全 文 ：红树植物海漆 ISSR条件的优化
张志红1 , 谈凤笑1 , 何航航1 , 吴令辉1 , 钟才荣2 , 施苏华1
(1.中山大学生命科学学院 , 广东 广州 510275;
2.东寨港国家级自然保护区 , 海南 海口 571129)
摘　要:在利用 ISSR分析对海漆 Excoecaria agallocha 的遗传多样性进行了研究。为获得清晰 、 重复性的 ISSR扩
增结果 , 对影响 ISSR_PCR的多个因素 , 包括 DNA 的提取 、 模板浓度 、 TAQ酶的选择与用量 、 Mg2+和 dNTP浓度
等进行了比较 、 优化 , 确定了海漆 ISSR_PCR分析最适宜的扩增条件:10μL PCR反应体积中 , 1×Taq 酶配套缓冲
液 (10 mmol L Tris·HCl , pH 9.0 , 50 mmol L KCl , 0.1%Triton X-100), 0.6 ～ 0.7 U Taq DNA 聚合酶 (上海申能博彩
生物科技有限公司), 0.2 μmol L引物 , 0.2 mmol L dNTP , 1.5～ 2.0 mmol LMgCl2 , 10 ng 模板 DNA。
关键词:海漆 Excoecaria agallocha;ISSR;优化;红树植物
中图分类号:Q503;Q946_33　　文献标识码:A　　文章编号:0529-6579 (2004)02-0063-04
　 　 海 漆 Excoecaria agallocha 隶 属 大 戟 科
Euphorbiaceae 海漆属 Excoecaria , 是重要的红树林
树种 , 传统的药用植物 , 其叶和茎可提取抗 HIV
的活性物质[ 1] 。研究其分子水平的遗传变异 , 将为
红树林生态系统的重建和发展 , 生物多样性保护及
红树林资源的可持续利用提供重要的理论依据。简
单重复序列区间扩增多态 DNA (ISSR)分析是建立
在PCR反应基础上的一种新的分子生物学技术 ,
由 Zietkiewicz[ 2] 等于 1994 创建 , 它结合了 SSR 和
RAPD的优点 , 具有 RAPD操作简单 , 所需 DNA 量
少 , 不需预知研究对象的基因组序列等优点 , 并具
有SSR的稳定性[ 3] 。因此 , ISSR近年来已迅速应
用于品种鉴定 、 种质资源和遗传多样性的研究 , 并
作为构建遗传图谱的工具[ 4, 5] 。
ISSR技术虽然原理简单 , 但随着 PCR条件的
变化 , 会出现不同的扩增结果 , 影响其扩增的主要
因子有:DNA 的模板浓度 、 Tag 酶的选择和含量 、
Mg
2+和dNTP浓度。本研究详尽探讨了 ISSR实验的
优化条件 , 建立了重复性好 、 结果清晰而稳定的海
漆 ISSR实验参数 , 为深入研究红树植物海漆种群
的遗传变异和规律奠定了良好的基础。
1　材料与方法
1.1　材　料
海漆样品采集于日本冲绳岛 、 中国沿海 、泰国
和新加坡。叶片置于变色硅胶中干燥保存 。合计
23个居群 , 420个个体 。
1.2　实验仪器与药品
FastPrep 植物组织破碎仪 (FastPrep® FP220 ,
美国Qbiogen);Hoefer DyNA Quant 200荧光仪;PCR
扩增仪 (Biometra pc_48 , 德国);DF_D型恒压恒流
电泳仪 (北京东方仪器公司), DYY_Ⅲ型水平电泳
槽 (北京六一仪器厂), 凝胶分析系统;100 个
ISSR 引物购自加拿大大不列颠哥伦比亚大学
(University of British Columbia , Set No.9 , No.801 ～
900);100 bp DNA Ladder Plus购自 MBI Fermentas;
Taq polymerase 选用上海申能博彩生物科技有限公
司产品;dNTP 购自上海生工生物工程有限公司 。
1.3　DNA的提取及检测
采用改进后的 CTAB微量 Fastprep 法 , 提取总
DNA 。该法与过去的 CTAB[ 9] 法的不同之处在于不
需要用液氮研磨植物叶片 , 而采用 Fastprep 植物组
织破碎仪代替手工操作 , 仅需要极微量的植物叶片
或组织。在 Fastprep 仪上震荡 45 s , 仪器参数为
Speed 6。所获总 DNA 以 Hoefer (DyNA Quant200)
荧光仪和紫外分光光度计定量检测其浓度 。以 w=
1.2%琼脂糖凝胶电泳 (0.5×TBE)检测所提取
DNA的质量。根据基因组 DNA 浓度值将样品稀释
至 20 ng μL用于 ISSR分析 。
1.4　ISSR反应
聚合酶链式反应 (PCR)扩增体系:10 μL PCR
收稿日期:2003-05-20
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30070053 , 30230030);广东省自然科学基金资助项目 (001223);教育部博
士点基金资助项目 (20010558013)
作者简介:张志红 (1967年生), 女 , 博士生;通讯联系人:施苏华;E_mail:lssssh@zsu.edu.cn
　第 43 卷　第 2 期
2004年　3 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM　UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
Vol.43　No.2
Mar.　2004 　
反应体积中 , 0.6 ～ 0.7 U Taq DNA 聚合酶 , 0.2
μmol L 引物 , 0.2 mmol L dNTPs , 1.5 ～ 2.0 mmol L
MgCl2 , 10 ng 模板 DNA 。PCR反应条件为:94 ℃5
min , 1循环;94 ℃ 45 s※52 ～ 55 ℃ 45 s※72 ℃
1.5 min , 38循环;72 ℃7min;12 ℃30min 。PCR
扩增产物以 w=1.5%的琼脂糖凝胶电泳 (0.5×
TBE)分离 , EB染色 , 自动凝胶成像仪观察拍照。
2　结果与讨论
2.1　DNA提取
本实验提取的 DNA 呈白色或无色絮状沉淀 ,
电泳显示 DNA完整 , 无明显降解 (见图 1)。用紫
外分光光度计测定 DNA在 260 nm和 280 nm 的光吸
收比值 (A260 A280)为 1.90 ～ 1.95。结果显示改进
后的CTAB微量 Fastprep 法是一种简单快速 、 效率
高的基因组DNA提取方法 。
所提取的海漆总 DNA经浓度测定后用于 ISSR
扩增 。通过反复实验和对比不同条件和比例的
ISSR_PCR反应体系 , 从100个引物中共筛选出扩增
条带清晰 、 重复性好的 10个引物作为正式扩增的
引物。结果表明优化后的 PCR反应体系中海漆 23
个居群 、 420个个体均可扩增出明显条带。图 2为
J39号 DNA样品经 ISSR引物 811 、 814 、 835 、 844 、
848 、 856 、 857 、 864 、 868 、 880 扩增出多态性条
带。
DNA质量的好坏直接关系到后续工作的成功
与否。有关植物 DNA 提取方法繁多 , 目前应用最
广的是Doyle et al.1987年提出的 CTAB 法[ 9] 。我们
采用改进后的 CTAB微量 Fastprep法 , 剔除了传统
的液氮冷冻条件下人工研磨破碎植物材料 , 在室温
下以 Fastprep植物组织破碎仪机械研磨 , 一个人一
小时可粉碎近 80 个样品 , 大大提高了工作效率 ,
同时得率高 , 只需微量样品 (20 ～ 30 mg)即可获
得40 ～ 60μg 的总DNA , 满足 600 ～ 900次的 PCR扩
增 , 是一种省时省力的植物总 DNA提取方法 。同
时利用机械研磨 , 避免了人工研磨样品破碎程度不
同 , DNA产率不一致的问题 , 后者会导致 PCR反
应是需要逐个调模板质量浓度的烦琐操作 , 这一改
进使 ISSR技术的规模化 、 标准化快速分析成为可
能。在此改进的提取方法中 , 用硅胶干燥的叶片和
组织比用新鲜叶片提取操作更易 , 因此更适合于异
地采集和硅胶干燥样品的保存和提取。
2.2　模板质量浓度
模板质量浓度是影响 ISSR_PCR扩增的最重要
因素之一。本研究对比了 8种不同的模板质量浓
度 , 即用于PCR反应的模板 DNA质量浓度分别为
图 1　日本居群部分个体的总 DNA (稀释 40 倍)
Fig.1　Total DNA of some samples from japan (×40)
图 2　引物 811 、 814 、 835 、 844、 848、 856、 857、 864 、
868 、 880 扩增 J39号样品基因组 DNA结果
Fig.2　Amplification of genomic DNA of
sample J39 with primers811、 814 、 835 、
844 、 856 、 857、 864、 868、 880
2.5 、 5 、 10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60 ng μL。图 3显示
了不同模板质量浓度以引物 811扩增的 ISSR结果。
从图中看出 , 模板 DNA的量对 ISSR结果有显著影
响 , 模板 DNA 的质量浓度为 2.5 ng μL 时无扩增 ,
在 5 ～ 50 ng μL时均扩增出基本相同的带型 , 60 ng
μL扩增的 ISSR谱带反而减少 。余艳等[ 6] 利用 ISSR
研究沙冬青遗传多样性的结果与我们的结果相似。
在检测海漆遗传多样性研究中 , 我们采用的 DNA
模板质量浓度为 10 ng μL。
2.3　Taq酶
在 ISSR_PCR反应体系中 , TaqDNA聚合酶直接
影响扩增反应的成功与否。实验表明 , 当其他反应
条件一致时 , 对同一样品使用不同厂家的 Taq酶 ,
PCR扩增的条带数目明显不同。如图 4 , 我们采用
加拿大真达公司生产的 Taq 酶和本实验室自制的
Taq酶分别对样品 BHCL08 、 BHCL09进行 ISSR_PCR
扩增 , 结果表明 , 本实验室自制的 Taq酶扩增的片
段数目多于加拿大真达公司生产的 Taq酶。说明不
同厂家从不同菌株上分离的 TaqDNA聚合酶可能在
性能上有些差异 , 从而导致扩增结果的不同。因
此 , 在实验过程中 , 要尽量使用同一厂家同一批次
64 中山大学学报 (自然科学版) 第 43 卷　
图 3　不同模板 DNA质量浓度 ISSR扩增结果
Fig.3　the results of ISSR amplification using
different concentration template DNA
1-8:PCR反应的模板 DNA质量浓度分别为
2.5 , 5 , 10 , 20 , 30 , 40 , 50 , 60 ng μL
M:100 bp ladder plus DNA marker
的TaqDNA聚合酶 。陈永久等[ 7] 在对懒猴和冬虫夏
草 RAPD_PCR研究中也报道了相似的结果 。我们对
比设置了 0.25 、 0.5 、 0.75 、 1.0 U Taq 酶含量梯
度。结果表明 , 0.25 U 酶量过低 , 产物的合成效
率下降 , 无扩增产物出现;0.5 ～ 0.75 U 可以得到
重复的清晰条带 , 无非特异性扩增;1.0 U酶量过
大 , 虽也能得到扩增产物 , 但出现非特异性扩增 ,
同时扩增产物主带相连 , 模糊难以辨认 。因此 , 在
海漆 ISSR_PCR实验中 , Taq 酶 (上海申能博彩生
物科技有限公司)的使用量为 0.5 ～ 0.6 U最佳 。
2.4　Mg2+和 dNTP浓度
Mg
2+浓度是 ISSR_PCR的一个主要变化因素 。
作为 Taq酶的辅助因子 , Mg2+浓度不仅影响 Taq酶
活性 , 还能与反应液中的 dNTP 、模板 DNA及引物
结合 , 影响引物与模板的结合效率 、 模板与 PCR
产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的
形成[ 8] 。本试验对所采用的每个引物设置了 Mg2+
浓度梯度比较 , 即 1.0 , 1.5 , 2.0 , 2.5 , 3.0 mmol
L (表 1)。结果表明 , 不同的引物对反应系统中的
Mg
2+浓度要求不同;在 ISSR_PCR反应液中 ,
图 4　不同厂家 TaqDNA聚合酶对
ISSR扩增的影响 (引物 809)
Fig.4　The ISSR results using different TaqDNA polymerase
1-3 为加拿大真达公司产物
(1 为样品 BHCL08 , 2为样品 BHCL09 , 3 为负对照);
4-6 为本实验室自制的产物
(4 为样品 BHCL08 , 5为样品 BHCL09 , 6 为负对照);
M:相对分子质量标准
Mg
2+浓度为 1.0 mmol L 时 , 无扩增产物出现;浓
度 1.5 ～ 2.0 mmol L 能得到清晰稳定的条带 , 且无
非特异性扩增;浓度 2.5 , 3.0 mmol L 虽也能得到
扩增条带 , 但条带变少 , 且具有非特异性扩增 。因
此 , Mg2+浓度我们采用 1.5或 2.0 mmol L , 视具体
引物而定。这与在一般的 PCR反应中 , 1.5 ～ 2.0
mmol L Mg2+较合适[ 9] 是一致的 。
　　dNTP 是 ISSR_PCR反应的原料 。为了确定最适
dNTP 的加入量 , 我们对比设置了 0.12 、 0.16 、
0.20 mmol L 浓度梯度 (Mg2+浓度设定为 2.0 mmol
L)。结果表明 , dNTP 浓度 0.20 mmol L能得到背景
清晰的条带 , 且无非特异性扩增;0.16 mmol L 虽
也无非特异性扩增 , 但所得产物背景模糊 , 条带辨
认比较困难;0.12 mmol L 除所得产物背景模糊外 ,
同时也有非特异性扩增 。对这一现象我们认为是因
为 dNTP 浓度低 , 结合 Mg2+的量少 , 导致游离
Mg
2+的浓度增加 , 从而出现非特异性扩增。因此 ,
选择 dNTP 的浓度为 0.20 mmol L。
表 1　Mg2+浓度对 ISSR_PCR结果的影响1)
Tab.1　The ISSR results of different Mg2+concentration
引物 1.0 mmol L
J39 Nega
1.5 mmol L
J39 Nega
2.0 mmol L
J39 Nega
2.5 mmol L
J39 Nega
3.0 mmol L
J39 Nega
811 - - ++ - ++ - ++ + - + +
857 - - ++ - ++ + ++ + + +
880 - - ++ - ++ - ++ + - + +
1)J39:DNA模板;Nega:阴性对照 (没加模板);++:表示扩增效率高;+:表示有扩增产物;+ -:表示扩增产物不
稳定;-:表示无扩增产物
65　第 2 期 张志红等:红树植物海漆 ISSR条件的优化
3　结　论
综上所述 , 影响 ISSR结果的因素很多 , 为了
利用这一分子标记进行遗传多样性分析 , 获得重复
性和可靠性较高的 ISSR带谱 , 提高分析的准确性 ,
我们有必要对其影响因子进行优化 , 筛选出最适宜
的 ISSR条件 。红树植物海漆 ISSR_PCR分析较适宜
的扩增条件是:10 μL PCR反应体积中 , 1×Taq 酶
配套缓冲液 (10 mmol L Tris·HCl , pH 9.0 , 50 mmol
L KCl , 0.1%Triton X_100), 0.6 ～ 0.7U Taq DNA 聚
合酶 (威佳科技有限公司), 0.2 μmol L引物 , 0.2
mmol L dNTP , 1.5 ～ 2.0 mmol L MgCl2 , 10 ng 模板
DNA。利 用 此 优 化 系 统 , 选 用 811 引 物
(GAGAGAGAGAGAGAGAC), 对日本居群的 23个个
体进行 ISSR_PCR扩增 , 能得到清晰 、 多态性高的
ISSR带谱 , 并具有较好的重复性 (图 5)。
图 5　优化的 ISSR_PCR系统对日本居群 23 个体
扩增的 ISSR带型 (引物 811)
Fig.5　ISSR profiles of 23 Japan samples ,
obtained by using optimal ISSR_PCR system (Primer 811)
参考文献:
[ 1] 　ERICKSON K L , BEUTLER J A , CARDELLINA J H , et al.
A novel phorbol ester from Excoecaria agallocha[ J] .J Nat
　　Prod , 1995 , 58(5):769-72.
[ 2] 　ZIETIEWIEZ E , RAFALSKI A , LABUDA D.Genome
fingerprinting by simple sequence repeats (SSR)_anhored
polymerase chain reaction amplification [ J] .Genomics ,
1994 , 20:176-183.
[ 3] 　何予卿 , 张宇 , 孙梅 , 等.利用 ISSR标记研究栽培稻和
野生稻亲缘关系[ J] .农业生物技术学报 , 2001 , 9(2):
123-127.
[ 4] 　GILBERT J E , LEWIS R V , WILKINSON M J , et al.
Developing an appropriate strategy to assess genetic variability
in plant germplasm collections[ J] .Theoretical and Applied
Genetics , 1999 , 98:1125-1131.
[ 5] 　BORNET B , GORAGUER F , JOLY G , Branchard.Genetic
diversity in European and Argentinian cultivated potatoes
(Solanum tuberosum subsp.tuberosum)detected by inter_
simple sequence repeats (ISSRs)[ J] .Genome , 2002 , 45:
481-484.
[ 6] 　余艳 , 陈海山 ,葛学军.简单重复序列区间(ISSR)引物
反应条件优化与筛选[ J] .热带亚热带植物学报 , 2003 ,
11(1):15-19.
[ 7] 　陈永久 ,张亚平.随机扩增多态 DNA 影响因素的研究
[ J] .动物学杂志 , 1997 , 18(2):221-227.
[ 8] 　林万明.PCR技术操作和应用指南[ M] .北京:人民军
医出版社 , 1993.7-14.
[ 9] 　卢圣栋.现代分子生物学实验技术[ M] .第 2 版.北
京:中国协和医科大学出版社 , 1999.
[ 10] 　DOYLE J J , DOYLE J L.A rapid DNA isolation procedure
for small quantities of fresh leaf tissue [ J] .Phytochem.
Bull.1987 , 19:11-15.
[ 11] 　李钧敏 , 金则新 ,柯世省.濒危植物七子花 RAPD条件
的优化[ J] .植物学通报 , 2002 , 19(4):452-456.
[ 12] 　宣继萍 , 章　镇.适合于苹果的 ISSR反应体系的建立
[ J] .植物生理学通讯 , 2002 , 38(6):549-550.
Optimization of ISSR Analysis for Excoecaria agollocha L.
ZHANGZhi_hong1 , TAN Feng_xia1 ,HE Hang_hang1 ,WU Ling_hui1 , ZHONG Cai_rong2 , SHI Shu_hua1
(1.School of Life Sciences , Sun Yat_sen University , Guangzhou 510275 , China;
2.Dongzhaigang National Nature Reserve , Hainan 571129 , China)
Abstract:Excoecaria agallocha L.is a medical mangrove plant of Euphorbiaceae.The factors which affect the ISSR
analysis in the study of the genetic diversity of E.agallocha , such as genomic DNA extraction , concentrations of
template DNA , Taq DNA polymerase , Mg2+ and dNTP , etc were examined.The optimal ISSR_PCR conditions in our
experiments were as the following:1×Taq buffer (10 mmol L Tris·HCl , pH 9.0 , 50 mmol L KCl , 0.1%Triton X_
100), 10 ng template DNA , 0.6 ～ 0.7 U Taq DNA (produced by Shenneny Bocai Company), 0.2μmol L primer , 1.5
～ 2.0 mmol L MgCl2 , 0.2mmol L dNTP.The length of amplification gave clear and reproducible banding patterns.The
length of bands ranged from 200 to 2 500 bp and exhibited a high level of polymorphism.
Key words:Excoecaria agollocha L.;ISSR;optimization;mangroves
66 中山大学学报 (自然科学版) 第 43 卷