全 文 ：收稿日期:2005 07 15
作者简介:关宏(1967 ), 女(满族),黑龙江齐齐哈尔人 , 博士研究生;游松(1963 ),男(汉族), 辽宁沈阳人 ,教授 , 博
士生导师 ,主要从事天然产物的生物学与药学的研究 , Tel.024 23986436 , E mail yousong206@yahoo.com.cn。
文章编号:1006 2858(2006)03 0172 05
Aspergillus sp.D 1专一性还原左旋一叶 碱
关　宏1 , 杨　莉1 , 李红岩2 , 孙　燕1 , 王　旭1 , 游　松1
(1.沈阳药科大学 制药工程学院 ,辽宁 沈阳 110016;　2.沈阳中方医药科技开发有限公司 ,辽宁 沈阳 110032)
摘要:目的 筛选具有还原左旋一叶 碱能力的微生物菌株。方法 通过 TLC 分析进行菌株的筛
选 ,利用RP HPLC 测定左旋一叶 碱和产物的浓度 ,利用硅胶柱色谱法分离纯化产物 , 通过光谱
分析鉴定了产物的化学结构。结果与结论 筛选到一菌株 Aspergillus sp.D 1能够专一性地还原左
旋一叶 碱的γ,δ双键产生 14 , 15 二氢一叶 碱。在丝状真菌中发现了一种新型的生物催化的
还原反应。
关键词:左旋一叶 碱;曲霉属;反相高效液相色谱法;还原反应
中图分类号:Q 81　　　文献标识码:A
　　左旋一叶 碱[ (-)securinine , SEC]是从大
戟科植物一叶 (Securinega suf fruticosa Rehd.)
叶中提取的一种吡啶类生物碱 , Murav eva 和
Ban kovskii 于 1956 年从(Securinega suf frut i-
cosa Rehd.)中首次分离提取[ 1] 。经数十年来的
研究发现 ,SEC 具有兴奋脊髓 、增强反射及肌肉
紧张度[ 2] 、抗肿瘤[ 3] 、改善骨髓造血机能[ 4] 、诱导
细胞凋亡[ 5 , 6]和体外抗 HSV 1病毒[ 7]等药理活
性 ,临床上主要用于脊髓损伤引起的瘫痪 、小儿麻
痹后遗症和面神经麻痹等疾病的治疗 。文献[ 8]
利用大鼠肝微粒体转化 SEC 产生6 位羟基 、6 位
羰基 、5 位 α及 β羟基取代的SEC ,基本阐明 SEC
在大鼠体内外代谢转化的途径 。
利用微生物作为研究哺乳动物药物代谢的模
型已有许多报道 ,该理论的提出主要基于丝状真
菌与哺乳动物都属于真核生物 ,具有相似的酶代
谢系统[ 9 ～ 11] 。许多微生物具有将小分子有机化
合物结构进行区域选择性 、立体选择性和对映选
择性修饰的能力 , 以完成专一性的催化反
应[ 12 , 13] 。
作者从 11株丝状真菌中筛选到一菌株 As-
pergillus sp.D 1能够将 SEC 转化 ,利用 TLC 检
测 ,发现 Aspergi llus sp.D 1转化 SEC 产生一种
转化产物 ,经硅胶柱分离纯化得到该转化产物 ,通
过光谱分析鉴定了转化产物为 14 , 15 二氢一叶
碱。通过 HPLC 定量分析证明 Aspergil lus
sp.D 1能够选择性地催化还原 SEC 中不饱和内
酯共轭体系的 γ, δ双键 ,如图 1所示。利用丝状
真菌专一性地催化还原 SEC 中不饱和内酯共轭
体系的 γ, δ双键属首次报道 。
Fig.1　Biotransformation route of(-)securinine
1　仪器与材料
1.1　仪器
JASCO LC 1500高效液相色谱系统(日本分
光公司),SCS 24恒温振荡培养箱(上海离心机械
研究所),WGP 400型隔水式电热恒温培养箱(重
庆万达仪器有限公司),手提式压力蒸气灭菌器
(上海申安医疗器械厂),净化台(上海汇龙仪表电
子有限责任公司),ZKF 030型真空干燥箱(上海
实验仪器厂),ZF I型三用紫外分析仪(上海顾村
电光仪器厂),N ICOLET 5DX FTIR 傅立叶变换
红外光谱仪(KBr 压片 ,瑞士 Bruker 公司), Shi-
madzu UV 260型紫外可见分光光度计(日本岛
津株式公社),Waters ®M icromass ZQ2000型液
第 23 卷 第 3 期
2 0 0 6 年 3 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.23 　No.3
Mar.2006 p.172
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2006.03.012
质联用质谱仪(美国Waters 公司), Bruker ARX
300型核磁共振仪(TM S 内标 ,瑞士 Bruker 公
司)。1.2　主要药品与试剂
左旋一叶 碱(w =98.5%,本实验室提供 ,
熔点和比旋度合格 ,其结构经光谱鉴定 ,数据与文
献[ 14] 报道相同),薄层层析硅胶 GF 254(青岛海
洋化工厂), 大孔吸附树脂 D101(南开大学化工
厂),薄层层析硅胶 H(青岛海洋化工厂),乙腈(色
谱纯 ,山东禹王实业有限公司),其他试剂均为市
售生化试剂和分析试剂。
1.3　菌种
短 刺 小 克 银 汉 霉 (Cunninghamel la
blakesleana AS 3.970)、细孢毛霉(Mucor subt ilis-
simus AS3.2454)(中国科学院微生物研究所),荨
麻青霉(Penicil lium urticae CICC 4015)(中国工
业微生物菌种保藏管理中心), 黑曲霉(As-
pergil lus niger 04;Aspergi llus niger 06)、曲霉属
(Aspergillus sp.D 1;Aspergil lus sp.B31;As-
pergillus sp.F 1)、黑根霉(Rhizopus nigricans
HG2)、链格孢属(Alternaria sp.D2)、侧孢霉属
(S porotrichum sp.B12)(从自然界中分离纯化 ,
现保藏于本实验室 , 4℃冰箱中保藏)。
1.4　培养基
斜面培养基(马铃薯葡萄糖培养基):马铃薯
200 g 、葡萄糖 20 g 、琼脂 20 g 、常水 1000 mL , pH
自然 。种子和转化培养基:Polypeptone 5 g 、蔗糖
15 g 、葡萄糖 15 g 、K2HPO4 1 g 、FeSO4·7H2O
0.01 g 、MgSO4 0.5 g 、 KCl 0.5 g 、蒸 馏 水
1 000 mL ,pH 7.0。以上培养基均于 115 ℃蒸汽
灭菌 30 min。
2　方法
2.1　微生物转化 SEC的菌株筛选
向新鲜 、成熟的斜面培养物中加入 5 mL 无
菌培养基 ,制备孢子悬液 。将孢子悬液接入到盛
有50 mL 种子培养基的 250 mL 三角瓶中 ,于
28 ℃振荡培养(250 r·min-1)72 h 后 ,将种子培
养物(φ=5%)接种到盛有 50 mL 转化培养基的
250 mL 三角瓶中 ,同时加入 SEC 乙醇溶液 ,使
SEC在培养基中的终质量浓度为150 mg·L-1 ,继
续培养96 h 。转化结束后 ,将培养物真空抽滤 ,取
滤液通过大孔吸附树脂柱吸附 ,水洗 ,乙醇(φ=
95%)溶液洗脱 ,收集洗脱液 ,水浴浓缩 , 60 ℃真
空干燥。所得干粉经 0.5 mL 甲醇溶解后进行
TCL检测。TCL 条件为硅胶板:硅胶 G254 质量
分数为 0.5%的 CMC ,展开剂:氯仿 甲醇(体积
比为 20∶1),显色剂:碘化铋钾显色液。同步进行
2组对照试验 ,底物对照:向无菌培养基中加入等
量的 SEC ,而不接入微生物菌株;培养物对照:微
生物菌株在相同的条件培养 ,而不加入底物SEC。
通过 TLC 检测 ,发现 Aspergillus sp.D 1具
有转化SEC的能力 。
2.2　SEC转化产物制备和纯化
利用 Aspergil lus sp.D 1制备 SEC 的转化产
物。由新鲜 、成熟的斜面培养物制备适当浓度的
孢子悬液 。将孢子悬液接种到盛有100 mL 种子
培养基的 500 mL 三角瓶中 ,于 28 ℃振荡培养
(250 r·min-1)72 h后 ,将培养物真空抽滤收集菌
丝体。菌丝体经无菌水洗涤后 ,每 100 mL 转化
培养基中加入 4 g(湿重)菌丝体 ,同时加入 SEC
乙醇溶液 。在 SEC 转化产物的制备中称取
150 mg SEC(溶于 10 mL 乙醇中),平均加入到
10瓶盛有 100 mL 转化培养基的 500 mL 三角瓶
中 , 使 SEC 在 培养 基中 的终 质量 浓 度为
150 mg·L-1 ,继续培养 。每隔 2 h 从发酵液中取
样 0.2 mL ,无水乙醇稀释 10 倍后进行 HPLC 检
测。经 HPLC 检测 SEC 转化完全后 ,培养物过
滤 ,将滤液通过大孔吸附树脂柱吸附后 ,水洗 ,乙
醇(φ=95%)溶液洗脱 ,收集洗脱液 ,水浴浓缩 ,
60 ℃真空干燥。得到干粉 240 mg ,经硅胶柱色
谱 ,氯仿 丙酮(体积比为 6∶1)洗脱 ,浓缩干燥后 ,
分离得到转化产物 14 ,15 二氢一叶 碱(50 mg)。
2.3　色谱条件
色谱柱:DiamonsilTM C18柱(200 mm×4.6 mm ,
5μm),流动相:乙腈 25 mmol·L-1醋酸铵(体积比
为25∶75),流速:1.0 mL·min-1 ,柱温:30 ℃,检测
波长:230 nm 。
3　结果
3.1　微生物生物转化 SEC的菌株筛选及转化产
物的鉴定
发酵液经浓缩 、甲醇溶解后进行 TLC 检测 ,
从 11株菌株中筛选到一株 Aspergil lus sp.D 1。
Aspergillus sp.D 1能够将 SEC 转化 。经硅胶柱
层析 ,分离纯化得到转化产物 14 ,15 二氢一叶
碱。
转化产物为褐色油状物 。 IR(KBr)cm-1:特
征峰为 1820 、1758 、1642。EI MS 显示强的[ M +
173第 3 期 关　宏等:Aspergillus sp.D-1 专一性还原左旋一叶 碱　　　
1] +峰为 220 ,提示相对分子质量为 219 ,已知
SEC的相对分子质量为 217 ,说明转化产物比
SEC多 2H 。UV 光谱显示转化产物的最大吸收
峰在 224 nm处 ,而 SEC 在 254 nm 处的最大吸收
峰消失 ,说明 SEC的共轭双键消失 。根据转化产
物的1H NMR 与 SEC 的1H NMR比较 ,转化产
物含有 17H ,14 H 与15 H 的化学位移发生了明
显的变化。转化产物的13C NMR与 SEC 的13C
NMR比较 ,C 14与 C 15 化学位移明显移至高
场 ,转化产物的 1H NMR和13C NMR的数据与
文献[ 14] 报道相同。推测转化产物为 14 , 15 二
氢一叶 碱 ,分子式为 C13H 17NO2 。
3.2　Aspergi llus sp.D 1选择性还原 SEC
SEC加入转化培养基后 ,利用 HPLC 监控
SEC转化的过程 。如图 2所示 ,当 SEC 加入后培
养 2 h 时 , 产物峰 2 出现 ,其保留时间(R t)为
6.1 min。当SEC加入后培养 8 h ,峰 2的峰面积
达到最大 ,底物峰 1(R t =16.2 min)基本消失。
如果再继续培养 16 h ,峰 2的峰面积保持不变。
a—Culture control;b—Substrate control;c—The hydrogena tion product of(-)securinine after 2 h incubation of(-)securi-
nine;d—The hydro genation product o f(-)securinine after 24 h incubation of(-)securinine;1—Represents(-)securinine;
2—Represents 14 , 15-dihydrosecurinine
Fig.2　The hydrogenation course of(-)securinine monitored by HPLC
　　为了进一步证明 Aspergillus sp.D 1能够选
择性还原 SEC 产生 14 , 15 二氢一叶 碱 ,利用
HPLC定量分析发酵液中 SEC 和 14 , 15 二氢一
叶 碱的浓度。如图 3所示 ,当 SEC 加入到转化
培养基在 28 ℃、250 r·min-1条件下培养 8 h 后 ,
Aspergillus sp.D 1将质量分数为 98%的 SEC 转
化 14 ,15 二氢一叶 碱 。
174 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 23卷
Fig.3　The reduction time-curve of(-) securinine using
growing cultures of Aspergillus sp.D 1
4　讨论
通过对 11株丝状真菌转化 SEC 的能力的考
查 ,从中筛选到具有转化 SEC 能力的菌株 As-
pergillus sp.D 1。通过光谱解析 , 证明了 As-
pergillus sp.D 1转化 SEC 的转化产物为 14 , 15
二氢一叶 碱。首次利用生物转化技术将 SEC
转化为 14 , 15 二氢一叶 碱 。在 Aspergil lus
sp.D 1转化SEC的过程中 ,通过 HPLC分析表明
14 ,15 二氢一叶 碱是 Aspergi llus sp.D 1还原
SEC的终产物 , Aspergi llus sp.D 1不再继续还原
14 ,15 二氢一叶 碱产生四氢一叶 碱(如图 2 、
3所示)。从而证明了 Aspergi llus sp.D 1生物催
化SEC 的还原反应 ,即 SEC 中共轭双烯内酯的
γ, δ双键的还原反应 ,是具有选择性的 。据文献
报道通过化学催化方法可将 SEC 顺序地还原为
14 ,15 二氢一叶 碱和四氢一叶 碱[ 15] 。此外 ,
Aspergillus sp.D 1生物催化 SEC 的还原反应不
同于酵母菌催化的 α, β 不饱和酮的还原反应。
在酵母菌催化的 α, β 不饱和酮中碳 碳双键的还
原反应中 ,常常伴有羟基化合物的产生[ 16] 。根据
Aspergillus sp.D 1具有选择性还原 SEC 中不饱
和内酯的 γ, δ 双键的能力 , 作者推测 As-
pergillus sp.D 1可能产生一种新型的还原酶来完
成此还原反应 。鉴于 Aspergil lus sp.D 1和哺乳
动物肝微粒体转化 SEC 的产物不同 ,说明在 As-
pergillus sp.D 1中参与 SEC 代谢的酶不同于哺
乳动物肝微粒体中的酶[ 8] 。
综上所述 , 作者首次发现了一株丝状真菌
Aspergillus sp.D 1可选择性地还原 SEC的 γ, δ
双键而产生 14 ,15 二氢一叶 碱 , 有关 As-
pergillus sp.D 1催化的底物专一性还有待于进一
步的研究 。
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Study on the specific reduction of(-)securinine by
Aspergillus sp.D-1
GUAN Hong1 , YANG Li1 , LI Hong-yan2 , SUN Yan1 , WANG Xu1 , YOU Song1
(1.School of Pharmaceutical Engineering , Shenyang Pharmaceutical Universi ty , Shenyang 　110016 ,
China ;　2.Shenyang Zhongfang Pharmaceut ical Exploitation Co., Ltd., Shenyang　110032 , China)
Abstract:Objective To screen the microorganism w ith the ability to reduce(-)securinine.Methods The
screening w as carried out by TLC analysis , the concentrations of (-)securinine and its product w ere deter-
mined by RP-HPLC , the product w as isolated by the silica gel column chromatography and identified by
spectral data.Results and Conclusions Aspergi llus sp.D-1 is proved to have the ability to reduce γ, δ-dou-
ble bond of(-)securinine specifically into 14 ,15-dihydrosecurinine ,which is detected for the fi rst t ime.
Key words:(-)securinine;Aspergil lus;RP-HPLC;reduction reaction
176 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 23卷