全 文 ：吴亚腾，吴曼莉，柳志强，等． 大叶山楝拮抗内生真菌 DYSJ3 的鉴定及抑菌活性产物分析［J］． 江苏农业科学，2016，44(5):181 － 184．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 05． 050
大叶山楝拮抗内生真菌 DYSJ3 的鉴定
及抑菌活性产物分析
吴亚腾，吴曼莉，柳志强，李晓宇
(海南大学环境与植物保护学院，海南海口 570228)
摘要:从大叶山楝体内分离得到 1 株内生真菌 DYSJ3，发现其对香蕉炭疽病菌、橡胶炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒
果炭疽病菌具有较强的拮抗作用，皿内抑制率分别为 61． 9%、57． 9%、55． 3%和 65． 9%。通过形态学观察结合 ITS 序
列分析，初步将菌株 DYSJ3 鉴定为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。对菌株 DYSJ3 产生的抑菌活性物质进行了初步分
析，发现菌株 DYSJ3 的抑菌活性物质集中于菌丝体中，其菌丝体乙酸乙酯浸提物对多种植物病原真菌具有较强的抑
菌活性，且热稳定性较好，100 μg /mL 浸提物对香蕉炭疽病菌及苹果轮纹病菌具有明显抑制活性，抑制率分别为
72． 7% 和 62． 0%。当浓度为 1 000 μg /mL时，浸提物对香蕉炭疽病菌、苹果轮纹病菌、黄瓜枯萎病菌、橡胶炭疽病菌、
小麦赤霉病菌的抑制率均大于 90%。
关键词:大叶山楝;内生真菌;杂色曲霉;抑菌活性
中图分类号:S182 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)05 － 0181 － 03
收稿日期:2015 － 10 － 30
基金项目:国家自然科学基金(编号:31160377)。
作者简介:吴亚腾(1990—)，男，安徽合肥人，硕士研究生，主要从事
微生物天然产物研究。E － mail:18976092621@ 163． com。
通信作者:李晓宇，博士，副教授，主要从事微生物学研究。Tel:
(0898)66192915;E － mail:hdlixiaoyu@ 126． com。
大叶山楝(Aphanamixis grandifolia)为楝科(Meliaceae)山
楝属(Aphanamixis)植物，主要分布于广东、广西、云南、海南
等低海拔至中海拔山地沟谷密林或疏林地区，是一种传统的
中药。《新华本草纲要》记载大叶山楝的根及叶具有祛风除
湿、舒筋活络及通痹等功效，为祛风止痛药。据文献报道，大
叶山楝中主要含有倍半萜、二萜、三萜等萜类成分和甾体等，
具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性［1 － 3］。Zeng 等从大叶山楝
中分离到四环三萜、倍半萜、木脂素、苯丙素、二肽类等化合
物，并选出多个具有肿瘤细胞抑制活性的单体化合物［4］;黄
淼等从大叶山楝根分离得到 9 个化合物，发现多个化合物对
慢性髓原白血病细胞 K562 和人胃癌细胞 SGC － 7901 有生长
抑制活性［5］。然而，目前关于大叶山楝内生真菌的研究鲜有
报道。本研究从大叶山楝体内分离出 1 株内生真菌 DYSJ3，
发现其对多种植物病原菌具有较好的拮抗活性，通过形态观
察结合 ITS序列分析对该菌株进行鉴定，并对其产生的抗菌
活性物质进行初步分析。
1 材料与方法
1． 1 菌株
内生真菌 DYSJ3从大叶山楝中经组织表面消毒分离获得。
供试真菌:香蕉枯萎病菌 (Fusarium oxysporum sp．
cubense)、黄 瓜 枯 萎 病 菌 (Fusarium oxysporum sp．
cucumerinum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、香蕉炭
疽病菌(Colletotrichum musae)、橡胶炭疽病菌(Colletotrichum
gloeosporioides)、芒果炭疽病菌 (Colletotrichum gloeospori-
oides)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengriana sp． piricola)
由海南大学环境与植物保护学院提供。
1． 2 培养基
PDA 培 养 基:马 铃 薯 200 g，葡 萄 糖 20 g，蒸 馏
水 1 000 mL。
LB培养基:胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，
蒸馏水 1 000 mL。
CM培养基:胰化蛋白胨 6 g，酵母提取物 6 g，蔗糖 10 g，
蒸馏水 1 000 mL。
1． 3 菌种活化及平板拮抗试验
将内生真菌 DYSJ3 及植物病原真菌接种于 PDA平板上，
28 ℃培养 5 ～ 7 d活化待用。用 5 mm 打孔器在培养 5 ～ 7 d
的供试内生真菌、病原真菌平板的菌落边缘取菌饼，将病原真
菌置于 PDA平板中央，菌株 DYSJ3 置于平板边缘，以只接种
病原真菌的 PDA平板为对照，每个处理 3 个重复，28 ℃培养
5 ～ 7 d，测量菌落半径(mm)，计算抑菌率。抑菌率 =(对照组
菌落半径 －处理组菌落半径)/对照组菌落半径 × 100%。
1． 4 菌株 DYSJ3 鉴定
将菌株 DYSJ3 接种于 PDA培养基上，28 ℃培养 3 ～ 7 d，
从第 3 天开始每天挑取少量菌丝于载玻片上，在显微镜下观
察气生菌丝、分生孢子等，拍照并描述特征。
菌株基因组 DNA提取采用 CTAB 法［6］，利用 ITS 通用引
物(ITS 1:5 － TCCGTAGGTGAACCTGCGG － 3，ITS 4:
5 － TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3)进行 PCＲ 扩增。PCＲ
反应体系为:10 × buffer 2． 5 μL，Taq酶 0． 25 μL，dNTPs 2 μL，
ITS 1 0． 5 μL，ITS 4 0． 5 μL，dH2O 18． 25 μL，模板 1 μL，总体
积 25 μL。PCＲ反应条件为:95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性
30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 个循环;72 ℃延伸
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30 min。将所得产物用纯化试剂盒回收，连接到 pMD18 － T
Vector，由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，将所测
序列在 GenBank 中(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov)进行
Blast 分析。用 Clustal X (1． 83)软件进行多序列比对
(Multiple alignments)，利用 MEGA 5． 0 软件以邻近相接法
(Neighbor － joining，NJ)构建系统进化树。
1． 5 菌株 DYSJ3 粗提物的制备及活性测定
菌株 DYSJ3 活化后，接种于 5 L 的 PDA 液体培养基中，
28 ℃、180 r /min振荡培养 7 d，室温避光静置 21 d。将菌丝体
和发酵液用 8 层纱布过滤分离，充分洗净菌丝体。发酵液浓
缩为浸膏后备用。菌丝体用 95%乙醇浸泡后超声破碎 1 h，
再用 8 层纱布过滤获得乙醇浸出液，浓缩为浸膏后备用。
配制香蕉炭疽菌的孢子悬浮液(1 × 107 CFU /mL)，混入
PDA 平板中，制备带菌平板。将获得的发酵液及菌丝体浸膏
用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇进行浸提，获得各溶剂层浸
膏，丙酮溶解，利用牛津杯法检测其拮抗活性［7］。
1． 6 菌株 DYSJ3 粗提物热稳定性及抗菌谱测定
热稳定性试验:使用香蕉炭疽病菌制备带菌平板，将
DYSJ3 粗提物置于 120 ℃处理 1 h，利用牛津杯法检测其
活性。
抗菌谱测定:将 DYSJ3 菌丝体乙酸乙酯粗提物用丙酮完
全溶解后混入 PDA 培养基，制成浓度分别为 100、500、
1 000 μg /mL 的平板，以加丙酮 PDA 平板为对照组。用直径
5 mm打孔器在供试病原菌菌落边缘取菌饼接于平板中央，每
处理 3 个重复，28 ℃培养 3 ～ 7 d，十字交叉法测量所有处理
菌落生长直径(mm)，按如下公式计算菌丝生长抑制率［8］:
菌丝生长抑制率 =［(对照菌落直径 － 5)－(处理菌落直
径 － 5)］/(对照菌落直径 － 5)× 100%。
2 结果与分析
2． 1 菌株 DYSJ3 皿内拮抗活性
利用对峙生长法测试了菌株 DYSJ3 对 4 种植物病原真
菌的皿内拮抗活性，结果见表 1、图 1，内生真菌 DYSJ3 对香蕉
炭疽病菌、橡胶炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌具有
明显的拮抗作用，皿内抑制率均大于 50%。
表 1 菌株 DYSJ3 对 4 种植物病原真菌的皿内抑制率
供试病原真菌 抑菌率(%)
香蕉炭疽病菌 61． 9
橡胶炭疽病菌 57． 9
香蕉枯萎病菌 55． 3
芒果炭疽病菌 65． 9
2． 2 菌株 DYSJ3 鉴定
菌株 DYSJ3 在 PDA 培养基上生长缓慢，培养 14 d 直径
3 ～ 6 cm，菌落呈不规则圆形、紧密，培养基正面颜色有数环，
从青绿到红绿，背面颜色有青黄、红褐色等。分生孢子头的顶
囊近球形，顶囊着生小梗，小梗有单层、双层、单双层同时生在
1 个顶囊上，顶端有链形孢子、近球形孢子，无色(图 2)。
对菌株 DYSJ3 的 ITS序列进行 PCＲ扩增，测序得到 598 bp
的碱基序列。将得到的 ITS序列进行 Blast 分析，发现其与杂
色曲霉的亲缘关系最近，相似度达到 100%。选取多株曲霉
属菌株与 DYSJ3 的 ITS 序列，利用 MEGA 5． 0 构建系统发育
树(图 3)，DYSJ3 在系统进化树中与 Aspergillus versicolor在同
一分支上，结合形态学特征初步将 DYSJ3 鉴定为杂色曲霉
(Aspergillus versicolor)。
2． 3 菌株 DYSJ3 粗提物制备及活性分析
利用牛津杯法测试了菌株 DYSJ3 发酵液及菌丝体粗提
物对香蕉炭疽病菌的拮抗作用，结果发现 DYSJ3 发酵液粗提
物对病原菌无拮抗作用，菌丝体乙酸乙酯浸提物具有明显的
拮抗活性(图 4 － A)。由此可见，菌株 DYSJ3 的抑菌活性物
质集中于菌丝体中。将菌丝体乙酸乙酯浸提物置于 120 ℃处
理 1 h后测试拮抗活性，抑菌圈与对照组相比无显著变化(图
4 － B)，可见菌株 DYSJ3 产生的抑菌活性物质具有较好的热
稳定性。
将菌株 DYSJ3 菌丝体乙酸乙酯浸提物配制成不同浓度
(100、500、1 000 μg /mL)，测试了其对 6 种植物病原菌的拮抗
活性，结果见表 2、图 5。菌丝体乙酸乙酯浸提物在
1 000 μg /mL 浓度时对香蕉炭疽病菌、苹果轮纹病菌、黄瓜枯
萎病菌、橡胶炭疽病菌、小麦赤霉病菌抑制率均大于 90%，对
香蕉炭疽病菌及苹果轮纹病菌菌丝抑制明显，500 μg /mL 浓
度下抑制率分别达到 93． 5%和 87． 3%。
3 讨论
从微生物次生代谢产物中筛选抗生素是新药开发的一个
重要途径，随着近年来对新型抗生素需求的增加，植物内生菌
次生代谢产物的研究受到了广泛的关注。药用植物内生真菌
多样性十分丰富，由于特殊的生存环境，药物植物内生真菌在
生长和代谢过程中可以产生各种具有特殊化学结构类型和特
殊生理功能的活性物质，这是研究开发农药先导化合物珍贵
的原料宝库。
本研究对分离自药用植物大叶山楝内生真菌 DYSJ3 进
行了鉴定，初步鉴定为曲霉属杂色曲霉。目前有关杂色曲霉
次生代谢产物的研究有部分报道，董世豪等从相似蜂海绵分
离到 1 株海洋真菌杂色曲霉 F62，从中分离得到了 6 个化合
物，分别为 Alantrypinone、洛伐他汀、甲酯型莫纳克林 K、土曲
霉酮、土震素 B和麦角甾醇，其中土曲霉酮具有体外抗炎活
性［9］;巩婷等从海洋真菌杂色曲霉 F62 中分离得到 6 个丁内
酯类化合物，其中丁内酯Ⅰ表现出较强的抗炎活性［10］;赵彩
桂从杂色曲霉中分离鉴定了 22 个化合物，主要为没药烷型倍
半萜、二苯醚类化合物、生物碱和甾体［11］;王香粉从海洋真菌
杂色曲霉菌发酵液中分离纯化得到 7 个化合物，包括
5 － methylbenzene － 1，3 － diol、吡咯并哌嗪 － 1，4 － 二酮、
3 －(hydroxymethyl)cyclopentanol、3 －异丙基 －吡咯并哌嗪 2，
5 －二酮、6 －甲氧基柄曲菌素等［12］。然而，目前尚未有将杂
色曲霉用于植物真菌病害防治的研究。本研究发现菌株
DYSJ3 菌丝体乙酸乙酯浸提物对 6 种植物病原真菌具有较强
的抑制能力，具有广谱抗菌性，热稳定性较好，具有开发的潜
力。本研究为下一步进行菌株 DYSJ3 抑菌活性物质的分离、
鉴定及应用奠定了良好的基础。
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—281— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 5 期
表 2 菌株 DYSJ3 菌丝体乙酸乙酯浸提物对供试病原菌
的抑制率统计
乙酸乙酯
浸提物浓
度(μg /mL)
抑制率(%)
香蕉炭
疽病菌
苹果轮
纹病菌
黄瓜枯
萎病菌
橡胶炭
疽病菌
香蕉枯
萎病菌
小麦赤
霉病菌
1 000 98． 7 93． 0 90． 9 94． 7 80． 0 96． 7
500 93． 5 87． 3 32． 7 49． 1 40． 1 53． 3
100 72． 7 62． 0 25． 5 38． 6 5． 7 26． 7
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櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
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刘 健，张德咏，张松柏，等． 湖南和福建辣椒上辣椒脉斑驳病毒的检测及系统发育分析［J］． 江苏农业科学，2016，44(5):184 － 185．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 05． 051
湖南和福建辣椒上辣椒脉斑驳病毒
的检测及系统发育分析
刘 健1，张德咏1，2，张松柏2，刘 勇1，2
(1．中南大学研究生院隆平分院，湖南长沙 410125;2． 湖南省植物保护研究所，湖南长沙 410125)
摘要:辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)，目前在我国仅有在海南黄灯笼辣椒上严重危害的报道。
利用湖南省和福建省采集的辣椒样本，检测辣椒 ChiVMV的检出率，并克隆 ChiVMV的 CP基因序列，用邻近法构建了
系统进化树，分析其遗传进化情况。结果表明，辣椒的 ChiVMV 省检出率湖南省为 25%，福建省为 20%;克隆了湖南
省和福建省 ChiVMV CP基因各 1 个，系统发育表明，湖南省和福建的 ChiVMV株系与源于韩国 ChiVMV株系聚在一个
亚簇，而与我国其他地区 ChiVMV亲缘关系较远，表明侵染辣椒的 ChiVMV在我国进一步扩展，且存在遗传分化趋势。
关键词:辣椒脉斑驳病毒;检测;CP基因;系统发育分析
中图分类号:S436． 418． 1 + 9 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)05 － 0184 － 02
收稿日期:2016 － 03 － 24
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(编号:201303038);国家大
宗蔬菜产业技术体系(编号:CAＲS － 25 － B － 05)。
作者简介:刘 健(1989—)，男，湖南衡阳人，硕士研究生，主要从事
植物病毒学研究。E － mail:lj46311688@ 163． com。
通信作者:刘 勇，研究员，博士生导师，主要从事植物病毒研究。
Tel:(0731)84691176;E － mail:haoasliu@ 163． com。
辣椒，一种茄科辣椒属植物，原产于中南美洲热带地区，
在全世界都有广泛栽培，是世界上消费量最大的蔬菜之一。
我国辣椒种植面积高达 140 万 hm2 以上，占据我国所有蔬菜
作物种植面积的 10%［1］。辣椒病毒病是威胁辣椒安全生产
的重要病害，目前能够侵染辣椒的病毒有 40 多种［2 － 3］，其中
辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)是危害辣
椒作物的最主要病毒之一;该病毒于 1979 年首次在马来半岛
的辣椒作物上被发现［4］，随后在世界上许多国家的辣椒作物
上陆续被报道［5 － 7］。ChiVMV 主要依靠蚜虫进行非持久性传
播［4］，还能通过病株汁液和机械接触等方式传播，不能通过
种子传播，因此，其传播扩散速度非常快。
在我国，ChiVMV首先在海南省被报道，严重危害海南的
黄灯笼椒［8］，随后在陕西、云南等地区相继发生［8 － 10］。然而，
到目前为止，尚未见 ChiVMV在湖南以及福建等地区的报道。
鉴于 ChiVMV对辣椒生产的威胁，本研究检测了湖南和福建
等地辣椒上 ChiVMV 的发生情况，克隆了湖南和福建等地
ChiVMV株系的 CP基因，并分析了其系统发育关系，以期为
明确我国 ChiVMV的分布及遗传进化提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
辣椒样品:2013 年 8 月，在湖南省和福建省进行辣椒病
毒病调查，发现部分地块辣椒病毒病的发病症状与 ChiVMV
类似，表现为植株矮小，叶片畸形(包括叶片黄化、叶卷曲、叶
面枯斑、叶沿皱缩等)。采集湖南省辣椒样本 16 个、福建省
辣椒样本 8 个。
ChiVMV ELISA检测试剂盒购自美国 ＲB 公司;cDNA 试
剂盒、DNTP、氨苄青霉素、EASY Taq DNA聚合酶和 DNA回收
试剂盒均购自北京全氏金生物技术有限公司，Trizol试剂盒购
自 Ambion公司，Elisa试剂盒购自 ＲP 公司;供试引物由华大
基因公司合成，DNA 测序测定由生物工程(上海)有限公司
完成。
—481— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 5 期