全 文 ：　收稿日期:2001-10-29　　　　作者简介:王声斌(1967-),男 , 讲师 ,博士.
文章编号:1001-411X(2002)02-0047-04
农杆菌法将抗菌肽 D基因导入蕉柑胚性细胞的研究
王声斌1 ,邹伟权1 ,余让才1 ,房师松2 ,黄自然2
(1 华南农业大学生命科学学院 , 广东 广州 510642;2 华南农业大学艺术设计学院 , 广东 广州 510642)
摘要:用农杆菌介导的方法成功地将抗菌肽 D 基因导入到蕉柑胚性悬浮细胞.再生芽经 PCR、Southern杂交证明抗
菌肽 D基因已整合到其基因组 DNA中.在农杆菌介导的蕉柑胚性悬浮细胞转化过程中 ,共培养介质中的乙酰丁香
酮(As)能显著提高其转化效率 ,与对照相比 , 每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数从 0提高到 0.75.悬
浮细胞与农杆菌共培养时间对转化效率也具有显著影响 , 共培养 1、2、3 d后 , 每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉
素细胞团数分别为 0.20 、0.75、0.
关键词:抗菌肽 D基因;柑橘;胚性细胞;遗传转化
中图分类号:Q785　　　　　　　文献标识码:A
　　柑橘在其生长过程中易受多种病害威胁 ,其中
一些病害至今仍无有效的防治措施 ,这一现状迫切
需要培育一些抗病品种应用于生产实践.柑橘原生
质体融合在育种上展现出了良好的发展前景 ,但目
前这一技术还有待完善.利用植物基因工程技术培
育抗病 柑 橘品 种 已有 一 些 较 成功 的 报 道 ,
Dominguez[ 1] 、陈善春[ 2] 等分别利用柑橘实生苗的茎
段和胚轴作为受体材料获得了转基因植株 ,但与其
他主要农作物相比 ,柑橘的遗传转化还相对落后.利
用柑橘的胚性细胞作为外源基因转化的受体材料成
功获得转基因植株的报道还较少 ,为此笔者在成功
诱导宽皮橘蕉柑胚性愈伤组织的基础上 ,将抗菌肽
基因导入其体内 ,对利用农杆菌介导的方法将外源
基因导入柑橘胚性细胞 ,培育抗病植株进行了积极
探索.
1　材料与方法
1.1　材料
蕉柑(Citrus reticulata var.tankan Hayata)胚性愈
伤组织 、胚性悬浮细胞 、含抗菌肽 D基因的农杆菌分
别系华南农业大学生物物理实验室诱导 、建立与保
存.
1.2　主要药品与试剂
TaqDNA 聚合酶 、溶菌酶 、RNase 、Hind Ⅲ 、DNA
marker、Tris 、SDS购自华美公司 ,Tryptone 、Yeast Extract
购自 Sigma 公司 ,麦芽提取物(ME)购自 Fluka 公司 ,
DIG DNA Labeling and Detection Kit购自 Boehringer 公
司 ,乙酰丁香酮(As)为中国科学院植物研究所陈大
华博士惠赠.其余试剂均为国产.
1.3　农杆菌的活化培养
挑农杆菌单菌落于 LBA(LB+Km 50 mg·L-1 +
Cm 25 mg·L-1 +Str 70 mg·L-1 +Spe 70 mg·L-1)液体
培养基中 ,28℃培养过夜 ,取 500 μL菌液于新鲜 LBA
或 LBA +As 200 μmol·L-1液体培养基中培养约 16 h ,
备用.
1.4　农杆菌转化蕉柑胚性悬浮细胞
取 1.3中活化培养的农杆菌菌液 1 mL 在波长
666 nm测定 D 666 nm值 ,按 D666 nm =1时相当于 2.773
×109 个/mL 估计农杆菌密度.5 000 r/min离心收集
菌体 ,用 LB液体培养基重新悬浮调整含菌量 ,同时
用滤纸过滤收集蕉柑胚性悬浮细胞.将农杆菌与蕉
柑胚性悬浮细胞按 108 个菌∶100 mg 细胞(每毫升共
培养介质)混合共培养 ,结束后 ,用滤纸过滤收集悬
浮细胞 ,转接到MT +羧苄青霉素 500 mg·L-1液体培
养基中培养 30 min杀死农杆菌.用滤纸过滤重新收
集悬浮细胞 ,无菌水反复冲洗后 ,转接到 MT +ME
500 mg·L-1固体培养基上进行恢复培养 1周 ,然后将
转化的蕉柑悬浮细胞继代到MT+ME 500 mg·L-1 +
Km 90 mg·L-1固体培养基上进行筛选培养.
1.5　转基因柑橘及胚性细胞的总 DNA提取
参照《基因工程技术实验指导》(华南农业大学
现代生物技术实验室基因工程实验分室编 ,1995 ,23
-26).
1.6　转基因柑橘的 PCR鉴定
根据抗菌肽基因序列设计 1对引物:
上游:Oligod(+)5 -ATG TGG AAT CCA TTC
第 23 卷 第 2 期　2002 年 4 月 　　　　　　 华南农业大学学报(自然科学版)Journal of South China Agricultural University(Natural Science Edition)　　　　　　Vol.23 , No.2　Apr.2002
AAG GAA TTG -3 .
下游:Oligod(-)5 -TTA CTT AGC CAA GGC
AGT AGC TT-3 .
扩增参数:94℃,60 s;55℃,60 s;72℃,60 s;共完
成40个循环.
1.7　转基因柑橘的 southern blot鉴定
参照 DIG kit说明书进行.
2　结果与分析
2.1　影响农杆菌法转化效率的因素
2.1.1 　As对农杆菌转化蕉柑胚性悬浮细胞的影响
　农杆菌转化蕉柑胚性悬浮细胞后 ,胚性悬浮细胞
在筛选培养过程中有自发体胚的形成 ,称之为抗性
胚状体(图 1).表 1结果显示 ,共培养介质中的乙酰
丁香酮(As)可以明显促进农杆菌转化蕉柑胚性悬浮
细胞后的抗卡那霉素细胞团与胚状体形成.在含As
的共培养介质中 ,每克蕉柑胚性悬浮细胞经筛选培
养后可形成 0.75个抗卡那霉素细胞团及 4.25个抗
性胚状体 ,而在不含 As的共培养介质中 ,每克蕉柑
胚性悬浮细胞经筛选培养后仅能产生 1.5个抗性胚
状体 ,而没有抗性细胞团的形成.
表 1　As对农杆菌转化蕉柑胚性悬浮细胞的影响
Tab.1　Effect of As on Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation of citrus embryonic suspension cells
共培养介质
co-culture
medium
抗性细胞团数
/(个·g-1)
clones resistant to Km
/(amounts·g-1)
抗性胚状体数
/(个·g -1)
embryoids resistant to Km
/(amounts·g-1)
MT 0.00 1.50
MT+
As 200 μmol·L-1 0.75 4.25
　 农杆菌在 LB+As 200μmol·L-1液体培养基中培养活化
图 1　农杆菌转化蕉柑胚性悬浮细胞后胚状体的自发发生
Fig.1　Formation of emryoids after Agrobacterium tumefaciens medi-
ated transformation of citrus embryonic suspension cells
2.1.2　共培养时间对农杆菌转化蕉柑胚性悬浮细
胞的影响　表 2显示 ,共培养时间对农杆菌转化蕉
柑胚性悬浮细胞后的抗卡那霉素细胞团与胚状体的
形成具有显著影响.共培养时间从 1 d提高到 2 d ,
每克胚性悬浮细胞形成的抗卡那霉素细胞团数与胚
状体数都有明显提高 ,延长到 3 d后 ,每克蕉柑胚性
悬浮细胞产生的抗性胚状体数虽从 4.25个增加到
12.50个 ,但没有抗卡那霉素细胞团的形成.
表 2　共培养时间对农杆菌转化蕉柑胚性悬浮细胞的影响1)
Tab.2　Effect of co-culture time on Agrobacterium tumefaciens-
mediated transformation of citrus embryonic suspension cells
共培养时间
co-culture
time/ d
抗性细胞团数/(个·g-1)
clones resistant to Km/(amounts·g-1)
抗性胚状体数/(个·g-1)
embryoids resistant to Km/(amounts·g -1)
1 0.20 0.60
2 0.75 4.25
3 0.00 12.50
　1)农杆菌在 LB+As200μmol·L-1液体培养基中培养活化
2.2　抗卡那霉素细胞团的 PCR鉴定
以上述筛选培养获得的 4块抗卡那霉素细胞团
为材料 ,分别抽取总 DNA ,进行 PCR扩增 ,电泳结果
如图 2.
1 含抗菌肽 D 基因质粒 DNA;2 PCR Marker(λDNA/ Hind Ⅲ);
3 , 4 抗卡那霉素细胞团总 DNA;5 对照
1 plasmid DNA:2 PCRMarker(λDNA/ Hind Ⅲ);3 , 4 total DNA of
cells resistant to Km;5 CK
图 2　蕉柑抗卡那霉素细胞团的 PCR鉴定
Fig.2　PCR analysis of citrus cells resistant to Km
　　PCR产物的电泳结果显示 ,以抗卡那霉素细胞
团总 DNA为模板 ,可以扩增到一条 120 bp左右的特
异带(图 2).此条带在电泳图片上的位置与以含抗
菌肽 D 基因的质粒 DNA 为模板扩增到的特异带位
置一致 ,从条带的大小和电泳位置可以判断此条带
是一条抗菌肽 D基因的电泳条带.在总共 4个抗卡
48　　 华　南　农　业　大　学　学　报　(自　然　科　学　版) 第 23 卷
那霉素细胞团的 PCR鉴定中 ,有 2个抗卡那霉素细
胞团的 PCR鉴定呈阳性.以上结果可以初步说明通
过抗性筛选获得的这 2个抗卡那霉素细胞团均含有
抗菌肽D 基因.
2.3　抗性芽的 PCR鉴定
上述经PCR鉴定为阳性的抗卡那霉素细胞团可
成功地诱导出胚状体及芽 ,称之为抗性芽(图 3).将
获得的抗性芽切下 ,分别抽取总 DNA ,进行 PCR扩
增 ,电泳结果如图 4.
图4的电泳结果显示 ,以抗性芽总DNA为模板 ,
可以扩增到 1条 120 bp左右的特异带.此条带在电
泳图片上的位置与以含抗菌肽 D 基因的质粒 DNA
为模板扩增到的特异带位置一致 ,从条带的大小和
电泳位置可以判断此条带是一条抗菌肽 D 基因的电
泳条带.以上结果可以初步说明抗性芽的基因组
DNA中含有抗菌肽 D基因.
图 3　蕉柑抗卡那霉素细胞团诱导的芽
Fig.3　Induction of shoots from embryonic cells resistant to Km
1 PCR Marker(λDNA/ Hind Ⅲ);2 含抗菌肽 D基因质粒 DNA;
3 , 4 抗性芽的总 DNA;5 对照
1 PCRMarker(λDNA/ Hind Ⅲ);2 plasmid DNA;3 , 4 total DNA of
regenerated shoots;5 CK
图 4　蕉柑抗卡那霉素再生芽的 PCR鉴定
Fig.4　PCR analysis of transgenic citrus
2.4　抗性芽的 Southern杂交鉴定
用上述3个抗性芽的抗菌肽 D基因 PCR产物进
行Southern杂交 ,结果如图 5.
1 含抗菌肽 D基因的质粒 DNA;2 对照;3 , 4 , 5 抗性芽的抗菌
肽 D基因 PCR产物
1 Plasmid DNA;2 CK;3 , 4 , 5 PCR products of transgenic citrus
图 5　蕉柑抗性芽的抗菌肽 D基因 PCR产物 Southern 杂交
Fig.5　Southern analysis of PCR products of transgenic citrus
　　图 5结果显示 ,3个抗性芽的抗菌肽 D基因 PCR
产物经 Southern 杂交都呈阳性.此结果再次证明抗
菌肽 D基因已整合到抗性芽的基因组 DNA中.
3　讨论
乙酰丁香酮(As)作为一种主要的植物创伤信号
分子 , 能显著地诱导农杆菌的毒基因表达.Ver-
nade[ 3] 、Winans[ 4] 、Liu[ 5]等对此都有详细的报道.目
前As已被广泛用于农杆菌介导的植物遗传转化 ,以
提高转化效率.刘明志[ 6] 、Cheng[ 7] 、Cruz -Hernan-
dez
[ 8] 、Gonzalez[ 9]等在进行农杆菌介导的胡萝卜悬浮
细胞 、小麦胚性愈伤组织 、鳄梨愈伤组织 、木薯胚性
悬浮细胞转化中都采用了 As ,取得了显著的效果.
本试验在用农杆菌介导的方法转化蕉柑胚性悬浮细
胞时也发现 ,共培养介质中添加 As可显著提高抗卡
那霉素细胞团的形成数 ,对进一步获得转基因的蕉
柑再生苗 ,转化过程中添加As是非常必要的.
Roberta[ 10]认为 ,农杆菌与受体材料共培养时间
过短会造成 T-DNA转移过程不能完成 ,而共培养
时间过长则会由于农杆菌的旺盛生长导致植物材料
受到伤害引起植株不能再生.本试验在农杆菌转化
蕉柑胚性悬浮细胞时也发现共培养时间对转化效率
具有显著影响.就本试验而言 ,农杆菌与蕉柑胚性悬
浮细胞共培养的时间为 2 d 较适宜.刘明志[ 6]在用
As活化的农杆菌转化胡萝卜悬浮细胞时指出共培养
时间为 3 d较合适 ,可见不同作物转化试验中的最佳
共培养时间存在差异.
本试验还发现 ,经农杆菌转化后的蕉柑胚性悬
49第 2期 王声斌等:农杆菌法将抗菌肽 D基因导入蕉柑胚性细胞的研究 　　　
浮细胞在筛选培养过程中有体胚自发发生的现象 ,
而且共培养时间越长 ,自发形成的体胚数目越多.这
一现象在其他研究者的报道中较少见 ,推测可能是
由于共培养过程中农杆菌的旺盛生长造成了某种逆
境导致蕉柑胚性细胞的体胚自发发生.
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Agrobacterium tumefaciens -Mediated Transformation
of Citrus Embryonic Cells
WANG Sheng-bin1 ,ZOU Wei-quan1 ,YU Rang-cai1 ,FANG Sheng-song2 ,HUANG Zi-ran2
(1 College of Life Science , South China Agric.Univ., Guangzhou 510642 , China;
2 College of Art Design , South China Agric.Univ., Guangzhou 510642 , China)
Abstract:Two clones resistant to kanamycine were obtained inMT+Km 90 mg·L-1 medium from citrus embryonic cell
suspensions after Agrobacterium tumefanciens -mediated transformation.Several shoots regenerated from these clones re-
sistant to kanamycine(90 mg·L-1).Integration of cecropin D gene into these shoots genome was confirmed by PCR and
Southern blot.The efficiency of transformation was markedly increased by co-cultivation of citrus embryonic cells with
Agrobacterium tumefanciens that was induced with 200 μmol·L-1 Acetosyringone(As).More clones resistant to
kanamycine(90 mg·L-1)were obtained by the treatment of 2 days co-cultivation of citrus embryonic cells with A-
grobacterium tumefanciens.
Key words:cecropin D gene;citrus;embryonic cells;genetic transformation
【责任编辑　柴　焰】
50　　 华　南　农　业　大　学　学　报　(自　然　科　学　版) 第 23 卷