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瓯柑微芽嫁接脱毒及试管苗的快速培育技术



全 文 :收稿日期:2006-07-31
*教育部创新团队项目(IRT0548)和浙江省丽水市林业科学研究所瓯柑脱毒横向课题资助
姜 玲 ,女 , 1964年生 ,博士 ,教授. 工作单位:华中农业大学园艺林学学院 ,武汉 430070
瓯柑微芽嫁接脱毒及试管苗的快速培育技术*
姜 玲1) 陈泽雄1) 徐象华2) 邓秀新1)
(1)华中农业大学园艺林学学院 /国家果树种质资源室内脱毒保存中心 ,武汉 430070;
2)浙江省丽水市林业科学研究所 ,丽水 323000)
摘要 研究了不同大小的瓯柑茎尖分生组织进行微芽嫁接脱除黄龙病病原的效果。在双目实体显微镜下 ,
分别切取含有生长锥及 1、2、3 和 4 个叶原基的茎尖分生组织嫁接到黄化砧木上 , 以获得茎尖微芽嫁接苗 , 用
PCR进行黄龙病分子检测。试验表明:用含 1 个和 2 个叶原基的茎尖嫁接获得的试管苗全部不带病毒;含有 3
个和 4 个叶原基的茎尖嫁接获得的试管苗其脱毒率分别为 95. 7%和 73%, 感病母株和长春花阳性对照可以扩
增出 535 bp 的特异性片段;尽管在含 2个叶原基条件下获得的 STG 成活率为 47. 7%,但可以达到理想的脱毒
效果。试验还证明 ,瓯柑二次嫁接与茎尖嫁接直接移栽苗的生长量差异极显著。
关键词 瓯柑;茎尖微芽嫁接;多聚酶链式反应;二次嫁接法
中图法分类号 S 666. 1;S 603. 6  文献标识码 A   文章编号 1000-2421(2007)02-0233-04
  瓯柑(Citrus suav issima Hort ex Tanaka)是浙江
省温州市特有的耐贮性优良品种 ,贮藏期限可达 250
余天 ,但柑桔黄龙病的为害严重阻碍了瓯柑的发展 。
欧美各国早在 20世纪世纪 80年代 ,就开始系
统地研究各类果树的脱毒技术和病毒检测方法 ,获
得了一大批无病毒苗木 。20世纪 90年代以来 ,又
着重开展了果树良种繁育体系的建立 ,推行果树无
病毒化栽培。20 世纪 90 年代美国柑橘增产五成 ,
一个重要的原因是定植无病毒苗木 。
随着国际国内柑橘市场的变化 ,许多优良地方
品种和引进的优良品种需要扩大繁殖 ,但通常从
S TG脱毒到提供健康接穗需要 1. 5 ~ 2 a的时间 ,茎
尖微芽嫁接缓苗期长 ,生长慢的问题制约了新品种
的推广和应用。采用茎尖微芽嫁接脱除黄龙病病原
已证明是获得无病毒苗木的有效方法[ 1] ,所取茎尖
的大小对脱毒效果和嫁接成活率有着明显的影响 。
针对黄龙病脱毒技术并没有相关的详细资料可寻 。
本试验旨在利用 PCR分子检测手段 ,分析确定
茎尖微芽嫁接时 ,脱除柑橘黄龙病所需的最适茎尖
大小 ,从而协调好提高脱毒率与提高嫁接成活率之
间的矛盾 。同时 ,为了加快无病毒苗生长速度 ,满足
市场规模化生产的需要 ,本课题就加速试管苗生长
技术进行了研究 。
1 材料与方法
1. 1 带病母本和阳性对照的准备
从浙江省丽水市林业科学研究所提供的 2 a 生
瓯柑苗木上 ,采得叶片样品 ,经液氮处理后 ,贮存在
- 70 ℃超低温冰箱中。从福建省农业科学院采集
接种了经鉴定的黄龙病病原 ,并表现出黄化斑驳症
状的长春花叶片作阳性对照。
1. 2 砧木准备
冰糖橙(C.sinensis Osbeck )作过渡性砧木。取
新鲜种子经去果胶处理后 ,移到超净工作台上 ,进行
常规消毒处理 。去种皮后 ,将种子接种到 MT 培养
基中 ,在(26±1) ℃,暗培养 2 周 ,获得黄化苗用作
嫁接砧木 。
1. 3 接穗的采集及茎尖微芽嫁接
当新梢长至 1 ~ 2 cm 时 ,采嫩芽作接穗。表面
消毒后 ,在双目实体显微镜下 , 剥取含有生长锥及
1 、2 、3 、4个叶原基的不同大小的茎尖分别进行微芽
嫁接 ,嫁接操作根据文献[ 2]进行。每种大小的茎尖
嫁接 60个 ,分多次进行 ,嫁接速度为 20 ~ 25芽 /h ,每
次约需 1 h。嫁接成活后 ,及时除萌 ,待试管苗长出真
叶 ,叶片长约 2 cm 时 ,将试管苗移入无菌培养土中。
待试管苗长出4 ~ 6片叶时 ,取样作黄龙病病原检测。
第 26卷 第 2期
2007 年 4 月
华 中 农 业 大 学 学 报
Journal of Huazhong Ag ricultural Univ ersity
Vo l. 26 No . 2
Apr. 2007 , 233~ 236
DOI牶牨牥牣牨牫牫牥牥牤j牣cnki牣hnlkxb牣牪牥牥牱牣牥牪牣牥牪牨
1. 4 样品 DNA的提取及黄龙病的 PCR分析
根据文献[ 3]提取脱毒前后样品及对照样品中的
DNA ,在 Ultrospec 2100 pro UV /Visible Spectropho-
tometer 上测定 DNA 浓度 , 并将其浓度稀释为
500 ng /μL ,待 PCR检测用。根据 VILLECHAMOUX
等[ 4] 的报道 ,设计黄龙病亚州株系特异性引物 ,用于
PCR试验。引物由上海生工生物技术公司合成 ,引物
序列为:①(+) 5′-TGAATTCTTCGAGGTTGGT-
GAGC-3′;②(-) 5′-AGAATTCGACTTAATCCCCAC-
CT -3′。PCR 扩增反应在 PTC-100 Peltier Thermal
Cycler(MJ Research)热循环仪中进行。采用 TaKaRa
PCR Kit进行 PCR反应 ,参考说明书中基本操作进
行试验。经试验采用的最佳扩增条件为:94 ℃开始
变性 5 min ,接着 , 94 ℃变性30 s , 56 ℃退火 30 s ,
72 ℃延伸 1 min , 进行 33 个循环 , 72 ℃再延伸
7 min。PCR扩增产物经 2%的琼脂糖凝胶(Mer-
sco),在 70 V 电压下电泳 50 min ,溴乙淀染色 ,然后
在凝胶成像系统中观察。
1. 5 二次嫁接技术
准备生长健壮的枳橙砧木 ,砧木离地 10 cm 处
干茎约为 0. 8 ~ 1. 2 cm 为宜 。在离地面 10 ~ 20 cm
处剪去上部枝梢 ,在垂直方向切一长度为1. 5 cm 的
切口 。当试管苗移栽成活 ,生长 2个月时 ,用锋利的
手术刀将试管苗砧木处削成契形 , 切面长约
1. 5 cm ,将试管苗靠一边形成层对齐 ,用塑料带梆
紧 ,用塑料袋将嫁接口以上部分套袋 ,保湿。以上操
作在气温为 25 ~ 30 ℃条件下进行 。
2 结果与分析
2. 1 茎尖大小对微芽嫁接脱毒苗成活率的影响
利用带有明显黄化斑驳症状的母本植株进行茎
尖嫁接试验 ,结果表明:茎尖大小对茎尖微芽嫁接的
成活率有明显的影响 。当茎尖含 1个叶原基时 ,成
活率最低 ,为 11. 1%,当茎尖含 2个叶原基时 ,成活
率为 47. 7%,茎尖含 3个和 4 个叶原基时 ,嫁接成
活率分别为 62. 2%和 78. 8%(表 1)。观察发现 ,嫁
接后 1周 ,很容易判断砧穗是否愈合 ,如果没有成
活 ,茎尖会变成褐色或枯萎的点状物 ,应立刻去除 。
如果不去除 ,因伤口刺激嫁接口很容易产生萌蘖 ,当
苗继续生长时 ,难以辨别是真正的接穗愈合还是萌
蘖产生。有少数情况是茎尖既不枯萎也不继续生
长 ,这种类型的试管苗到 3 ~ 4周时 ,芽如果还不能
迅速抽出 ,就没有利用价值。据观察 ,嫁接成活 1 ~
2周时 ,茎尖叶原基的多少与试管苗的叶子数是相
符合的(图 1)。当生成锥继续生成 2 ~ 3周时 ,中心
也会形成新的小嫩叶。方差分析结果表明:4 种情
况下的嫁接成活率均存在着显著差异 ,而含 1和 2
个叶原基与含 4 个叶原基的脱毒率差异极显著
(P<0. 01),与含 3 个叶原基的脱毒率比较差异不
显著(表 1)。
表 1 茎尖大小对微芽嫁接成活率和 PCR检测的脱毒率的影响1)
Table 1 Effect of shoot-tip size on survival rate of STG and pathogen-eradication rate by PCR
内容 Content
茎尖大小 Size of th e shoot-tip
1个叶原基
1 prim ordium
2个叶原基
2 p rim ordia
3个叶原基
3 primordia
4个叶原基
4 primordia
嫁接成活率 Survive rate of STG /% 11. 1 A 47. 7 B 62. 2 C 78. 8 D
PCR检测的脱毒率 /%
Pathogen-eradication rate determined by PCR 100. 0 A 100. 0 A 95. 7 AB 73. 0 B
 1)同列数值后不同大写字母表示在 P<0. 01水平上有显著差异 T he di fferent capital let ters behind the f igures in the same column indica-
t ed the signifi cant dif ferences at P<0. 01 level.
2. 2 茎尖大小对脱毒效果的影响
对不同大小茎尖微芽嫁接成活的试管苗进行黄
龙病 PCR检测 ,结果表明:当茎尖含有 1个叶原基
和 2个叶原基时 ,全部被检测样品均未扩增出黄龙
病特异性片段 ,而阳性对照和瓯柑母本植株可以扩
增出特征片段 ,用 2%的凝胶电泳 ,在凝胶成像系统
中可以观察到约 535 bp长的带 。茎尖含有 3 个叶
原基嫁接获得的样品 ,可以检出 4. 3%的带毒率 ,茎
尖含有 4个叶原基嫁接获得的样品 ,可以检出 27%
的带毒率(见表 1和图 2),由此可见 ,随着茎尖的增
大 ,带病毒的机率是增加的。在进行 STG脱除黄龙
病的工作时 ,在熟练的嫁接操作条件下 ,含有 2个叶
原基的茎尖嫁接成活率为 47. 7%,但能完全将病毒
脱掉 ,当茎尖更大时 ,尽管茎尖嫁接成活率明显提
高 ,但不能完全彻底地脱除病毒。由此可见 ,剥取适
宜大小的茎尖分生组织用于 S TG 是保证良好的脱
毒效果的关键 。
2. 3 二次嫁接可促进试管苗快速生长
二次嫁接试验表明 ,茎尖微芽嫁接苗移栽 2个
月时 ,试管苗总长度平均为 16 cm(图 3-a),可用作
234    华 中 农 业 大 学 学 报 第 26 卷 
图 1 茎尖微芽嫁接脱除瓯柑黄龙病病原物
Fig. 1 Shoot-tip grafting to eradicating the pathogen
of Citrus Yel low Shoot in Wenchow Mandar in
 1. 母本植株上表现黄化斑驳症状 Yel low and mot tle sym ptom s on
th e leaves of th e maternal plan t;
 2. 冰糖橙实生黄化苗作过渡性砧木 E tiolated seedlings of C.
sinensi s Osbeck , as t ransi ti on al stock for shoot-t ip graf t ing;
 3. 茎尖微芽嫁接苗移栽成活 T he su rvival condit ions of S TG tub e
plan t;
 4~ 7.分别带有 1、2 、3和 4个叶原基的微芽嫁接试管苗 The grafted
tube plants using shoot-tip with 1 ,2 ,3 or 4 leaf primordia individually
图 2 瓯柑 STG苗黄龙病病原的 PCR检测
Fig. 2 PCR determination for Citrus Yellow Shoot in the
STG plantlets of Wenchow Mandarin
 1. 标样DL2000(从上到下为 2 000, 1 000 , 750, 500 , 250 , 100bp) 
DL Marker 2 000(up to daw n:2 000 , 1 000 , 750 , 500 , 250 , 100 bp);
 2. 用 TaKaRa Taq TM kit 扩增的 500 bp标准片段 500 bp standard
cam e f rom PCR amplif ication f ragmen t w ith TaKaRa T aqT M ki t;
 3 , 4. DNA 从感染黄龙病病原的长春化叶脉的标样中提取 , PCR
可扩增出 535 bp的特征片段 Posit ive cont rol , DNA w as ext racted
f rom the infectiou s Madagascar periw ink le (Ca tharan thu s roseus G.
Don) leaves , w ith specifi c ampli fied 535 bp f ragment;
 5. 瓯柑母本植株 , PCR可扩增出 535 bp的特征片段 The infectious
maternal plant of Wenchow Mandarin, with specific amplified f ragment;
 6~ 9.茎尖分别含 1 、2 、3和 4个叶原基进行微芽嫁接 ,没有扩增出
特征片段 STG Seedlings w ith 1 , 2 , 3 and 4 leaf p rimordia , w ithout
speci fic amplif ied f ragm en t;
 10. 健康对照 T he heal thy , negat ive con t rol
接穗进行二次嫁接 ,嫁接时 ,在过渡砧木上切成契型
斜面 ,其面积比直接在接穗上切的面积大 ,以便于愈
合。由于接穗上保留了叶片 ,用套袋的方法保湿 ,嫁
接后约 10 d即可愈合 ,叶片可以进行光合作用 ,快
速恢复生长 。本试验二次嫁接了 35株 S TG 苗 ,早
上 7:00 ~ 9:00在网室中进行 ,操作分 3 次完成 ,成
活 32株 ,培养 12个月时 ,茎尖微芽嫁接接口以上枝
梢长度平均为 27. 1 cm , 32株对照植株的枝梢长度
平均为 19. 1 cm , 小样本平均数差异测验(t测验)
表明 ,瓯柑二次嫁接与茎尖嫁接苗直接移栽比较 ,其
接穗长度差异非常显著。图 3-b 为二次嫁接 10 d
时发出新芽 ,图 3-c 显示 ,从 S TG 开始 12个月时 ,
二次嫁接苗比 S TG 苗生长速度加快。
图 3 二次嫁接加速瓯柑茎尖微芽嫁接苗的生长
Fig. 3 The second time grafting accelerate the
growth of the STG plants
a. 移栽后生长 2 个月时的茎尖微芽嫁接 STG Plants of tw o
month old af ter t ransnat ional into soil;
b. 二次嫁接 10 d时 ,苗木成活 ,开始萌芽 Th e second tim e-graf-
ted plan t w as su rvived af ter 10 days;
c. 经过茎尖微芽嫁接和二次嫁接处理 , 12个月时苗木枝梢生长
健状(左),对照(右)生长缓慢 T he secon d time-graf ted plants grow-
in g for 12 months , the cont rol(right) plant grow slowly
3 讨 论
NAVARRO 等[ 5] 指出 , 0. 14 ~ 0. 16 mm 的茎
尖能有效地脱掉病毒 。对柑橘甜橙 、温州蜜柑品种
进行脱毒时 ,不能照搬前人的做法 ,因为含相同数目
的叶原基的柚类的茎尖比甜橙和温州蜜柑的茎尖大
2 ~ 3倍 ,有时需要将茎尖进行切分 ,保留生长锥和 1
到 2个叶原基用于微芽嫁接。在单纯用茎尖培养或
茎尖嫁接难以完全脱毒时 ,可以考虑用茎尖培养与
热处理或茎尖培养与化学处理的方法以结合 ,以达
到理想的脱毒效果。但不能排除上述方法照成的负
面影响[ 6-9] 。
本试验进一步说明 ,应该在保证理想的脱毒率
的前提下 ,注意获得尽可能高的成活率。本试验证
235 第 2 期 姜 玲等:瓯柑微芽嫁接脱毒及试管苗的快速培育技术  
明以切取含有生长锥和 2个叶原基的茎尖分生组织
用于 S TG 操作是达到理想的黄龙病脱毒效果的最
佳选择。
将移栽成活的试管苗迅速地嫁接到生长健状的
大砧木上 ,可以克服试验苗直接移栽缓苗期长的缺
点 ,二次嫁接苗生长迅速 ,长势明显好于对照 。当茎
尖微芽嫁接苗能提供 3 ~ 5片叶时 ,便可以进行病原
的 PCR分子检测 ,约需要 1 周的时间 。当 S TG 苗
被确定为健康植株时 ,需 1 a 时间就可以为有关单
位提供接穗 ,这样 ,提供接穗的时间比常规移栽的茎
尖嫁接苗早 6个月。
参 考 文 献
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Eradication Pathogen by Shoot Tip Grafting and Cultivating the Test
Tube Plantlets Rapidly in Wenchow Mandarin
JIANG Ling
1) CHEN Ze-xiong1) XU Xiang-hua2)  DENG Xiu-xin 1)
(1)College of Horticulture and Forestry , Huazhong Agricul tural Universi ty / Nat ional Indoor
Conservat ion Center o f Virus-f ree Gemp lasms o f Fruit Crops , Wuhan 430070 ,China;
2)
Lishui Forestry Insti tute , Zhej iang Province , Lishui 323000 , China)
Abstract The ef fect of shoot-tip size on eradica ting pathogen o f Cit rus Yellow Shoo t by shoot-t ip
graf ting (STG) was studied. With the binoculars and stereoscopic microscope , the meristem o f shoot-
tips containing g row ing cone and 1 , 2 , 3 o r 4 leaf primordia separately w ere graf ted on et iolated roo t-
stocks to obtain shoot-tip graf ted plantlets. A nd the pathogen o f Cit rus Yellow Shoot was dete rmined by
PCR technique. The resul ts indicated that tube plant lets g raf ted by shoo t-tips w ith 1 or 2 leaf promordia
were all pathogen-f ree , and that virus-eradication rate of tube plant le ts graf ted by shoo t-tips wi th 3 o r 4
leaf promordia w as 95. 7 and 73 percent separately . Specif ic f ragment o f 535 bp can be amplified f rom in-
fect ious mate rnal plants and the po sitive control , Madagascar Periw inkle (Catharanthus roseus G.
Don). Although the survival rate o f S TG w ith 2 promordia w as only 47. 7 percent , the effect of patho-
gen-e radication was perfect , and the second-time grafting facili tated the scions growth and there appeared ex-
traordinary distinctive difference betw een the second time-g rafted and direct transplanted STG plants by t test.
Keywords Citrus suavissima Hort ex Tanaka ;shoot-tip graf ting (STG);PCR;the second time grafting
(责任编辑:张志钰)
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