全 文 ：收稿日期:2003-05-08
基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(G1998051113);国家杰出青年科学基金项目(39825126)
作者简介:杜玉虹(1975-),女(汉), 河北石家庄人 , 硕士研究生 , 从事天然产物活性成分研究 , E-mail:ldyh@hot-
mail.com;崔承彬(1956-), 男(朝鲜族), 教授 , 博士生导师 , 主要从事活性天然产物的研究 , Tel:(022)
83712588 , E-mail:cuicb@sohu.com。
文章编号:1005-0108(2003)06-0320-04
方榄抗癌活性成分的研究———酚酸类细胞周期抑制剂
杜玉虹1 , 2 ,崔承彬1 , 3 ,李文欣1 , 2 ,蔡 兵1 ,韩 冰1 ,姚新生2 , 4
(1.天津生物医药研究所 ,天津 300384;2.沈阳药科大学中药学院 ,辽宁 沈阳 110016;
3.中国海洋大学药物所 , 山东 青岛 266003;4.深圳中药及天然药物研究中心 ,广东 深圳 518057)
摘　要:目的 阐明中国民间用于癌症治疗的中草药方榄的抗癌活性成分。方法 以细胞周期抑制
活性为抗癌指标 ,采用硅胶 、Sephadex LH-20、ODS 等柱色谱和流式细胞术 ,跟踪分离活性成分 ,
利用谱学手段鉴定化学结构。结果与结论 从方榄茎皮中分离鉴定了 5 个具有细胞周期抑制活性
的酚酸类化合物:没食子酸(1)、没食子酸乙酯(2)、没食子酸甲酯(3)、鞣花酸(4)和 1 , 2 , 3 , 4 , 6-五
没食子酰基-β-D 葡萄糖(5)。这些化合物抑制 tsFT210 细胞周期的 MIC 值为 73.5 μmo l/ L(1)、
15.2 μmol/ L(2)、16.3 μmol/ L(3)、20.7μmol/ L(4)、6.6 μmol/ L(5),其中 1 和 3 为新细胞周期抑制
剂。化合物 1～ 5 均为首次从方榄中得到 , 化合物 2、3、5 系首次从该属植物中分离得到。
关键词:药物化学;分离;鉴定;色谱分离;方榄;细胞周期抑制;酚酸类
中图分类号:R284.2　　　文献标识码:A
　　方榄(Canarium bengalense Roxb.)为橄榄科
橄榄属植物[ 1] ,其茎皮在我国部分地区民间用于
治疗癌症 ,迄今尚未见有关其化学成分和药理活
性的研究报道。在利用 t sFT210细胞的流式细胞
术筛选模型筛选上千种中草药相关活性的过程
中[ 2 ,3] ,发现方榄提取物具有很强的细胞周期抑
制活性。细胞周期周转是细胞增殖必需的生物过
程 ,从细胞水平上癌症可看作是细胞周期的调控
过程发生了紊乱 ,使癌化细胞无限制地盲目增殖
的状态 。因此 ,新细胞周期抑制剂有可能开发成
抗癌新药 ,同时细胞周期抑制活性可作为生物指
标用于抗癌药物筛选。鉴于此 ,本文作者以细胞
周期抑制活性为指标对方榄的抗癌活性成分进行
了研究。
该实验研究采用跟踪活性进行分离的研究模
式 ,从方榄茎皮中分离得到 5个细胞周期抑制活
性成分 ,并根据理化性质和光谱数据分别鉴定为
没食子酸(1)、没食子酸乙酯(2)、没食子酸甲酯
(3)、鞣花酸(4)及 1 , 2 , 3 ,4 ,6-五没食子酰基-β-D
葡萄糖(5)。这些化合物虽然都是已知化合物 ,但
均系首次从该植物中分离得到 ,也是方榄抗癌活
性成分的首次报道。其中化合物 1和 3为新细胞
周期抑制剂 ,化合物 2 、3 、5系首次从该属植物中
分离得到 。
Fig.1　The chemical structures of 1～ 5
1　实验部分
熔点用 XT4型双目体视显微熔点测试仪测
定 ,温度未校正 。质谱用 Esquire LC 型质谱仪测
定。紫外光谱用 Shinadzu UV2501PC 型紫外分
光光度计测定 。核磁共振谱用 JEOL Eclips-600
第 13 卷　第 6 期
2003 年12月　总56 期
中 国 药 物 化 学 杂 志
Chinese Journal o f Medicinal Chemistry
Vol.13　No.6　p.320
Dec.2003 Sum 56
DOI :10.14142/j.cnki.cn21-1313/r.2003.06.003
型超导核磁共振仪测定。
薄层色谱采用青岛海洋化工集团公司产硅胶
G 薄层板(20 cm ×20 cm×0.25 mm)、自制薄层
硅胶GF254(青岛海洋化工集团公司)板(2.5 cm×
7.5 cm)、Merk 公司产反相硅胶 RP -18薄层板
(20 cm×20 cm ×0.25 mm)、浙江市路桥四青生
化材料厂产薄层色谱用聚酰胺-6薄膜 。薄层斑
点采用紫外线(254 nm 或 360 nm)照射 , 4%(φ)
FeCl3 乙醇溶液喷洒和 10%(φ)H2SO4 溶液喷洒
加热检测。柱色谱和减压柱色谱分别采用硅胶 G
和60H(青岛海洋化工集团公司)、Sephadex LH-
20(Pharmacia)、反相硅胶 ODS-SS -1020(SSC
Senshu Scientific Co., Ltd.)等填料 。
胎牛血 清 (FBS)为 Hyclone 公司 产品
(Cat.No.STF721)。RPM I-1640细胞培养基为
GIBCO 公司产品。碘化丙啶 Propidium Iodide
(PI)和 Nonidet P -40分别为 Sigma 和 Fluka公
司产品 。流式细胞术采用 EPICS®　XL 型流式细
胞仪(Coulter Co.,Hialeah , FL ,U.S.A.)。
1.1　提取分离与有效部位的确定
取方榄茎皮干燥粉末 3.1 kg ,用质量分数
95%的乙醇室温浸提 5次 ,浸提液减压浓缩 ,得粗
提浸膏 400 g 。该浸膏在 100 μg/mL 的浓度下对
tsFT210细胞显示了很强的 G0/G1期抑制活性。
因此 ,此后的全部分离纯化过程均以 G0/G1 期抑
制活性为向导 ,跟踪活性进行了相关分离操作。
粗提浸膏 400 g 悬浮于 2000 mL 蒸馏水中 ,先后
分别以等体积的氯仿 、乙酸乙酯及正丁醇萃取 ,得
到了具有 G0/G1 期抑制活性的乙酸乙酯萃取物
123.6 g 。该萃取物在20μg/mL 的浓度下显示了
较强的G0/G1期抑制活性 ,而其它部分未见有明
显的细胞周期抑制活性。
取乙酸乙酯萃取物 103.6 g ,用甲醇溶提 ,得
到甲醇溶提物 101.4 g 和甲醇不溶物 3.2 g 。将
甲醇溶提物 101.4 g 混悬于水中 ,超声后离心 ,分
为水不溶部分 20.9 g 和水溶部分 80.5 g 。其中 ,
水溶部分显示了较强的 G0/G1期抑制活性 ,为方
榄提取物 G0/G1期抑制活性的有效部位。
1.2　活性测试
小鼠乳腺癌温敏型 tsFT210细胞用含 10%
(φ)FBS 的 RPM I -1640培养基 , 在 32℃、通入
5%二氧化碳的培养箱中继代培养 。
取对数生长期的 tsFT210细胞 ,用新鲜 RPMI
-1640培养基配制成细胞密度为 2×105 个/mL
的细胞悬液 ,接种于 24孔板中 ,每孔 0.5 mL 。各
孔细胞中加入各种浓度的样品液 5 μL ,并将细胞
在培养箱中培养17 h 。药物处理后的细胞直接于
倒置显微镜下观察细胞形态学变化 ,遂经 PI 染色
后通过流式细胞仪测定细胞中 DNA 的含量分
布[ 2 ,3] 。用倍比稀释法测定单体化合物在各种剂
量下的抑制活性 ,从而得到最小抑制浓度(M IC)。
细胞周期各时相中细胞的分布情况采用库尔特公
司的WinCycle软件进行分析 。
2　结果
2.1　活性成分的跟踪分离和纯化精制
取方榄提取物的有效部位 80.5 g ,用适量水
溶解 ,上 Sephadex LH-20柱 ,用水-甲醇溶剂系
统洗脱 ,得到组分 Ⅰ(H2O 洗脱部分 , 2 g)、Ⅱ(体
积分数为 30%的 MeOH 洗脱部分 , 6 g)、Ⅲ(体积
分数为 50%的 MeOH 洗脱部分 , 12.1 g)及 Ⅳ
(MeOH 洗脱部分 , 60.4 g)。
组分 Ⅰ(2 g)经硅胶减压柱色谱分离 ,以氯仿
-甲醇(V∶V =99∶1※90∶10)为溶剂系统进行梯
度洗脱 ,得到 20个洗脱流份。将流份 9(氯仿-甲
醇 , V∶V =98∶2洗脱部分 ,70 mg)、流份 15(氯仿
-甲醇 , V∶V =95∶5洗脱部分 , 90 mg)和流份 19
(氯仿-甲醇 , V∶V=90∶10洗脱部分 , 500 mg)分
别以氯仿-甲醇重结晶依次得到化合物 2(55.3
mg)、化合物 3(55.7 mg)和化合物 1(354.4 mg)。
组分Ⅳ(60.4 g)经反复 ODS 柱色谱分离 ,用
甲醇-水(V∶V =38∶62)洗脱 ,先后得到化合物 4
(87.1 mg)和化合物 5(1.2 g)。
2.2　结构鉴定
化合物 1:无色针晶(甲醇), mp 255 ～ 256℃,
对FeCl3 试剂显深蓝色 ,提示有酚羟基 。其 UV
(MeOH)光谱在 216 nm(logε=4.38)和 268 nm
(logε=3.89)处有最大吸收。负离子 ESI-MS 在
m/ z 169处给出伪分子[ M -H] -离子峰 ,与其
分子式 C7H 6O5 相符。 1H-NMR(CD3OD)只给出
一个孤立的芳氢信号 δ7.04(2H , s),而13C-NMR
(CD3OD)中检测到 δ170.40 , 146.36(2C),
139.56 ,121.95 , 110.28(2C)等信号。上述数据
与没食子酸[ 4]相符 ,故经与没食子酸对照品直接
进行比较 ,将化合物 1鉴定为没食子酸[ 4] 。
化合物 2:无色针晶(甲醇), mp 151 ～ 154℃,
对 FeCl3试剂显深蓝色 ,色泽与化合物 1相同 ,提
示分子中具有三连酚羟基。负离子 ESI-MS 中
321第 6期 杜玉虹等:方榄抗癌活性成分的研究———酚酸类细胞周期抑制剂
m/ z 197处的伪分子[ M -H] -离子峰与其分子
式C9H10O5 相符 ,其分子式比化合物 1 多 C2H4 。
与此相应 , 1H-NMR(CD3OD)给出 δ1.33(3H ,
t , —CH3 , J =7.0 Hz), 4.26(2H , q , O—CH2 —
CH3 , J =7.0 Hz), 7.04(2H , s)等信号 ,与化合物
1相比 ,多了一组乙氧基(OCH2CH3)氢的信号。
与此相应 , 13 C-NMR(CD3OD)给出 δ168.54 ,
146.44(2C), 139.66 , 121.73 , 109.96(2C), 61.7
等信号 ,与化合物 1相比 ,也多了一组乙氧基碳的
信号 。故化合物 2鉴定为没食子酸乙酯[ 4] 。
化合物 3:无色针晶(甲醇), mp 201 ～ 203℃,
与化合物 1和 2相似 ,对 FeCl3 试剂显深蓝色 ,提
示有三连酚羟基 。根据负离子 ESI-MS 给出的伪
分子离子峰 m/ z 183[ M -H] - ,确定分子式为
C8H8O5 ,其分子组成比化合物 1 多 CH2 ,比化合
物 2少CH2 。1H-NMR(CD3OD)给出一个甲氧基
峰 δ3.80(s , 3H)和相当于两个芳氢的孤立单峰
δ7.04(s , 2H)。 13C-NMR(CD3OD)也给出一个
甲氧基碳信号 δ49.28 ,并给出 δ168.99 ,146.48
(2C),139.73 , 121.41 ,110.00(2C)等没食子酰基
碳信号。由以上数据 ,化合物 3 鉴定为没食子酸
甲酯 。
化合物 4:淡黄色细小针晶(甲醇), mp 357 ～
358℃,对 FeCl3 试剂显蓝色 ,提示有酚羟基 。UV
(MeOH)光谱在 255 nm(logε=4.69)和 360 nm
(logε=4.04)处有最大吸收 ,与鞣花酸 UV 光谱
数据[ 3]相同。化合物 4 与鞣花酸[ 3]对照品 Rf值
一致 ,混合熔点不下降 ,故鉴定为鞣花酸 。
化合物 5:淡棕色无定型粉末(甲醇),分解点
202 ～ 204℃,对 FeCl3 试剂显深蓝色 ,其颜色与化
合物 1 , 2 , 3 相同 , 提示有三连酚羟基。负离子
ESI-MS在 m / z 939[ M-H] -处 、而正离子 ESI-
MS在 m/ z 963[ M +Na] +处给出伪分子离子
峰 , 故确 定分子 式为 C41 H32 O26 。 1H-NMR
(CD3OD)中 δ7.11 , 7.05 , 6.97 , 6.95 , 6.89(each
s , 2H)的信号提示分子中可能存在 5个没食子酰
基[ 3] ,而高场区信号 δ6.23(d , J =8.4 Hz ,H-1),
5.90(t , J =9.6 Hz ,H-3), 5.62(t , J =9.6 Hz , H-
4),5.58(dd , J =9.6 ,8.4 Hz ,H-2), 4.51(br d , J
=12.5 Hz , H-6), 4.41(m , H-5), 4.37(dd , J =
12.5 ,4.4 Hz ,H-6)表明分子中还有一个吡喃葡萄
糖残基 ,且其端基碳为 β 构型(J 1 , 2 =8.4 Hz)。
与此 相应 , 13 C-NMR(CD3OD)中 观测到 δ
167.91 , 167.27 , 166.99 , 166.89 , 166.20(five es-
ter carbony l), 146.52 , 146.43 , 146.40 , 146.34 ,
146.25(f ive C-3′, 5′), 140.79 , 140.37 , 140.32 ,
140.13 , 140.01 (five C-4′), 120.98 , 120.28 ,
120.16 , 120.12 , 119.63 (f ive C-1′), 110.42 ,
110.37 ,110.34 , 110.33 , 110.30(f ive C-2′, 6′)等
5个没食子酰基碳信号和一组糖基碳信号 δ
93.78(C-1), 74.37(C-5), 74.07(C-3), 72.15(C-
2),69.75(C-4), 63.08(C-6)。上述数据与文献[ 3]
中 1 ,2 ,3 ,4 , 6-五没食子酰基-β-D 葡萄糖的有关
数据基本一致 ,经与对照品[ 3]直接进行比较 ,将
该化合物鉴定为 1 , 2 , 3 , 4 , 6-五没食子酰基-β-D
葡萄糖。
2.3　单体化合物的生物活性
为了考察化合物 1 ～ 5对细胞周期抑制作用
的特点和强弱 ,通过倍比稀释法 ,测定了 1 ～ 5在
不同浓度下对 tsFT210细胞的影响 ,结果表明 1
～ 5 均能有效地抑制 t sFT210细胞的细胞周期。
其中 ,化合物 1将 t sFT210 细胞的细胞周期抑制
在G2/M 期 ,而化合物 2 ～ 5则将 t sFT210细胞抑
制在G0/G1期 。这些化合物抑制 t sFT210细胞
细胞周期的最低抑制浓度(MIC)值分别为 73.5
μmol/L(1)、15.2 μmol/L(2)、16.3 μmol/L(3)、
20.7 μmol/L(4)、6.6μmol/L(5)。
3　讨论
化合物 1 ～ 5在 tsFT210细胞活性筛选模型
中表现出强度和作用各异的细胞周期抑制活性。
化合物 1显示了G2/M 期抑制活性 ,化合物 2 ～ 5
表现出很强的 G0/G1 期抑制活性 ,而且化合物 5
在方榄中含量很高 ,表明化合物 2 ～ 5的活性代表
了方榄总浸膏的G0/G1期抑制活性。
另一方面 ,方榄总浸膏在初筛活性时只显示
出G0/G1期抑制活性 ,但化合物 1却是在跟踪分
离G0/G1 抑制活性成分的过程中分到的具有
G2/M 期抑制活性的化合物 。该化合物的活性虽
然不代表总浸膏在 100 μg/mL 浓度下检测到的
G0/G1期抑制活性 ,但也是对细胞周期的抑制活
性 ,因此被同一筛选模型检测并分离得到 。这一
结果提示 ,在利用活性筛选模型对具有相关活性
的总浸膏进行活性跟踪分离时 ,随着分离工作的
深入 ,活性较弱或含量少而不能代表总浸膏活性
的一些活性成分也会被分离得到。
上述研究结果首次为方榄在我国民间用于治
322 中 国 药 物 化 学 杂 志 第 13 卷
疗癌症的民间用法提供了部分科学依据。另外 ,
化合物 1与化合物 2 、3 相比 , 1只是 2或 3酯的
水解产物 ,但生物活性却截然不同 ,其作用差别及
其原因有待深入探讨。此外 ,方榄有效部位中其
他活性成分尚待进一步分离 ,有关研究工作目前
正在进行中。
致谢:日本理化学研究所长田裕之博士提供
tsFT210细胞 。方榄植物材料由沈阳药科大学孙
启时教授采集并鉴定 。
参考文献:
[ 1] 　中国植物志编辑委员会.中国植物志.第 43 卷[ M ] .
北京:科学出版社 , 1985.359.
[ 2] 　Cui CB , Yan SY , Cai B , et al.Carbazole alkaloids as
new cell cycle inhibitors and apoptosis inducers from
Clausena Dunniana Lev l[ J] .J Asian Nat Prod Res ,
2002 , 4(4):233-241.
[ 3] 　Cui CB , Zhao QC , Cai B , et al.Two new and four known
polyphenolics obtained as new cell-cycle inhibitors from
Rubus aleaefolius Poir[ J] .J Asian Nat Prod Res , 2002 , 4
(4):243-252.
[ 4] 　马广恩 ,申雅维 ,鲁学照.栾树抗菌有效成分的研究
[ J] .中草药 , 1998 , 29(2):84-85.
Studies on the anticancer constituents of Canarium
bengalense Roxb.———polyphenolic cell cycle inhibitors
DU Yu-hong1 , 2 ,CUI Cheng-bin1 , 3 , LI Wen-xin1 , 2 , CAI Bing1 ,HAN Bing1 ,YAO Xin-sheng2 , 4
(1.Tianj in Inst itute for Biomedicinal Research(TIBiR), Tianj in 300384 , China;2.The School of
Tradi tional Chinese Materia Medica , Shenyang Pharmaceut ical University , Shenyang 110016 , China;
3.Marine Drug and Food Inst itute , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China;
4.Tradit ional Chinese Medicines & Natural Products Research Center Shenzhen , 518057 , China)
Abstract:Aim To explore the anticancer components of Canarium bengalense Roxb., a Chinese folk
medicine used for the treatment of cancers.Methods The separation procedure w as guided by a bioassay us-
ing tsFT210 cells to examine cell cycle inhibitory activi ty , and various column chromatog raphy over
Sephadex LH-20 , silica gel ,ODS and poly amide w ere employed for the isolat ion and purif icat ion of the cell
cycle inhibitory constituents.The chemical structures of the pure compounds obtained w ere investigated by
the spect roscopic methods.Results Five polyphenolics , gallic acid(1), ethyl gallate(2), gallincin(3), ellag ic
acid(4)and 1 ,2 , 3 ,4 , 6-penta-O-galloy l-β-D-g lucopyranose(5)were isolated and identified f rom Canarium
bengalense Roxb.for the first time.Compound 1 inhibi ted the cell cycle progression of tsFT210 cells at the
G2/M phase w ith the M IC value of 73.5 μmol/L , while 2 ～ 5 inhibited the cell cy cle at the G0/G1 phase
w ith the MIC values of 15.2 μmol/L fo r 2 ,16.3μmol/L for 3 , 20.7 μmol/ L fo r 4 and 6.6μmol/L for 5.
Conclusion Compounds 1 ～ 5 were isolated f rom Canarium bengalense Roxb.for the first time and 2 ,3 and
5 were isolated f rom the genus Canarium fo r the f irst t ime.All of the 1 ～ 5 inhibited mammalian cell cycle
and 1 and 3 are new cell cycle inhibitors..
Key words:medicinal chemist ry ;isolation;identification;chromatographic isolation;Canarium bengalense;
cell cy cle inhibitor;polyphenol
323第 6期 杜玉虹等:方榄抗癌活性成分的研究———酚酸类细胞周期抑制剂