验以 60mg/L的 Na2 SeO3处理 ,叶片中的含硒量可以
达到 960.28 mg/kg,植物的长势良好 。关于该植物的最大耐
硒能力 、富硒机理及硒对其生理生化的影响等 ,笔者所在课题
组正在进行更深入探讨 。
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—408— 江苏农业科学　2010年第 4期