全 文 ：收稿日期：2013-02-18
基金项目：广西农业科学院基本科研业务专项项目［200808Z（基）］
作者简介：韩美丽（1963-），副研究员，主要从事生物技术研究工作，E-mail：hmlii@126.com
0 引言
【研究意义】葡萄柚（Citrus paradisi Macf）是一类
重要柑桔，起源于西印度群岛的巴巴多斯，在欧美地
区大量种植，我国种植开始较晚，仅在个别省（区）有
少量种植（陈韶辉等，2005）。葡萄柚营养丰富，果肉富
含维生素C、柚苷和橙苷，具有营养、美容、保健及预防
疾病多种功效，葡萄柚中还含有高含量的精油，这种
精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌具有较强的
抑制作用，因此，葡萄柚是一种开发潜力较大的生物
抗菌素资源（李悦等，2010）。由于葡萄柚耐寒力低，不
仅限制了其种植区域，还不利于其果实的低温贮藏。
此外，由于葡萄柚为多年生木本植物，童期长，传统杂
农杆菌介导的葡萄柚转化再生体系建立研究
韩美丽1，陆荣生1，林 睿2，马跃峰1，杨玉霞1，覃建林1
（1广西农业科学院植保所/广西作物病虫害生物学重点实验室，南宁 530007；2广西医科大学，南宁 530001）
摘要：【目的】建立邓肯葡萄柚上胚轴遗传转化再生体系，为葡萄柚基因转化研究奠定基础。【方法】以邓肯葡萄
柚上胚轴为外植体，研究上胚轴不定芽和生根诱导、遗传转化的影响因子。【结果】在添加TDZ 0.50~1.00 mg/L的培
养基上，上胚轴不定芽诱导率为72.7%~81.6%；无菌枝条的最适生根条件为1/2MT添加ABT6号1.0 mg/L，生根率
可达81.3%。不同抗菌素中，以替门汀杀菌效果较好，且对外植体出芽无明显抑制作用。转化芽选择初期，5~7 d的暗
培养有利于卡那霉素抗性芽的诱导发生。PCR检测结果显示，7株抗性植株中有6株呈阳性。【结论】建立了邓肯葡萄
柚上胚轴植株再生繁殖体系，为其基因转化奠定了基础。
关键词：葡萄柚；不定芽；再生；转化
中图分类号：S666.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2013）07-1081-06
Establishment regeneration system for Citrus. paradisi Macf. cv
Duncan by Agrobacterium-mediated transformation
HANMei-li1，LURong-sheng1，LINRui2，MAYue-feng1，YANGYu-xia1，QINJian-lin1
（1Plant Protection Research Institute，GXAAS/Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests，Nanning
530007，China；2Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）
Abstract：【Objective】Transformation regeneration system of epicotyls derived from Citrus paradisi Macf. cv Duncan
seedling were established in order to provide useful reference for its gene transformation. 【Method】Epicotyls of seedling
were used as explants to investigate the influence factors on induction and differentiation of adventitious buds， rooting of
plantlets， and genetic transformation. 【Result】The induction rate of adventitious buds derived from epicotyles were ranged
from 72.7% to 81.6% in media with 0.50-1.00 mg/L TDZ. Comparing three types of growth regulators， the higher rooting
rate （81.3%） were observed in 1/2MT medium with 1.0 mg/L of ABT 6 rooting powder. Among different antibiotics， ti-
mentin showed better sterilizing effects than cefotaxime sodium and ceftriaxone sodium on agrobacterium-mediated trans-
formation plantlets culture. Timentin had no inhibition on buds induction of explants. During initial transformation stage of
buds， 5-7 days of darkness culture was beneficial to induce Kan anti-buds. Among 7 transgenic plantlets， 6 plantlets
showed positive in PCR detection. 【Conclusion】Regeneration system of Citrus paradisi Macf. cv Duncan ecopityls was es-
tablished and provided base on its genetic transformation.
Key words： Citrus paradisi Macf. cv Duncan； adventitious bud； regeneration； transformation
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2013.7.1081
南方农业学报 JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE 2013，44（7）：1081-1086
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.cn
南 方 农 业 学 报
交育种方法费时低效。因此，品种改良是提高葡萄柚
抗寒力的主要途径。遗传转化技术的出现为新品种培
育提供了新的途径。【前人研究进展】良好的外植体再
生体系建立是获得转基因植株的基础。柑桔遗传转化
技术开始于20世纪90年代，至今已取得了较大进展。
到目前为止，柑桔转化研究中常用的转化体系主要有
原生质再生体系、实生苗外植体不定芽发生再生体系
（Kobayashi and Uchimiya，1989；Pena et al.，2004a；
Dutt and Grosser，2009；）。这些再生体系中，不定芽发
生再生体系因其遗传变异较小，被采用最多（Pena et
al.，2004b），但由于品种间基因的差异，需要针对每个
特定的品种优化培养条件，提高其不定芽诱导率。在
转入基因方面，早期转入柑桔的基因主要是选择基
因与报告基因（Moore et al.，1992；Kaneyoshi et al.，
1994；De Oliveira et al.，2009），近年来具有某种特定功
能的目的基因的转化也逐渐增多。Ali等（2012）将
HAL2基因转入糙皮柠檬，预计可以提高柠檬的抗盐
能力。【本研究切入点】目前，有关葡萄柚转化研究方
面国内无相关报道，国外虽有报道（Luth and Moore，
1999；Cevik1 et al.，2012），但存在转化率很低、再生体
系不稳定等问题。在邓肯葡萄柚上胚轴再生与转化研
究中，存在的主要问题是外植体直接分化不定芽的效
率很低，外植体对农杆菌转化中常用的抗菌素较为敏
感，从而影响转化植株的再生，导致转化效率极低。
【拟解决的关键问题】以邓肯葡萄柚实生苗上胚轴
为外植体，探讨不同植物生长调节剂、抗菌素、光照条
件等因子对不定芽诱导、生根培养和转化等的影响，
获得其高效稳定的再生体系，从而为葡萄柚的基因转
化奠定基础。
1 材料与方法
1. 1试验材料
以收集的邓肯葡萄柚（Citrus.paradisi Macf. cv Dun-
can）种子为材料，进行接种诱导培养，获得无菌苗。
农杆菌菌株为LB4404，含双质粒表达载体pAR-27
（由新西兰食品园艺所遗传实验室提供）。载体pAR-27
上插有35s启动子驱动的AFT基因及筛选标记基因新
霉素磷酸转移酶基因（NTP-Ⅱ），AFT基因全长约1.1
kb。该质粒图谱如下：
1. 2离体培养
取收集的邓肯葡萄柚种子，以清水冲洗后，无菌条
件下用0.1% HgCl2处理8 min，然后无菌水洗3~4次，接
种于1/2MS固体培养基中，置于25~30℃黑暗下培养，
当萌发至苗龄20 d时待用。
以培养获得的无菌苗上胚轴为外植体，切成长0.5
cm左右的片段，置于不定芽诱导培养基中培养，培养
基分别添加不同浓度的TDZ、6-苄基腺嘌呤（6-BA），
研究其对上胚轴不定芽诱导的影响。
将上胚轴诱导分化获得的不定芽长成的枝条切
下2~3 cm长转入生根培养基中光下培养，生根基本培
养基为1/2MS，分别添加ABT生根粉、吲哚丁酸（IBA）、
萘乙酸（NAA），探讨其对生根的影响。培养过程中，每
天光照12 h，培养温度26~30℃。
1. 3农杆菌菌株与培养
转化前挑取农杆菌单菌落接种于50 mL LB液体
培养基中，于28℃、黑暗下摇床120 r/min培养至对数
期（OD600=0.8~1.0），然后3000 r/min离心10 min，除去
上清液，在悬浮液里再悬浮一次待用。农杆菌固体平
板培养基为LB附加卡那霉素（Kan）50 μg/mL。
1. 4转化方法
将培养获得的无菌苗上胚轴切成0.5 cm长片段，
浸泡于农杆菌悬浮液中10~15 min；取出、吸去多余菌
液，置于共培养基中于26~28℃黑暗下共培养2~3 d；
转至分化选择培养基上进行选择培养，每两周更换一
次培养基，直至抗性芽产生。在分化选择培养基中添
加不同浓度头孢噻肟钠、替门汀、孢曲松钠，探讨不同
抗菌素抑制农杆菌生长的能力及对外植体再生的影
响；同时，在转化选择初期设定不同时间的暗培养，研
究其对转化芽再生的影响。
不定芽再生与转化研究中所用各类培养基的基
本成分均为MT。上胚轴分化选择培养基附加成分
为TDZ 1.00 mg/L+Kan 100.00 mg/L+Timentin 300.00
mg/L，生根培养基附加ABT 1.00 mg/L、Kan 100.00
mg/L。培养过程均在26~28℃光照下进行，光照强度
1400 lx，光照时间12 h/d。
1. 5抗性芽的PCR检测
培养获得抗性无性系生根后，取叶片提取DNA，
以引物对进行PCR检测（韩美丽等，2006），引物Primer
1：5 ′ -TCTAGAATGAATATTGAATCATCTTTCTGC
-3′；Primer 2：5′-GAGCTCCTAGCACTCTGGCAATG
GAGC-3′。预期扩增长度1.1 kb。
1. 6测定方法
抗性芽发生率（%）测定（韩美丽等，2006）：上胚轴
在分化选择培养基上连续选择60 d，所获得的具卡那
抗性芽的外植体占感染总外植体的百分率。抑菌率
（%）：指外植体与农杆菌共培养3 d后，在添加抗生素
的培养基上培养7 d后，农杆菌生长得到控制的外植
体数占总感染外植体数的百分比。
图 1 质粒pAR-27图谱
Fig.1 Schematic representation of the plasmid pAR-27
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韩美丽等：农杆菌介导的葡萄柚转化再生体系建立研究
2 结果与分析
2. 1不同激素对上胚轴不定芽诱导的影响
将上胚轴外植体接种于添加不同激素的不定芽
诱导培养基上培养7 d左右，切口组织开始膨大，15 d
左右可观察到切口膨大的表面有绿色芽点出现；至
20~25 d，不定芽发生率达最高，最长的芽已有0.5 cm
左右（图2）。不同TDZ与6-BA浓度均可促进不定芽分
化，但分化率有所不同。从表1可看出，在添加1.00~2.00
mg/L TDZ的培养基中，芽分化率分别为81.6%、85.3%
和84.5%，明显高于对照及其他两个处理；其丛生芽数
分别为3.5、4.3和3.7个/外植体。添加TDZ 1.50、2.00
mg/L两个处理的芽较粗短、畸形，其他处理的芽长势
正常。
在添加1.00、1.50、2.00 mg/L6-BA的培养基中，芽
分化率分别为30.6%、39.8%和42.5%，明显高于对照及
其他两个处理；这3个处理的丛生芽数分别为2.0、2.6
和3.1个/外植体。相比两种激素，以添加TDZ 0.50~
1.00 mg/L有利于葡萄柚上胚轴不定芽的诱导分化。
表 1 不同激素对不定芽诱导的影响
Tab.1 Effects of different hormones on induction of adventi-
tious bud
TDZ 0 0.0dC 0 -
0.25 35.2cD 2.1 芽正常
0.50 72.7bB 2.9 芽正常
1.00 81.6aA 3.5 芽正常
1.50 85.3aA 4.3 芽短粗，畸形
2.00 84.5aA 3.7 芽短粗，畸形
6-BA 0 0.00dD 0 _
0.25 11.4cC 0.6 芽正常
0.50 19.5bB 1.2 芽正常
1.00 30.6aA 2.0 芽正常
1.50 39.8aA 2.6 芽正常
2.00 42.5aA 3.1 芽正常
处理
Treatment
激素浓度
（mg/L）
Hormone
concentration
上胚轴
出芽率（%）
Rate of
adventitious
bud from
epicotyls
丛生芽
数量（个）
Amount of
adventitious
bud from
epicotyls
芽的状态
Status of
adventitious
bud from
epicotyls
同列不同大、小写字母表示在1%和5%水平上的差异显著性
Different capital and lower-case alphabets in different columns represent
significant difference at 1% and 5% level, respectively
图 2 葡萄柚上胚轴不定芽再生
Fig.2 Regeneration of adventious bud derived from epicotyls
2-A、2-C:添加1.00 mg/L TDZ的培养基 Adventitious buds in differentiation medium with 1.0 mg/L TDZ；2-B：添加1.00 mg/L 6-BA的培养基 Adven-
titious buds in differentiation medium with 1.0 mg/L 6-BA
2. 2不同激素对不定芽生根的影响
将上胚轴诱导分化获得的不定芽长成的枝条，切
下2~3 cm长转入添加ABT生根粉、IBA、NAA的生根
培养基中光下培养10 d左右，发现部分处理外植体枝
条切口有愈伤状细胞团产生，培养25 d后可观察到生
根现象。
从表2可看出，生根培养基中添加NAA 0.20~1.50
mg/L的处理枝条生根效果最差，枝条切口愈伤团不断
增大，但很少分化成根，最终生根率仅为20%~32%，且
4个处理之间无显著差异，平均生根数为1.0~1.3条，并
附带大量的愈伤团。在添加IBA培养基中，当IBA为
0.50 mg/L时，生根率极显著高于对照及其他3个处理，
达63.8%，平均生根条数为2.1条。当培养基中添加
ABT 6号，以1.00、1.50 mg/L处理的生根率均显著高于
对照与其他处理，分别为81.3%、76.1%，平均生根条数
分别为2.5、2.4条/外植体，两者间无显著差异。因此，
葡萄柚枝条生根培养以添加 ABT6号 1.00~1.50
mg/L为宜。
2-A
2-B 2-C
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南 方 农 业 学 报
表 2 不同生长调节剂对枝条生根的影响
Tab.2 Effects of different hormones on root induction of shoot
处理 NAA（mg/L） IBA（mg/L） ABT6号（mg/L）
Treatment 0 0.20 0.50 1.00 1.50 0 0.20 0.50 1.00 1.50 0 0.20 0.50 1.00 1.50
生根率（%） 0cC 20.0abA26.4abA 32.3 aA 28.8 abA 2.2dD 38.8bBC 63.8aA45.8bB 21.7cCD 2.2eD32.7dC 59.6cB81.3aA 76.1abA
Rooting rate
外植体生根数（条） 0 1.0 1.0 1.1 1.3 1.0 1.3 2.1 2.1 2.2 1.0 1.5 2.2 2.5 2.4
Amount of rooting per explant
同行数据后相同大、小写字母表示在1%和5%水平上差异不显著。下同
Different capital and lower-case alphabets represent significant difference at 1% and 5% level, respectively. The same was applied in the following tables
图 3 添加ABT 6号的生根培养基诱导的葡萄柚组培苗生根
Fig.3 Rooting of shoot in rooting medium with ABT 1.0 mg/L
2. 3不同抗菌素对葡萄柚上胚轴不定芽诱导的影响
及对农杆菌的抑菌效果
在转化研究中需加入一定量的抗菌素以抑制农
杆菌生长，抗菌素在抑制农杆菌生长的同时，对外植
体不定芽形成也会产生一定影响。因此，需确定抗菌
素的使用种类和用量对转化芽的再生影响程度。将与
农杆菌共培养后的外植体分别接种到含不同抑菌抗
生素培养基上培养7 d后，从表3可以看出，3种抗菌素
对外植体不定芽的影响不同。替门汀对外植体不定芽
诱导率无明显影响，不定芽诱导率均较高，且变化不
明显。头孢噻肟钠在300.00 mg/L以下时，对不定芽发
生无影响，当添加量达400.00~500.00 mg/L时，上胚轴
不定芽发生率明显下降，且少量外植体发黄。当培养
基中添加头孢曲松钠为0~200.00 mg/L时，不定芽发
生率无明显变化，300.00~500.00 mg/L时，不定芽发生
率明显下降。
对于农杆菌的控制情况，从表3可以看出，当培养
基中添加替门汀为300.00~500.00 mg/L时抑菌效果最
好，抑菌率达90%~100%；当头孢噻肟钠为400.00~
500.00 mg/L时，抑菌效果也较好，抑菌率可达93%~
98%；添加头孢曲松钠的抑菌效果最差，加入量
400.00~500.00 mg/L时，抑菌效果仅为70%左右。因此，
邓肯葡萄柚转化使用的抗菌素以替门汀为首选，头孢
噻肟钠次之，头孢曲松钠不宜采用。
表 3 不同抗菌素对葡萄柚上胚轴不定芽诱导率和对农杆菌抑菌率的影响
Tab.3 Effect of antibiotics on adventious bud induction of epicotyls and antibacterial rate of agrobacterium
处理 抗生素（mg/L）Antibiotics
Treatment 头孢噻肟钠 Cefotaxime sodium 替门汀 Timentin 头孢曲松钠 Ceftriaxone sodium
0 200.00 300.00 400.00 500.00 0 200.00 300.00 400.00 500.00 0 200.00 300.00 400.00 500.00
不定芽诱导率（%） 87.9aA87.1aA 84.4aA 75.8bB 73.1bB 86.5aA 84.9aA 87.6aA 87.4aA 85.0aA 85.8aA 81.7aAB 67.8bBC 62.7bC 62.8bC
Induction rate of
adventious bud
抑菌率 0dC 22.7cB 75.7bA 93.3abA 98.9aA 0cC 62.1bB 92.0aA100.0aA 100.0aA 0cB 0cB 16.9bB 66.3aA 77.5aA
Antibacterial rate
of antibiotics
2. 4转化芽选择培养过程中，不同暗培养时间对抗
性植株再生率的影响
邓肯葡萄柚上胚轴切段与农杆菌共培养3 d 后，
转至选择分化培养基中，在黑暗条件下培养一定时间
后移至光下继续培养。从图4可知，随着黑暗培养天数
的增加，大部分上胚轴片段颜色由浅黄转为白色，切
口部位细胞萎蔫或干枯，仅有少数上胚轴切口有抗性
芽产生。从表4可知，不同暗培养时间对转化抗性芽发
生率有较大的影响。共培养后直接于光下培养的处理
抗性芽产生率最低，仅为2.4%；暗培养5、7 d的抗性芽
产生率最高，分别为13.8%、12.6%，抗性芽生根率也分
别达到67.5%、59.7%。暗培养为10 d的处理，所产生的
抗性芽较低，且移至生根培养基后均死亡。
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表 4 不同暗培养时间对抗性芽再生的影响
Tab.4 Effect of darkness during early selection on antiadven-
tious bud
暗培养时间（d） 外植体数 抗性芽产生率（%） 抗性芽生根率（%）
Culture days Amount of Rate of Rooting rate
of darkness explants anti-bud of anti-bud
CK 300 0 0
0 695 2.4 4.0
3 680 7.8 48.4
5 750 13.8 67.5
7 780 12.6 59.7
10 720 3.5 0
图 4 葡萄柚转化芽再生过程
Fig.4 Regeneration of Kan anti-buds
2. 5抗性芽的PCR检测
培养所得的卡那霉素抗性无性系生根后，取叶片
提取DNA，以所设计的引物进行PCR检测，结果发现，
所检测的7个卡那霉素抗性植株，6株PCR扩增阳性，
未经转化处理的对照则无扩增带出现，说明PCR扩增
阳性植株为携带AFT基因的转化植株。
3 讨论
木本植物不定芽诱导较为困难，通常需要采用高
活性的细胞分裂素来诱导幼嫩的外植体，才有可能获
得较高的再生频率。一般认为，TDZ在苯基脲类化合
物中活性最强，其细胞分裂素活性比6-BA、KT等嘌
呤类化合物要高出许多倍（Landi et al.，2006；Husaini
and Abdin，2007），能使许多用其他激素难以再生的
植物，特别是木本植物，明显提高其再生能力。本研
究结果表明，对于葡萄柚上胚轴不定芽诱导，TDZ的
效果明显优于6-BA，但TDZ使用量不宜过高，当用量
达1.50 mg/L时，诱导的不定芽粗短，难于伸长；当TDZ
用量为2.00 mg/L时，所诱导的不定芽不仅粗短，而且
呈现水渍。生根粉ABT6号是一种复合型植物生长调
节，通常用于生根困难植株的扦插繁殖，它不但能补
充植物生根所需的外源生长素，而且对促进其内源
生长素的合成也具有一定的作用（苏雪枫等，2010）。
在本研究中，ABT生根粉对葡萄柚组培苗生根有较好
的诱导效果，且均优于NAA与IBA的诱导效果，其原
因可能是ABT在补充外源激素的同时促进了内源激
素如赤霉素、生长素的合成，至于其真正作用机理还
有待进一步研究探讨。
抗生素是植物基因转化中常用的杀菌剂和选择
剂，但对不同植物的影响不同（Lin et al.，1995）。农
杆菌侵染后，不同树种组培材料对不同抗生素的敏感
性存在明显的差异，这种差异直接影响转化芽的再生
(刘翠兰等，2010），本研究结果也证明了这一观点。在
转化植株选择培养过程中，首先要尽量创造条件使转
化细胞恢复生长，一定时间的暗培养有助于植物细胞
恢复生长（牛建新等，1999；赵珺等，2006），但光线又
是细胞形态建成所必须的因子，如果暗培养时间过
长，则不利于形态建成的发生，所以需针对具体植物
品种找到二者之间的平衡点。在本研究中，5~7 d的暗
培养有助于细胞恢复生长，进而有益于抗性芽的产
生，而暗培养时间过长，假抗性芽形成率高，间接导致
转化率下降。
4 结论
本研究通过筛选适宜不定芽诱导、生根培养和转
化等的植物生长调节剂、抗菌素、光照条件等因子，建
立了邓肯葡萄柚上胚轴植株再生繁殖体系，为其基因
转化奠定了基础。
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图 5 转化植株PCR检测结果
Fig.5 PCR detection result of Kan anti-plantlets
1~7：转基因植株样品 Transgenic plantlets；8：非转基因植株样品
Non-transgenic plantlet；9：质粒DNA Plasmids DNA；10：Marker
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1.1 kb
韩美丽等：农杆菌介导的葡萄柚转化再生体系建立研究 1085· ·
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（责任编辑 韦莉萍）
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