全 文 ：收稿日期:2010-01-04;　修订日期:2010-06-11
基金项目:国家自然科技资源共享平台项目子课题(No.2005DKA21000)
作者简介:卫莹芳(1945-),女(汉族),四川成都人 ,现任成都中医药大学
教授 ,主要从事中药品种 、质量及资源研究工作.
赤小豆总黄酮分光光度分析方法建立
及全国不同产地药材含量测定
卫莹芳 ,闫　婕 ,王化东 ,郭山山
(成都中医药大学药学院 ·中药材标准化教育部重点实验室 ,四川 成都　611137)
摘要:目的 建立一种测定赤小豆中总黄酮含量的方法 , 为赤小豆的质量控制提供科学依据。 方法 以芦丁为对照品 , 亚
硝酸钠 -硝酸铝比色法测定赤小豆总黄酮含量。结果 线性方程为 A=11.402C-0.004 9, 相关系数 r=0.999 9, 平均加
样回收率为 100.55%, RSD为 1.36%(n=6)。对全国 11个省的 37个不同产地的药材中总黄酮含量进行了测定 , 赤豆含
量为 0.76% ～ 1.31%,赤小豆含量为 0.84% ～ 1.30%。结论 该测定方法准确 ,重复性好 , 可用于赤小豆药材中总黄酮
的含量测定。
关键词:赤小豆;　赤豆;　总黄酮;　芦丁;　分光光度法
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.003
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)11-2729-03
UV-VISAnalysisMethodofTotalFlavonoidsinAdzukiBeanandDeterminationofDif-
ferentOriginHerbs
WEIYing-fang, YANJie, WANGHua-dong, GUOShan-shan
(ChengduUniversityofTCM, KeyLaboratoryofStandardizationofChineseCrudeDrugsoftheMinistryofEdu-
cation, Chengdu611137 , China)
Abstract:ObjectiveTodevelopaUV-VISanalysismethodforthedeterminationoftotalflavonoidsinadzukibean, inorderto
provideascientificbasisforthequalitycontrolofadzukibean.MethodsWithrutinasstandardsample, sodiumnitrite-alumi-
numnitratecolorimetricmethodwasusedtodeterminethecontentoftotalflavonoidsinadzukibean.ResultsThecalibrationcurve
ofrutinwasA=11.402C-0.004 9, r=0.999 9, andtheaveragerecoverywas100.55%, withRSDof1.36%(n=6).The
contentrangeoftotalflavonoidsinPhaseolusangulariswasfrom0.76%to1.31%, andcontentrangeinP.calcaratuswasfrom
0.84% to1.30%.ConclusionThisdeteminationmethodispractical, reproducibleandcanbeusedforevaluatingthequalityof
adzukibean.
Keywords:Adzukibean;　Totalflavonoids;　Rutin;　UV-VISspectrophotometry
　　赤小豆为豆科植物赤小豆 VignaumbeuataOhwietOhashi或
赤豆 VignaangularisOhwietOhashi的干燥成熟种子 ,具有利水消
肿 , 解毒排脓的功能 [ 1] 。
赤小豆既是常用中药 , 又是我国广泛食用的豆类。中国的赤
小豆资源极其丰富 ,是产量最多 , 出口量最大的国家。赤小豆始
载于《神农本草经》, 列为中品 ,其后历代本草 、医方亦多有记载。
现代药理研究表明 , 赤小豆具有抗氧化 、增强免疫 、抗菌 、雌激素
样作用等药理作用 , 广泛应用于临床治疗急性肾炎 、肝硬化腹水 、
水痘 、腮腺炎 、炎性外痔 、皮肤病等 [ 2]。 在中药材安全性被日益
关注的今天 , 其药食同源的优点使其备受青睐。
赤小豆主要含有五环三萜皂苷类 、黄酮类 、鞣质等化合物。
其黄酮类化合物具有较强的体外抗氧化作用 , 对 Fe2+导致的大
鼠原代肝细胞氧化损伤具有保护作用 , 是预防和治疗肿瘤 、肝病
等疾病的有效成分 [ 3] 。 《中国药典》现行版收载赤小豆质量标准
极不完善 , 缺乏内在质量量化指标。本文用亚硝酸钠 -硝酸铝显
色法建立赤小豆总黄酮含测方法 ,并对全国 11省 37个产地的赤
豆 、赤小豆总黄酮含量进行了测定 , 为完善制定赤小豆质量标准
奠定基础。
1　仪器与材料
1.1　材料 赤豆药材 29份 , 赤小豆药材 8份 ,由成都中医药大学
闫婕 、郭山山 、王化东等自采或购于全国 11个省区 , 经成都中医
药大学卫莹芳教授鉴定为豆科植物赤豆 VignaangularisOhwiet
Ohashi或赤小豆VignaumbeuataOhwietOhashi的干燥成熟种子。
1.2　仪器 UV-1100紫外 -可见分光光度仪(上海天美科学仪
器有限公司), DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有
限公司), KQ-3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司), BP121S电子天平(万分之一 Startorius德国赛多利斯股份公
司), BP211D电子天平(十万分之一 Startorius德国赛多利斯股份
公司)。
1.3　试药 芦丁对照品(批号:100080-200707,购自中国药品生
物制品检定所 ,供含量测定用);其他试剂均为市售分析纯。
2　方法与结果
2.1　显色方法及测定波长的选择 精密吸取芦丁对照品溶液和
供试品溶液适量 ,用亚硝酸钠 -硝酸铝显色法进行显色 , 以空白
试剂为对照 ,于 200 ～ 800 nm波长范围内进行扫描 ,在 500nm处
有最大吸收 ,故选 500nm为测定波长。见图 1。
2.2　对照品溶液的配制 取在 120℃干燥至恒重的芦丁对照品
25 mg, 精密称定 ,置 50ml量瓶中 ,加 70%乙醇适量 , 超声处理使
溶解 , 放冷 ,加 70%乙醇至刻度 ,摇匀 。精密量取 20 ml, 置 50 ml
量瓶中 ,加 70%乙醇至刻度 , 摇匀 , 即得每毫升中含无水芦丁
0.2 mg的芦丁对照品标准溶液。
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2.3　标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液 1, 2, 3, 4, 5, 6 ml,分
别置 25ml量瓶中 ,各加水至 6 ml, 加 5%亚硝酸钠溶液 1ml, 摇
匀 , 放置 6min,加 10%硝酸铝溶液 1ml,摇匀 , 放置 6min,加氢氧
化钠试液 10ml, 再加水至刻度 ,摇匀 , 放置 15 min,以相应试剂为
空白 , 在 500 nm波长处测定吸光度。以吸光度 A为纵坐标 , 浓度
C(mg/ml)为横坐标 , 绘制标准曲线。得到回归方程为 A=
11.402C-0.004 9, r=0.999 9, 芦丁在 0.008 184 ～ 0.049 104
mg/ml浓度范围内 , 吸光度与浓度呈良好线性关系。见图 2。
图 1　赤豆最大吸收波长光谱图
图 2　芦丁标准溶液标准曲线
2.4　精密度实验 精密吸取芦丁对照品溶液适量于具塞试管中 ,
平行 6份 , 按照 “ 2.3”项下方法显色测定吸光度。 测定结果的
RSD为 0.98%, 仪器的精密度较好。
2.5　稳定性实验 精密吸取芦丁对照品溶液适量于具塞试管中 ,
按照 “ 2.3”项下方法显色 , 显色后放置 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90,
120min后 , 吸光度分别为 0.487, 0.486, 0.484, 0.483, 0.480,
0.479, 0.475, 0.472。结果表明该显色反应在 5 ～ 120 min内较稳
定。
2.6　重复性实验 取同一批赤小豆样品约 1.0 g,平行 6份 ,精密
称定 , 按照 “ 2.3”项下方法显色测定吸光度。 6次重复试验的测
定结果平均值为 0.630, RSD为 1.39%,该方法有较好的重复性。
2.7　加样回收率实验 精密称取芦丁对照品 25.03 mg, 用 70%
乙醇定容于 50ml量瓶中备用。称取已知含量的赤豆粉末 0.5g,
平行 6份 , 精密称定 ,精确加入新制备的对照品溶液 5 ml, 混匀 ,
加入 70%乙醇 35 ml,水浴回流 1.5 h, 滤过 ,滤液转移置 50ml量
瓶中 , 加 70%乙醇至刻度 ,精密吸取 5 ml至 25 ml量瓶中 , 按照
“ 2.3”项下方法显色测定吸光度。结果见表 1。平均加样回收率
为 100.55%, RSD为 1.36%(n=6)。
表 1　加样回收率实验结果
编号 样品中总黄酮m/mg
对照品加入
量 m/mg
测得量
m/mg
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1 5.415 5.093 10.592 101.65
2 5.415 5.093 10.489 99.63
3 5.415 5.093 10.524 100.31 100.55 1.36
4 5.415 5.093 10.417 98.21
5 5.415 5.093 10.630 102.40
6 5.415 5.093 10.563 101.08
2.8　供试品溶液制备方法的选择
2.8.1　提取溶剂考察 取同一赤豆粉末约 1.0g, 平行 8份 , 精密
称定 , 分别加入 30%乙醇 , 50%乙醇 , 60%乙醇 , 70%乙醇 , 80%
乙醇 , 水 ,甲醇 , 40%甲醇各 25 ml,超声提取 20 min, 滤过 ,精密移
取滤液 3 ml, 按照 “ 2.3”项下方法显色测定吸光度。 结果(见
表 2)表明 , 采用不同提取溶剂 , 吸光度的差异较大 , 水和甲醇做
溶剂的吸光度极低 , 50%以下浓度的乙醇难以过滤。
2.8.2　溶剂用量考察 取同一赤豆粉末约 1 g,平行 4份 ,精密称
定 , 各加 8, 16, 25, 50倍量 70%乙醇 , 分别超声提取 20min,滤过 ,
精密移取滤液 5 ml, 按照 “ 2.3”项下方法显色测定吸光度。结果
表明 , 溶剂用量对吸光度有较大影响 , 随着溶剂用量的增加 ,吸光
度也相应增加。见表 3。
表 2　提取溶剂的考察结果
提取溶剂 吸光度(A)
30%乙醇 0.561
50%乙醇 0.629
60%乙醇 0.512
70%乙醇 0.448
80%乙醇 0.307
水 0.104
甲醇 0.128
　　n=3
表 3　溶剂用量的考察结果
溶剂用量 V/ml 吸光度(A)
8 0.347
16 0.466
25 0.508
50 0.597
n=3
2.8.3　提取方法考察 取同一赤豆粉末约 1 g,平行 2份 ,精密称
定 , 各加 25 ml70%乙醇 ,分别以超声 、回流提取 30 min, 滤过 , 精
密移取滤液 3 ml, 按照 “ 2.3”项下方法显色测定吸光度。吸光度
分别为 0.304, 0.611。结果表明 , 相同条件下 , 回流提取方法要
明显优于超声提取。
2.8.4　提取时间考察 取同一赤豆粉末约 1 g,平行 4份 ,精密称
定 , 各加 25 ml70%乙醇 ,分别以 80℃回流提取 30 min, 1, 1.5, 2
h,滤过 ,精密移取滤液 3 ml, 按照 “ 2.3”项下方法显色测定吸光
度。结果(见表 4)表明 ,提取时间为 0.5 h的吸光度最低。
表 4　提取时间的考察结果
回流时间 t/h 吸光度(A)
0.5 0.613
1 0.709
1.5 0.679
2 0.647
　　n=3
2.8.5　回流温度 取同一赤豆粉末约 1 g, 平行 4份 , 精密称定 ,
各加 25ml70%乙醇 , 分别在 60, 70, 80, 90℃水浴温度下回流 1
h,滤过 ,精密移取滤液 3 ml, 按照 “ 2.3”项下方法显色测定吸光
度。吸光度分别为 0.521, 0.576, 0.550, 0.530。结果表明 , 70 ～
80℃为最佳回流温度。
2.8.6　pH值 取同一赤豆粉末约 1 g,平行 4份 , 精密称定 ,各加
25 ml70%乙醇 ,分别调节 pH值到 6, 7, 8, 9, 10, 于 80℃水浴温度
下回流 1 h,滤过 , 精密移取滤液 3 ml, 按照 “ 2.3”项下方法显色
测定吸光度。吸光度分别为 0.579, 0.550, 0.571, 0.503。结果表
明 , 不同 pH值 , 对吸光度影响不大。
2.8.7　正交实验 根据单因素实验的结果 , 选择乙醇浓度(A)、
溶剂量(B)、提取时间(C)为 3个因素 , 每个因素选用 3个水平设
计 “乙醇回流提取因素水平表” ,见表 5。以用 L9(34)正交表任
意安排因素 ,作 3次重复实验。
取同一赤豆粉末约 1 g, 精密称定 , 置锥形瓶内 , 按因素水平
表及正交设计表进行乙醇回流提取 , 提取液过滤 ,滤液转移至 50
ml容量瓶中 , 加适当的溶剂至刻度 , 摇匀 , 作为供试品储备液。
精密量取储备液 5 ml, 置 25 ml容量瓶中 ,按照 “ 2.3”项下方法显
色测定吸光度。采用 SPSS15.0对试验结果进行正交设计试验分
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析 , 以确定最佳提取条件 ,结果见表 6。
表 5　乙醇回流提取因素水平
水平 A乙醇浓度(%)
B
溶剂量(倍)
C
提取时间t/h
1 60 15 1
2 70 25 1.5
3 80 35 2
表 6　乙醇回流提取正交设计及试验结果
试验号 A B C X 3次重复试验结果(A)Y1 Y2 Y3
1 1 1 1 1 0.279 0.294 0.301
2 1 2 2 2 0.356 0.367 0.373
3 1 3 3 3 0.381 0.370 0.384
4 2 1 2 2 0.325 0.329 0.323
5 2 2 3 1 0.402 0.402 0.404
6 2 3 1 2 0.420 0.418 0.432
7 3 1 3 2 0.293 0.284 0.306
8 3 2 1 3 0.332 0.330 0.349
9 3 3 2 1 0.397 0.373 0.413
K1 0.345 0.304 0.351
K2 0.384 0.368 0.362
K
3 0.342 0.399 0.358
R 0.042 0.095 0.011
　　K为每个因素某个水平所对应的实验指标的平均值 ,如 K
1
为每个因
素的水平为 1时所对应的吸光度的平均值 ,余同
R为所选因素 3个水平各试验指标数值的级差 , 即 K1 , K2 ,
K
3
中最大值与最小值之差 ,余同。
吸光度越大 , 黄酮的提取率就越高。方差分析表明 , 乙醇浓度
(A)、溶剂量(B)对黄酮提取率有极显著影响(P<0.01), 提取时
间(C)对黄酮提取率无显著影响(P>0.05)。 重复试验 P>
0.05,三次重复实验无显著差异。直观分析 R值表明 ,影响赤豆
提取率的主次因素分别为 B>A>C,最佳提取工艺是 A
2
B
3
C
2
,即
用 70%的乙醇 35ml, 回流提取 1.5h。
2.9　不同产地赤豆 、赤小豆样品中总黄酮的含量测定 取各个产
地的赤小豆及赤豆药材粉末约 1.0 g, 精密称定 , 置 250 ml锥形
瓶中 ,加 70%乙醇 35ml,于水浴温度 75℃回流提取 1.5h, 放冷 ,
过滤 , 滤液转移至 5 0ml量瓶中 , 加 70%乙醇至刻度 , 摇匀 , 作为
供试品储备液。精密量取 5 ml供试品储备液置 25 ml容量瓶中 ,
按照 “ 2.3”项下方法显色测定吸光度。根据标准曲线计算供试
品溶液总黄酮含量。结果见表 7。
3　讨论
总黄酮是赤小豆抗氧化 、预防各种慢性疾病的活性成分。本
文建立了亚硝酸钠 -硝酸铝显色法测定赤小豆药材中总黄酮的
含量的方法 , 并研究了赤小豆总黄酮的制备方法 , 对提取方式 、提
取溶剂 、溶剂用量等进行考察 , 最终确定提取条件为用 35倍量的
70%的乙醇 , 回流提取 1.5 h。方法学研究结果表明 ,该含量测定
方法准确度高 、重复性好 (RSD为 1.39%), 加样回收率为
100.55%, RSD为 1.36%。因此本方法可作为赤小豆总黄酮的
含量测定方法。
表 7　全国不同产地赤豆 、赤小豆总黄酮的含量 %
编号 来源 产地 采集方式 总黄酮含量
a-1 赤豆 山西省原平县沿沟乡 2008年自采 1.25
a-2 赤豆 山西省原平县崞阳镇 2008年自采 1.15
a-3 赤豆 山西省静乐县新村乡 2008年自采 1.16
a-4 赤豆 山西省平遥县西善乡 2008年自采 1.31
a-5 赤豆 山西省代县阳明堡镇 2008年自采 1.01
a-6 赤豆 陕西省富县张村驿镇 2008年自采 1.05
a-7 赤豆 陕西省富县北道德乡 2008年自采 1.09
a-8 赤豆 陕西省甘泉县道镇 2008年自采 1.24
a-9 赤豆 陕西省甘泉县劳山镇 2008年自采 1.05
a-10 赤豆 陕西省佳县方塌镇 2008年自采 1.27
a-11 赤豆 河北省景县温城乡 2008年自采 1.17
a-12 赤豆 河北省景县温城乡 2008年自采 0.86
a-13 赤豆 河北省沧州市旧州镇 2008年自采 0.96
a-14 赤豆 安徽省太和县双浮镇 2008年自采 1.28
a-15 赤豆 安徽省裕安区韩摆渡乡 2008年自采 1.17
a-16 赤豆 安徽省金安区中店乡 2008年自采 0.85
a-17 赤豆 河南省滑县城关镇 2008年自采 1.03
a-18 赤豆 河南省辉县常村镇 2008年自采 1.01
a-19 赤豆 河南省固始县蒋集镇 2008年自采 0.93
a-20 赤豆 山东省东明县 2008年自采 1.13
a-21 赤豆 云南省大理州巍山县 2008年自采 1.31
a-22 赤豆 河南购黑龙江佳木斯产商品 2008年购自新乡市 1.18
a-23 赤豆 河北省购东北产商品 2008年购自唐山市 1.26
a-24 赤豆 四川省购东北产商品 2008年购自荷花池药材市场 1.11
a-25 赤豆 云南省购商品 2008年购自菊花村药材市场 1.07
a-26 赤豆 山西省临汾市购商品 2008年购自临汾市 0.96
a-27 赤豆 山西省清徐县购商品 2008年购自清徐县 0.84
a-28 赤豆 山东省菏泽市购商品 2008年购自菏泽市 1.04
a-29 赤豆 四川省购德阳产商品 2008年购自荷花池药材市场 0.76
c-1 赤小豆贵州省黔东南苗族侗族自治区 2008年自采 0.84
c-2 赤小豆广西省巴马瑶族自治县凤凰乡 2008年自采 1.20
c-3 赤小豆 广西省东兰县三石镇 2008年自采 0.95
c-4 赤小豆 四川成都购泸州产商品 2008年购自荷花池药材市场 1.21
c-5 赤小豆 四川成都购彭州产商品 2008年购自荷花池药材市场 1.12
c-6 赤小豆 湖南省购商品 2008年购自永州市 0.97
c-7 赤小豆广西省购百色市田东县产商品 2008年购自南宁市 1.07
c-8 赤小豆 广东省购商品 2008年购自清平药材市场 1.30
　　n=3
全国 8省 , 29个产地赤豆样品中总黄酮的含量在 0.76% ～
1.31%,陕西省平遥县西善乡的总黄酮含量高于其他地区 , 达
1.31%,四川省荷花池药材市场购德阳产商品的含量最低 , 只有
0.76%。全国 5省 , 8个产地的赤小豆样品中总黄酮的含量在
0.84% ～ 1.30%, 购于清平药材市场的总黄酮含量最高 , 为
1.30%,贵州省黔东南苗族侗族自治区的含量最低 , 为 0.84%。
建议赤小豆药材总黄酮含量不得低于 0.80%。
当年自采的样品大多含量较高 , 商品药材有些含量偏低 , 是
否与商品药材贮藏时间久 , 虫蛀现象有关 , 值得深入研究。药用
赤小豆的贮藏方法及贮藏年限需要进一步加以规范。
参考文献:
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