全 文 ：第5期湖南农业科学
怀地黄(RehmanniaGlutinosaLibosch.)为玄参
科多年生草本植物,是一种名贵的中药材。李时珍
《本草纲目》中写道:“江浙壤地黄者,受南方阳气,
质虽光润机时力微;怀庆府产者,禀北方纯阴,皮有
疙瘩而力大。”所以古今中外都以“怀货”为贵。据现
代医学化验,温县地黄10g的药力等于其它地区产
的30g或100g以上[1]。但由于怀地黄种植过程中
存在着严重的连作障碍,需在收获后8～10a才能
复种,否则病虫害严重,甚至绝收,因此严重影响了
怀地黄的产量和市场供应。为满足市场需求,不得
不在原产区焦作(古称怀庆府)以外的其它地区种
植,但由于水、土、气候等自然条件与原产区存在差
异,引进种植的怀地黄种子1～2a即发生退化,尽
管也被称为怀地黄,但其药效显著降低,严重影响
了其质量[1-2]。因此,探究怀地黄连作障碍发生机理
及其防治措施已经成为亟待解决的问题。已有的研
究表明,连作障碍等自然现象的发生与化感现象密
切相关[3],化感物质主要来自根系的分泌作用,对作
物生长发育有一定的抑制作用。朱广军等[4]对怀地
黄根区土壤潜在化感物质进行了分析,发现种植一
茬怀地黄后的根区土壤有机化合物有长链有机酸、
烯醇、酚、醛、酚酸等,土壤中的潜在化感物质种类
远较空白地的丰富。有文献报道复合微生物制剂对
作物连作障碍有一定的防治作用[5]。笔者以河南宛
西制药股份有限公司的武陟怀地黄种植基地空白
地土样和种植一茬怀地黄后的根区土样为研究对
象,利用本研究室研制的复合微生物制剂探索其对
怀地黄连作障碍的修复机制,以期为解决怀地黄连
复合微生物菌肥对怀地黄连作障碍修复机制研究
李自刚 1,2,3,王新民 1,2,刘太宇 1,2,张晓根 1,2,介晓磊 1,2,赵跃进 3
(1.郑州牧业工程高等专科学校生物工程系,河南 郑州 450011;
2.河南省高校动物营养与饲料工程技术研究中心,河南 郑州 450011;
3.河南省农业微生物工程技术研究中心,河南 三门峡 472143)
摘 要:微生物分子生态学研究表明,所研制的ZZMZ土壤修复菌剂能够在怀地黄根际土壤定植,并且在一定程度上能有效降
解怀地黄连作后产生的化感物质。培养28d后,怀地黄种植土壤样品(干土)中的3种酚酸物质——香草酸、对羟基苯甲酸及阿
魏酸总量降解率达50.93%。
关键词:怀地黄;连作障碍;微生物修复
中图分类号:Q938.1 文献标识码:A 文章编号:1006-060X(2008)05-0062-04
RestorationofcontinuousCroppingObstaclesofRehmanniaGlutinosa
LiboschbyApplyingCompoundBacterialManure
LIZi-gang,WANGXin-min,LIUTai-yu,ZHANGXiao-gen,JIEXiao-lei,
ZHAOYue-jin
(1.BioengineeringDepartmentofZhengzhouColegeofAnimalHusbandaryEngineering,Zhengzhou450011,PRC;2.
EngineeringTechnologyResearchCenterofAnimalNutritionandForage,Zhengzhou450011,PRC;3.Henan
AgriculturalMicrobiologyEngineeringResearchCenter,Sanmenxia472143,PRC)
Abstract:Thesoilimprovedbacterialmanere(ZZMZ)couldfieldplantedintheRhizosphereofRehmanniaglutinosa
Liboschthroughthestudyofmolecularmicrobialecology.TheZZMZsoilimprovedbacterialmanurecoulddecrease
thealelochemicalsgeneratedafterRehmanniaglutinosaLiboschcontinuouscropping.After28dincubation,the
continuouscroppingobstacles,suchasvanilicacid,p-hydrobenzoicacid,andferulicaciddegraded50.93%.
Keywords:RehmanniaglutinosaLibosch;continuouscroppingobstacles;microbialremediation
收稿日期:2008-05-10
基金项目:河南省重点科技攻关项目(0224660012)
作者简介:李自刚(1970-),男,河南范县人,博士,副教授,主
要从事环境微生物学研究。
通讯作者:介晓磊
土壤肥料·资源环境
湖南农业科学 2008,(5):62~65 HunanAgriculturalSciences
DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2008.05.035
第5期
作减产及调控措施提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
种植试验地位于河南宛西制药股份有限公司
的武陟怀地黄种植基地内,种植的怀地黄品种为
“金状元”。怀地黄连作土壤ZZMZ微生物修复菌剂
由郑州牧业工程高等专科学校生物工程系微生物
技术及应用教研室研制,该制剂含有4种不同的微
生物菌种。
1.2 土样采集
分别采集未种植过怀地黄(空白样品)和种植
一茬怀地黄(供试样品)后的根区土样。取土方法均
为五点取样法[6],取土深度为土表层下20~30cm,每
个取样点的土壤取样重量为2kg。取回后于实验室
把土壤样品45℃恒温烘干粉碎、过2mm筛后对其
进行土壤理化性质分析,结果如下表1所示。
1.3 土样微生物DNA提取及DGGE凝胶分析
土样微生物DNA提取及DGGE凝胶分析方法
参照文献[7]。
1.4 连作土壤的微生物修复
将种植一茬“金状元”后的供试土壤样品 2kg
装入盆钵中,加入 20mlZZMZ修复菌剂发酵液并
与供试土壤充分混匀。为满足ZZMZ修复菌剂生长
要求,用石灰调节空白土壤 pH至 7.5,并以未种植
过怀地黄(空白样品A0)为对照。两个土壤样品中
均加入2.0g硫酸铵。保持供试土壤含水量40%～
60%,在20～28℃条件下培养1个月,分别在第0、
7、14、21、28天时进行取样分析。
1.5 连作土壤的微生物修复物质降解分析
利用气相色谱与质谱连用(GC-MS)技术对连
作土壤的怀地黄根际分泌物进行分析,以添加灭活
的ZZMZ土壤微生物修复菌剂的连作土壤为对照,
与添加活性 ZZMZ微生物修复菌剂处理的土壤进
行比较,分析微生物修复对怀地黄连作障碍物质的
降解情况。GC-MS操作条件参照李自刚等[8]和邢勇
等[9]人的研究。
2 结果与讨论
2.1 ZZMZ4种不同的微生物菌种的定植
怀地黄连作土壤微生物修复菌剂能不能在被
修复的怀地黄根际土壤内定植是其能否起修复作
用的基础。目前,研究微生物在土壤定植的方法常
用的是平板计数培养法,大量研究表明平板计数法
不能检测那些未能培养的细菌[7-8,10]。同时,土壤微生
物修复菌剂在怀地黄根际土壤内定植降解怀地黄
连作障碍物质的过程中不可避免地将伴生其它的
怀地黄根际微生物,而土壤微生物中存在大量的不
可分离培养的微生物[8],因此研究 ZZMZ土壤微生
物修复菌剂中 4种微生物在怀地黄根部土壤定植
及其对怀地黄根部土壤不可培养微生物种群影响
传统微生物培养方法难以解决[10],为此采取了能够
对不可培养微生物进行研究的分子生物学方
法——变性梯度凝胶电泳法(DenaturingGradient
GelEletrophoresis,DGGE)。
DGGE法是基于原核微生物16SrRNA保守性
的DNA指纹技术,它能有效分析复杂微生物群落
及其多样性且无须培养微生物,受到广泛重视。其
基本原理是长度相同而碱基组成不同的DNA序列
在不同变性条件下变性,在变性梯度凝胶上的特定
位置形成泳带[11]。
图 1是添加 ZZMZ土壤微生物修复菌剂处理
的怀地黄根际土壤样品分别培养 7、14、21、28d时
的细菌DGGE图谱。将ZZMZ土壤修复菌剂组成菌
株的16SrDNAV3区PCR产物作为DGGE图谱标
准条带,分别标记为 ZZMZ1、ZZMZ2、ZZMZ3和
ZZMZ4。
图谱显示:空白对照P泳道中的细菌分子微生
态群落构成简单、稳定,且 ZZMZ土壤修复菌剂的
组成菌落ZZMZ1、ZZMZ2、ZZMZ3和ZZMZ4不是空
有机质 全氮 速效P 速效K 阳离子交换代
(g/kg)(g/kg)(mg/kg)(mg/kg) 换量 (cmol/kg)
供试样品 7.8 10.8 0.87 6.81 97.06 9.82
空白样品 7.3 9.0 0.62 5.90 105.12 10.64
土壤类型 pH
表1 供试土壤的主要理化性质
4 3 2 1 P M
ZZMZ1
ZZMZ2
ZZMZ3
ZZMZ4
图1怀地黄根际土壤细菌的DGGE图谱
注:M:ZZMZ菌剂标准样品;P:空白对照(A0);条带 1～4:分别为第
7、14、21、28天样品。
李自刚等:复合微生物菌肥对怀地黄连作障碍修复机制研究 63
第5期湖南农业科学
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
1
2 34
5
6
7 8 9
10
图2怀地黄根际土壤根分泌物GC-MS图
注:标号对应物质分别为1:苯甲酸;2:2,4-已二烯二酸;3:苯丙酸;
4:对羟基苯甲酸;5:丁二酸;6:十四烷酸;7:香草酸;8:十六烷酸;
9:十八烷酸;10:阿魏酸。
白土壤中的优势菌株;而添加ZZMZ土壤修复菌剂
处理的土壤中,在培养 7d时,细菌群落的优势菌
群就发生了较大变化,群落的分子多态性明显增
加,第14天时ZZMZ成为土壤细菌优势菌群,并且
在培养期的前21d内保持优势。随着土壤中怀地
黄连作障碍类物质的不断降解,到第28天时,经修
复剂处理的土壤细菌群落结构发生了极大转化,优
势种群也发生了相应变化,预示着物质转化进入了
一个新的阶段。微生物分子多态性分析结果显示,
ZZMZ土壤微生物修复菌剂已在怀地黄根际土壤
中成功定植。
2.2 ZZMZ土壤修复菌剂对连作土壤的修
复作用
利用气相色谱与质谱连用技术(GC-MS)对种
植一茬后的怀地黄根土壤根际分泌物进行分析,结
果如图2所示。
图2显示,从连作后的怀地黄根际土壤分泌物
中检测出苯甲酸、苯丙酸、对羟基苯甲酸、香草酸、阿
魏酸、丁二酸、2,4-已二烯二酸及3种烷酸等物质,
其中前5种都是已被发现存在于黄瓜根分泌物中的
化感物质[12]。阿魏酸是吲哚乙酸氧化酶的辅基,而吲
哚乙酸是引起植物块根膨大的内源激素,阿魏酸在
怀地黄土壤中积累,会提高吲哚乙酸氧化酶的活性,
氧化吲哚乙酸,降低 IAA的含量,进而导致块根不
能膨大,影响植物体内如细胞分裂、蛋白质合成、酶
活性、光呼吸等,不利于植物幼苗生长。据此推测,增
加的这些酸性物质成分也极有可能是怀地黄的化感
物质,是怀地黄连作障碍的发生因子。
对 ZZMZ土壤微生物修复菌剂修复的土壤样
品进行检测,与添加灭活修复剂的土壤样品(对照)
对比发现:ZZMZ土壤修复菌剂施入土壤中14d后
(图3),3种酚酸的含量均已发生变化。其中,阿魏
酸的降解最为明显,峰高已降低一半(从峰值判断,
峰形未分开)。对羟基苯甲酸及香草酸的含量也有
所降低,但降幅不明显。ZZMZ土壤修复菌剂施入
28d后(图4)测定土壤中3种酚酸物质含量发现,
添加修复菌剂的土壤样品(干土)中对羟基苯甲酸、
香草酸和阿魏酸的含量分别为 4.144、2.354和
5.353μg/g,与对照相比,分别降低了 66.0%、
28.9%和48.4%。且3种酚酸总量在ZZMZ土壤修
复菌剂修复土壤样品中的降解率达到了 50.93%,
表明 ZZMZ土壤修复菌剂能够在一定程度上降解
怀地黄连作后产生的化感物质。
3 讨 论
陈慧等[13]研究发现,地黄连作对其根际微生物
区系及土壤酶活性会产生较大影响。随种植年限的
增加,根际细菌和真菌减少,放线菌增多,对土壤微
生物环境产生了显著影响,破坏了微生物的种群平
衡,导致地黄根际微生态平衡失调,并推测根系分
泌物引起土壤微生物数量和种类的大幅度变化可
能是地黄连作障碍的主要原因之一。
有研究表明,在根系分泌的物质中,酚酸类化
感物质大量积累在土壤中时,会抑制真菌生长,引
起作物和林下植物生长缓慢,导致农作物减产、连
作障碍和自然生态环境破坏。吕卫光等[14]研究发
现,丙烯酸、对羟基苯甲酸是黄瓜根系分泌物中的
主要化感特质组分,能强烈抑制黄瓜根系脱氢酶、
ATP酶、硝酸还原酶和超氧化物歧化酶的活性,引
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
1.002.00 3.004.00 5.006.00 7.00 8.00 9.0010.00
(B) 分钟
响
应
值
图3添加ZZMZ土壤修复菌剂14d后土壤中的酚酸含量
A:灭活菌剂处理 B:菌剂修复处理
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
分钟(A)
响
应
值
0.040
0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
(B) 分钟
响
应
值
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.008.009.0010.00
(A) 分钟
图4添加ZZMZ土壤修复菌剂28d后土壤中的酚酸含量
A:灭活菌剂处理 B:菌剂修复处理
响
应
值
响
应
值
64
第5期
(上接第61页)
甘肃省植保站对小麦的喷叶试验结果表明,旱立停
可延长小麦叶片的光合作用功能,并可防止干热风
引起的旗叶干尖,从而增加结实率和籽粒的重量,一
般可使小麦增产10%～20%。广西壮族自治区植保
总站对水稻喷施旱立停,增产达22.7%;用旱立停水
溶液浇灌果树和粮食作物,可减少因干旱引起的落
花、落果,从而增加产量。
综上所述,旱立停高效植物抗旱剂使用范围较
广。在正常气候条件下,用较稀浓度(1500～5000
倍液),均有增产提质的明显效果,在干旱条件下,
浓度增加到 500～1000倍,即可起到抗旱、增收、
保树的多种作用。
旱立停植物抗旱剂开发,符合全国农业节水发
展规划要求,是旱作节水技术中生化节水技术的发
展,它的广泛推广应用,将给干旱地区农作物稳产、
高产提供农业技术保障,进一步减少干旱地区植物
水分的无效蒸腾。对于提高水分利用率,防止土壤
退化和荒漠化,提高粮、油、蔬菜等农产品质量,具
有重要的现实意义。
参考文献:
[1]美国 FDA(FoodandDrugAdministration).乙酰水杨酸在农业上
应用[Z].联邦公告,1998,71,47218.
[2]蒋长宁,张 灿.新型植物抗旱剂-2-(乙酰氧基)苯甲酸的抗旱
应用效果研究[J].农药科学与管理,2007,28(2):21-24,29.
(责任编辑:卢红玲)
起黄瓜的自毒作用,使连作黄瓜根系活性降低,养
分外渗速率加快,吸收养分减少,根系抗逆性降低,
黄瓜生长受到抑制。对辣椒的研究[15]也发现,随着
根系分泌物含量的增加,辣椒的根、茎、叶的生长均
受到影响,其中根鲜重受到的抑制作用最大,辣椒
根系活力、抗氧化的保护酶(SOD,POD,CAT)活性
明显下降,逆境生理指标丙二醛(MDA)生成量和相
对电导率值明显增大。但研究中检测到的酚酸类物
质是否就是怀地黄的连作障碍因子,还需要进一步
的试验验证。
引入拮抗菌或接种有益微生物可以对连作障
碍进行有效的生物修复。胡春江等[16]在连作障碍的
大豆土壤中引入海洋放线菌,能够有效的减轻大豆
连作障碍。孙红霞等[17]研究发现施用EM菌剂可以
有效防治大棚黄瓜的连作障碍。喻国辉等[18]利用微
生物来缓解苯丙烯酸对黄瓜生长的抑制,但总体来
讲,利用生物防治的手段解决作物连作障碍的研究
还较少。笔者的初步研究表明,ZZMZ土壤修复菌剂
可以在怀地黄土壤中定植并有效降解怀地黄连作
土壤中的酚酸含量,随后将针对该修复剂是否能有
效缓解怀地黄连作障碍,对怀地黄根茎生长以及产
量产生正面影响进行进一步的研究。
参考文献:
[1]丁自勉.地 黄[M].北京:中国中医药出版社,2001.
[2]周俊英.中药地黄的染色体研究[J].山东科学,2002,15(1):20.
[3]阮维斌,赵紫娟,薛 健,等.高效液相色谱法检测与化感现象
相关的5种酚酸[J].应用与环境生物学报,2001,7(6):609-612.
[4]朱广军,王明道,吴宗伟,等.地黄根区土壤潜在化感物质的
GC-MS分析 [J].河南科学,2007,25(2):255-257.
[5]李保会.复合微生物菌肥对连作草莓矿质养分吸收及产量的影
响[J].河北农业大学学报,2007,30(3):44-47.
[6]中国土壤学会.土壤农业化学分析方法[M].北京:中国农业科技
出版社,1999.
[7]李自刚,黄为一.有机堆肥PCR-DGGE的微生物分子多态性分
析[J].土壤学报,2005,42(6):41-43.
[8]李自刚,黄为一.奶牛粪堆肥产品低分子量有机物质分析研究
[J].植物营养与肥料学报,2006,12(3):437-444.
[9]邢 勇,段小燕.植物的自毒作用 [J].生物学教学,2002,27(11):
32-33.
[10]HeadIM,SaundersJR,PickupRW.Microbialevolution,di-
versity,andecology:AdecadeofribosomalRNAanalysisofun-
cultivatedmicroorganisms[J].MicrobialEcology,1998,35:1221.
[11]MuyzerG,WaalEC,UiterlindenAG.ProfilingofComplex
microbialpopulationbyDGGEanalysisofPCRgenesencoding
for16SrRNA[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1993,
59(2):695-700.
[12]WhiteheadDC.PhenolicCompoundsinSoilasInfluencedby
theGrowthofDiferentPlantSpecies[J].AppliedEcology,1982,
19:579-588.
[13]陈 慧,郝慧荣,熊 君,等.地黄连作对根际微生物区系及土
壤酶活性的影响[J].应用生态学报,2007,18(12):2755-2759.
[14]吕卫光,张春兰,袁 飞,等.化感物质抑制连作黄瓜生长的作
用机理[J].中国农业科学,2002,35(1):106-109.
[15]侯永侠,周宝利,吴晓玲,等.辣椒根系分泌物化感作用的研究
[J].沈阳农业大学学报,2007,34(4):504-507.
[16]胡春江,薛德林,王书锦,等.大豆连作障碍研究Ⅲ.海洋放线菌
MB-97促进连作大豆增产机理[J].应用生态学报,2002,13(9):
1095-1098.
[17]孙红霞,武琴,郑国祥,等.EM对茄子、黄瓜抗连作障碍和增强
土壤生物活性的效果[J].土壤,2001,5:264-267.
[18]喻国辉,谢银华,陈燕红,等.利用微生物缓解苯丙烯酸对黄瓜
生长的抑制[J].微生物学报,2006,46(6):934-938.
(责任编辑:张广平)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
李自刚等:复合微生物菌肥对怀地黄连作障碍修复机制研究 65