全 文 ：第 29卷第 2期　　　　　 　　　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　 　　　　　Vol.29　No.2
2011年 6月　　　　　　　　JournalofHubeiUniversityforNationalities(NaturalScienceEdition)　　　　　　　　　Jun.2011
收稿日期:2011-04-01.
基金项目:湖南农业大学稳定人才基金项目(2009WD33).
作者简介:杨大伟(1968-),男 ,博士 ,副教授 ,主要从事植物源食品研究与开发.
碎米荠醇沉多糖的共沉淀物分离纯化
杨大伟 ,钟菊英
(湖南农业大学 食品科学技术学院 ,湖南 长沙 410128)
摘要:以碎米荠粗多糖液为试验材料 , 采用磷酸氢二钠将结合粗多糖的共沉淀物絮凝 ,用丙酮处理共沉淀物把
共沉淀物与多糖分离;然后用大孔树脂吸附层析(35×120mm)对共沉淀物进行分离纯化 , 层析条件是:一定浓度的
样品 40mL上柱 , 以流速 1.2mL/min进行动态吸附 , 再用浓度 30% ～ 80%的甲醇以流速 2.5mL/min通过树脂床进
行梯度洗脱;最后用琼脂糖 Sepharose6B(20×400mm)凝胶过滤层析将共沉淀物分离为两个组分 , 层析条件是:上
样量 3mL,蒸馏水洗脱 , 控制洗脱流速为 1.5mL/min.纯化的共沉淀物纯度为高效液相色谱纯.
关键词:碎米荠;多糖;磷酸氢二钠;丙酮;共沉淀物;大孔树脂;凝胶过滤
中图分类号:TS207.3;O657.72 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2011)02-0213-03
SeparationandPurificationoftheCo-precipitationfromthe
CardaminePolysaccharideSetledwithAlchol
YANGDa-wei, ZHONGJu-ying
(CollegeofFoodScienceandEngineering, HunanAgriculturalUniversity, Changsha410128, China)
Abstract:Thecrudepolysaccharidefromthecardaminebeingthetestmaterial, theco-precipitation
bindingwiththepolysaccharideisflocculatedwiththesodiumhydrogenphosphate, andtheco-precipi-
tationwilbeseparatedfromthepolysaccharidewiththeacetone.Thentheco-precipitationwilbepuri-
fiedwiththemacroporousresin, thechromatographicconditionis:the40mLsamplewithcertaindensity
isputintothecolumnforthedynamicadsorptionbyflowrate1.2 mL/min, andthesampleflowed
throughtheresinbed, elutedwiththe30% ～ 80% methylalcoholbyspeedofflow2.5 mL/min;finaly
theco-precipitationisseparatedintotwocomponentswiththegelfiltrationchromatography, andthe
chromatographicconditionis:3 mLsampleisputintothecolumn, andelutingwiththedistiledwater,
theelutionspeediscontroledtobe1.5 mL/min.Theco-precipitationpurityisthehighlyefectiveliq-
uidchromatography.
Keywords:Cardamine;polysaccharide;sodiumhydrogenphosphate;acetone;co-precipitation;
macroporousresin;gelfiltration
碎米荠是一种具有多种药用功能的十字花科植物[ 1] ,碎米荠多糖也拥有多种生理功能 [ 2] .在碎米荠多
糖分离纯化过程中 ,乙醇沉淀多糖时 ,一种未知有机物与多糖一起被沉淀(共沉淀物),这种共沉淀物必须与
结合的多糖有效分离 ,才能最大程度地将碎米荠多糖提取出来 ,增加多糖的得率.
1　材料与方法
1.1　材料
1)试验材料:碎米荠粗多糖溶液(实验室制取).
湖北民族学院学报(自然科学版) 第 29卷
2)主要试剂与药品:甲醇 ,苯酚 ,浓硫酸 ,丙酮 ,磷酸氢二钠 ,以上试剂均为分析纯.
3)主要仪器与设备:琼脂糖(sepharose)6B凝胶层析柱 ,大孔树脂(AB-8)吸附层析柱 ,高效液相色谱
仪(D10NEX美国),泵:P680 HPLCpump四元梯度泵 ,柱温箱:TCC-100,检测器:二极管陈列检测器 PDA-
100,冷冻离心机 , 723紫外 -可见分光光度计.
1.2　方法
1.2.1　碎米荠粗多糖与共沉淀物的分离方法　乙醇沉淀的碎米荠粗多糖经蒸馏水溶解后 ,向溶液中加入磷
酸氢二钠等无机盐将结合在多糖上的共沉淀物絮凝沉淀 ,离心后 ,收集沉淀 ,上清液加入磷酸氢二钠絮凝共
沉淀物 ,反复上述操作到上清液加入磷酸氢二钠无絮凝现象 ,保留上清液供后续多糖纯化使用 ,合并沉淀 ,将
沉淀用适量的蒸馏水溶解.向溶液中加入丙酮 ,由于共沉淀物是依靠氢键等弱作用力与多糖结合的 ,采用丙
酮等有机溶剂可将氢键等弱作用力破坏 ,从而实现多糖与共沉淀物的分离.丙酮沉淀的多糖与共沉淀物再用
蒸馏水溶解 ,溶液又用磷酸氢二钠絮凝沉淀 ,离心后 ,收集上清液 ,沉淀经蒸馏水溶解 ,如此反复将沉淀溶解 、
丙酮沉淀 、磷酸氢二钠絮凝 ,直到共沉淀物经硫酸 -苯酚法检测呈阴性为止 ,分别收集上清溶液和共沉淀物 ,
共沉淀物进一步纯化 ,上清液供后续多糖纯化使用.
1.2.2　共沉淀物的纯化方法　①将一定浓度的样品 40mL上大孔树脂柱 ,以流速 1.2mL/min进行动态吸
附 ,再用浓度梯度 30% ～ 80%的甲醇以流速 2.5mL/min通过树脂床进行洗脱 ,层析仪自动绘制洗脱曲
线 [ 3] .洗脱液备用供进一步用琼脂糖 sepharose6B凝胶层析对共沉淀物进行纯化;②用琼脂糖 sepharose6B
凝胶层析对共沉淀物进行纯化 ,方法是:以湿法在搅拌下将琼脂糖 sepharose6B凝胶加入到玻璃层析柱(20
×400mm)中 ,等凝胶沉降后再将水放出 ,用蒸馏水充分洗涤层析柱 ,备用.小心地将真空浓缩并透析后的共
沉淀物样品(3mL)滴加到层析柱中 ,让样品液过柱恰好与凝胶介质顶端平齐 ,再用适量的蒸馏水洗涤 ,让洗
涤液过柱恰好与凝胶介质顶端平齐 ,最后用蒸馏水洗脱 ,控制洗脱流速为 1.5mL/min,层析仪自动绘制洗脱
曲线.
1.2.3　共沉淀物的纯度鉴定方法　①在紫外区对共沉淀物溶液进行全波长扫描 ,确定其特征吸收波长;②
高效液相色谱法鉴定共沉淀物纯度 ,采用人工进样 ,双蒸馏水洗脱 ,柱温 30℃,流速 1.0 mL/min.
2　结果与分析
2.1　大孔树脂分离共沉淀物的结果
以洗脱时间为横坐标 ,洗脱
液中共沉淀物的光密度为纵坐
标 ,层析仪自动绘制洗脱曲线 ,如
图 1所示.用浓度 30% ～ 80%的
甲醇梯度洗脱时 ,得到一个共沉
淀物组分.
2.2　共沉淀物的琼脂糖(Sepha-
rose)6B凝胶层析结果
用琼脂糖(Sepharose)6B对
被大孔树脂纯化的共沉淀物进行
凝胶层析 ,结果如图 2所示.
从图 2的层析结果可以看
出 ,根据分子量的大小 ,碎米荠共
沉淀物包括两个组分 ,由于 Seph-
arose6B分离物质的分子量范围
在 104 ～ 4×106之间 [ 4] ,而且这
两个组分的洗脱时间也较快 ,所
以上述两个共沉淀物组分的分子
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第 2期 杨大伟等:碎米荠醇沉多糖的共沉淀物分离纯化
量在 104 ～ 4×106之间;第一个共沉淀物组分的洗脱量较低 ,后续的进一步纯化 ,尤其是制备工作的难度较
大 ,故没有做进一步分析 ,而是选择第二个共沉淀物组分做进一步的纯度鉴定.
2.3　碎米荠共沉淀物的纯度鉴定结果
1)共沉淀物检测波长的扫描结果 用紫外 -可见分光光度计对共沉淀物溶液进行扫描 ,扫描结果如图 3
所示.
从图 3可见 ,共沉淀物最大吸收波长在紫外区 ,可以进
一步高效液相色谱法鉴定碎米荠共沉淀物的纯度.
2)高效液相色谱法鉴定碎米荠共沉淀物的纯度时 ,选
择波长 280nm进行检测 ,检测结果如图 4所示.
高效液相色谱法鉴定结果表明 ,共沉淀物的纯度达到
色谱纯.
3讨论与小结
3.1　大孔树脂对共沉淀物的吸附特性
大孔树脂吸附层析是基于大孔吸附树脂对欲分离物质
的吸附作用和分子筛作用进行分离纯化的 [ 5] .从共沉淀物
的质谱碎片分子结构可知 ,共沉淀物具有酮基和羧酸酯等
极性基团 ,因而大孔树脂对共沉淀物表现出吸附性.
3.2　共沉淀物的浓度不同其大孔树脂柱层析条件会有所
变化
虽然本文对大孔树脂分离共沉淀物的层析行为特征和
条件进行了探讨 ,但实际研究中共沉淀物的浓度不同 ,大孔
树脂的柱层析行为会有所变化 ,尤其是其层析条件会发生
较大的变化 ,所以本文的大孔树脂柱层析条件是在特定的
共沉淀物浓度下得到的.尽管如此 ,本文的研究结果对大孔
树脂柱分离纯化共沉淀物仍有一定的参考作用.
综上所述 ,以碎米荠粗多糖液为试验材料 ,用磷酸氢二钠和丙酮反复处理共沉淀物把共沉淀物与多糖分
离;然后用大孔树脂吸附层析对共沉淀物进行纯化 ,层析条件是:一定浓度的样品 40mL上柱 ,以流速 1.2
mL/min进行动态吸附 ,再用浓度 30% ～ 80%的甲醇以流速 2.5mL/min通过树脂床进行梯度洗脱;最后用琼
脂糖 Sepharose6B(20×400mm)凝胶过滤层析将共沉淀物分离为两个组分 ,层析条件是:上样量 3mL,蒸馏
水洗脱 ,控制洗脱流速为 1.5mL/min.纯化的共沉淀物纯度为高效液相色谱纯.
参考文献:
[ 1] 　刘合刚 ,费新贵 ,陈林.华中碎米荠的生物药学研究 [ J].时珍国药研究 , 1993, 5(3):14-15.
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[ 5] 　汪茂田 ,谢培山 ,王忠东 ,等.天然有机化合物提取分离榆结构鉴定 [ M] .北京:化学工业出版社 , 2004:100-101.
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