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正交实验优选赤小豆萌芽工艺研究



全 文 :北方园艺2013(24):17~20 ·试验研究·
第一作者简介:任晗堃(1989-),男,硕士,研究方向为植物源化妆
品功效添加剂的开发。E-mail:hankun89@163.com.
责任作者:董银卯(1963-),男,硕士,教授,研究方向为植物源化妆
品功能成分研究与应用。E-mail:ymdong2008@163.com.
收稿日期:2013-09-09
正交实验优选赤小豆萌芽工艺研究
任 晗 堃,李   丽,董 银 卯,张 小 慧
(北京市植物资源重点实验室,北京工商大学 食品学院,北京100048)
  摘 要:以9个产地的赤小豆为试材,以代表抗过敏活性的透明质酸酶抑制率为指标,在产
地筛选的基础上,对光照、温度、水分3个因素通过L9(33)正交实验,以期优化赤小豆萌芽工艺条
件。结果表明:在无光照、温度30℃、浇灌次数3次/d的萌芽条件下,赤小豆提取物透明质酸酶抑
制率为(90.67±4.82)%。该试验工艺设计合理、结果可靠,为赤小豆萌芽抗敏功效研究提供了参
考依据。
关键词:赤小豆;萌芽工艺;抗敏活性;透明质酸酶抑制率;正交实验
中图分类号:S 521 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2013)24-0017-04
  赤小豆(Vigna umbelata)为豆科豇豆属1a生直立
草本植物赤小豆的种子。在全国各地应用广泛且有不
同的别称,如红豆、红小豆、猪肝赤等。原产亚洲热带地
区,朝鲜、日本、菲律宾及其他东南亚国家亦有栽培[1],目
前我国主要在浙江、江西、湖南、广东、广西、吉林等省区
(自治区)普遍栽培。赤小豆既是一种常用中药,又是我
国广泛食用的豆类,其性味甘酸、平、无毒,主要化学成
分为糖类、三萜皂苷、多酚等,具利水除湿、和血排脓、消
肿解毒等功效,主治水肿、脚气、黄疸、泻痢、便血、痈肿等
症[2]。邱明义等[3]研究表明,麻黄连翘赤小豆汤具有保
    
护肥大细胞,抑制组胺释放,从而抗I型变态反应的作
用。Cherng等[4]报道了赤小豆对人外周血单细胞(PB-
MC)具有免疫调节活性。
透明质酸酶是过敏反应的参与者,研究表明透明质
酸酶与炎症、过敏有强相关性,许多抗过敏药物有强抑
制透明质酸酶活性的作用[5-6]。众多研究表明,透明质
酸酶体外抑制试验常作为测定抗过敏活性的方法。抗
过敏活性以透明质酸酶抑制率为指标,透明质酸酶抑制
率越大则抗过敏活性越强。
我国是赤小豆的生产大国,但对赤小豆的功能特性
和开发加工缺乏完整系统的研究[7]。因此,该试验以抗
敏活性为指标,在赤小豆产地筛选的基础上,研究了其
优化萌芽工艺,对赤小豆的药理活性研究和开发利用具
有重要的意义


The Effects of Space Mutation Breeding on Variation of Field Characters of SP1Melon
WANG Yang-yang,HAN Yu,SHENG Yun-yan
(Colege of Agriculture,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing,Heilongjiang 163000)
Abstract:Using the spacecraft carrying melon varieties of HM1-3and its control CM1-3as the materials,ten indexes of the
diferent mutation strains of SP1generation after self polination,including fruit shape index,rate of female flowers,VC
content,hardness,acid contents and fruit weight,water content,sarcocarp thickness,sugar contents and leaf shape index
were analyzed,the main purpose was to looking for the positive advantageous variation of mutation.The results showed
that the leaf area,fruit weight,hardness,sarcocarp thickness,acid contents had significant variations,however VC
content,sugar contents,water content and fruit shape index did not showed significance variance;compared with CM1-3,
twenty-one plants of HM1-3had moderate variation,and rate of female flowers,fruit shape index,leaf area and fruit weight
of HM1-3-4had significance variance.
Key words:melon;spacecraft;fruit characters;analysis of variance
71
·试验研究· 北方园艺2013(24):17~20
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为产自吉林、湖南、江西、安徽、云南、浙
江、广西、广东、河北9个省的赤小豆样品。经北京市植
物资源重点实验室董银卯教授鉴定为豆科植物赤小豆
(Vigna umbelate Ohwi et Ohashi)的干燥成熟种子。
透明质酸酶(Sigma公司);透明质酸钠(Solarbio公
司,分析纯);甲醇、无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸、对1-2
甲氨基苯甲醛、冰乙酸、乙酸钠结晶、无水氯化钙、磷酸
氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠,均为北京化工厂生产,国
产分析纯;乙酰丙酮(国药集团化学试剂有限公司)。
MGC-250光照培养箱(天津市泰斯特仪器有限公
司),电子天平(TB-2002北京赛多利斯仪器系统有限公
司),DL-101-1BS电热鼓风干燥箱(天津市中环实验电炉
有限公司),FI-01620酶标仪(Thermo Science公司),超
声波清洗器(上海必能信超声有限公司),粉碎机(天津
市泰斯特仪器有限公司),HH·S1-M恒温水浴锅(北京
长安科学仪器厂),100~1 000μL/1 000~5 000μL移液
枪(Eppend of Reference)。
1.2 试验方法
1.2.1 不同产地赤小豆萌芽提取物抗敏活性考察 以
代表抗敏活性的透明质酸酶抑制率为抗敏活性考察标
准,对9个产地的赤小豆进行抗敏活性最佳产地的筛
选。样品预处理:挑选籽粒饱满、无虫蛀、无霉烂、无残
破的赤小豆作为试验原料,每10g赤小豆种子为1个试
验组;清水冲洗赤小豆,以0.1%的次氯酸钠溶液消毒;
赤小豆与去离子水比例为1∶3,置于26℃恒温培养箱中
浸泡30h,直至赤小豆壳破裂,进行萌芽试验,3次重复。
萌芽条件:将待萌芽赤小豆种子置于26℃恒温培养箱中
无光照培养4d,每12h去离子水浇灌1次。供试品溶
液制备:从培养箱中取出萌芽4d的豆芽,放入干燥箱,
50℃干燥24h;取出后粉碎机粉碎,过80目筛,装入塑封
袋,4℃保存待用。精密称取赤小豆粉末1.0g,分别加入
75%甲醇10mL,室温下超声提取60min,功率为100
W。离心后,取上清液待透明质酸酶体外抑制试验用。
1.2.2 赤小豆萌芽工艺的正交实验设计 在产地筛选
的基础上,以透明质酸酶抑制率作为考察指标,采用光
照、温度、水分进行L9(33)3因素3水平正交实验设计,
优化赤小豆抗敏活性的萌芽工艺条件,正交实验因素与
水平见表1。
1.2.3 赤小豆萌芽提取物验证试验  根据正交实验优
化的萌芽条件进行验证性试验。
1.3 项目测定
该试验透明质酸酶抑制率测定方法在Lee等[8]的
基础上,稍作改动。
  表1 赤小豆萌芽工艺正交实验因素与水平
  Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design of
Vigna umbellata
水平
Level
因素Factor
A光照
A Ilumination/h
B温度
B Temperature/℃
C水分
C Moisture/次·d-1
1  24  30  24
2  12  25  6
3  0  20  3
1.3.1 溶液配制 醋酸缓冲溶液(pH 5.6):量取1
155μL冰乙酸稀释至100mL混匀后取其中4.8mL为
A溶液,称取2.72g乙酸钠结晶加水溶解并定容至
100mL混匀后取其中45.2mL为B溶液,混合A、B溶
液,以水定容至100mL。精密测定其pH值,用溶液A
或B调至5.6即可。埃尔利希试剂(Ehrlich reagent):称
取2.4g对-2甲氨基苯甲醛溶于45mL浓盐酸和45mL
无水乙醇中,可保存2个月。乙酰丙酮溶液:取乙酰丙
酮3.5mL溶于50mL 1.0mol/L的碳酸钠溶液中,此溶
液在用前10min配制[9]。
1.3.2 操作步骤 取0.1mL 0.25mmol/L CaCl2 溶液
和0.5mL透明质酸酶液37℃保温培养20min;加入样
品液0.5mL,继续37℃保温培养20min;加入0.5mL
透明质酸纳液37℃保温30min,常温放置5min;加入
0.1mL 0.4mol/L NaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶
液,置沸水浴中加热15min后立即用冰水冷却5min;加
入埃尔利希试剂1.0mL并用3.0mL无水乙醇进行稀
释,放置20min显色,用酶标仪在555nm波长下测定其
吸光度。
1.3.3 透明质酸抑制酶抑制率计算 透明质酸酶抑制
率(100%)=
(A-B)-(C-D)
A-D ×100%
,式中:A为对照
溶液吸光度(用醋酸缓冲液代替样品溶液),B为对照空
白溶液吸光度(用醋酸缓冲液代替样品溶液及酶液),C
为试样溶液吸光度值,D为试样空白溶液吸光度(用醋
酸缓冲溶液代替酶液)。
1.4 数据分析
该试验采用了正交实验设计方法,数据分析采用
SPSS 17.0软件,标准差数据分析采用 Microsoft Excel
2007完成。
2 结果与分析
2.1 9种产地赤小豆透明质酸酶抑制率筛选
由图1可以看出,各产地赤小豆萌芽提取物均具有
一定的抗敏活性,这与《伤寒论》记载和现代药理研究结
果[10-12]相吻合。9种产地赤小豆萌芽抗敏效果分别为:
吉林(抑制率85.76%)>湖南(抑制率82.89%)>江西
(抑制率66.51%)>安徽(抑制率62.98%)>云南
(60.07%)>浙江(抑制率53.37%)>广西(抑制率
81
北方园艺2013(24):17~20 ·试验研究·
31.49%)>广东(抑制率28.45%)>河北(抑制率
27.55%),其1%甘草酸二钾(1%GD)为阳性对照。该试
验中,吉林产赤小豆萌芽提取物的抗敏活性相对较高,
其透明质酸酶抑制率较高。
图1 9个产地赤小豆萌芽提取物透明质酸酶抑制率
Fig.1 Hyaluronidase inhibition rate of Vignaumbellatasprout extracts from 9origin
2.2 赤小豆萌芽工艺优化
由表2可以看出,不同条件下赤小豆萌芽的透明质
酸酶抑制率差异较大,由直观分析可知,因素主次关系
顺序是A(光照)>C(水分)>B(温度),综合考虑各因素
对赤小豆萌芽抗敏功效的影响,确定萌芽最佳萌芽工艺
为A3B1C3,即光照0h,温度30℃,浇灌次数3次/d。
表2 赤小豆萌芽工艺L9(33)正交实验结果
  Table 2 Results of germination process of Vigna umbellata by
orthogonal test
因素
Factor
A光照
Ilumination
/h
B温度
Temperature
/℃
C水分
Water
/次·d-1
透明质酸酶抑制率
Hyaluronidase
inhibition/%
试验1Test 1  24  30  24  46.51
试验2Test 2  24  25  6  35.87
试验3Test 3  24  20  3  17.90
试验4Test 4  12  30  6  35.71
试验5Test 5  12  25  3  84.14
试验6Test 6  12  20  24  47.67
试验7Test 7  0  30  3  75.93
试验8Test 8  0  25  24  31.06
试验9Test 9  0  20  6  83.71
均值1Mean 1  33.427  52.717* 41.747
均值2Mean 2  55.840  50.357  51.763
均值3Mean 3  63.567* 49.760  59.323*
极差Range  30.140  2.957  17.576
最优水平
Optimal level
A3(0h) B1(30℃) C3(3次/d)
影响主次Influence  A光照>C水分>B温度
  注:*为最佳水平。
由图2可以看出,在无光照时,赤小豆萌芽的抗敏
活性较高,在全光照条件下,抗敏活性被显著抑制。光
照是一种重要的物理因素,能够影响初级和次级代谢产
物的生成[13]。借助于光形态发生学说[14],在全光照条
件下,光合作用不断增强,初级代谢旺盛,植株所吸收的
养分主要用于供给叶片的生长发育,而用于合成次级代
谢的底物的积累相对较少,即此阶段初级代谢占明显优
势,如多酚、皂苷等具有抗敏活性的次级代谢产物合成
少于避光条件,从而导致了抗敏活性的下降[15]。
图2 赤小豆萌芽工艺极差分析
Fig.2 Range analysis for hyaluronidase inhibition rate in
Vignaumbellatasprouts
温度对赤小豆萌芽抗敏活性影响不大,30℃条件下
抗敏活性相对较高,可能是因为赤小豆体内与抗敏活性
相关酶类的活性在此温度下最高。
水分以每天浇灌3次为宜,过多的浇灌可能导致赤
小豆萌芽中如多糖在内的抗敏活性物质经水提作用流
失,亦容易导致烂根等不利于植物正常生长的情况发
生,大量试验表明,适当的干旱胁迫可刺激植物产生防
御反应,激发次级代谢产物的合成,在植物防御反应过
程中,激活了苯丙氨酸解氨酶(PAL),PAL是苯丙烷类
代谢途径中的关键酶,促进了酚类物质、黄酮类等重要
植物次生代谢物质的合成,从而提高了赤小豆萌芽的抗
敏活性[16]。
正交实验的方差分析显示,因素A达到极显著水平
(P<0.01),因素C达到显著水平(P<0.05),表明A(光
照)、C(水分)为主要影响因素,与极差分析结果一致。
表3 赤小豆萌芽工艺方差分析
  Table 3 Analysis of variance of Vigna umbellata
方差来源
Variance
偏差平方和
DEVSQ
自由度
DOF
F比
Fratio
显著性
Significance
A  1 470.478  2  100.285 **
B  14.667  2  1.000
C  466.426  2  31.801 *
误差Error  14.67  2
  注:**表示在P<0.01水平上显著,*表示在P<0.05水平上显著。
91
·试验研究· 北方园艺2013(24):17~20
2.3 验证试验
根据上述方差分析结果中确定的萌芽条件
A3B1C3,即光照0h,温度30℃,浇灌次数3次/d进行验
证性试验。经体外透明质酸酶抑制试验检测,赤小豆萌
芽提取物抑制率为(90.67±4.82)%。
3 结论与讨论
赤小豆9种产地筛选结果表明,全国不同产地赤小
豆萌芽提取物抗敏活性存在一定差异,其原因可能与赤
小豆所处的自然环境以及种植方式等不同有关[17-18]。
该试验以萌芽提取物抗敏活性为参考依据,对全国9个
有代表性赤小豆产区进行筛选,最终确定吉林为赤小豆
萌芽最佳抗敏活性产地,为今后赤小豆萌芽抗敏活性研
究的原料选择提供了参考依据,也是对赤小豆地域分布
与生物活性关系研究的初步探索。
正交实验结果表明,综合考虑赤小豆萌芽时所需光
照、温度、水分对萌芽提取物抗敏活性影响的主次关系
是光照>水分>温度,最佳萌芽工艺为光照0h,温度
30℃,浇灌次数3次/d。由试验结果可以看出,不同萌
芽工艺下提取物的抗敏活性可相差72.77%。该试验以
萌芽提取物抗敏活性作为筛选标准,对萌芽工艺进行优
化,试验方法可靠,测定结果较能反映客观实际,为今后
赤小豆萌芽抗敏活性研究提供了参考依据。
该试验只考察了赤小豆萌芽第4天的抗敏活性,而
随着萌芽过程的进行,赤小豆萌芽抗敏活性是否会产生
变化,还有待开展进一步研究,即以初始萌发到萎蔫为
一个周期,考察赤小豆萌芽抗敏活性的变化规律,同时
确定周期中最佳抗敏功效萌芽天数,这将对赤小豆作为
抗敏、舒敏产品原料在食品、化妆品领域的应用提供坚
实的理论基础。同时,下一步工作将围绕考察赤小豆萌
芽过程中抗敏活性物质的种类及含量变化规律进行研
究,为赤小豆萌芽抗敏功效机理及抗敏活性物质代谢途
径的研究提供科学依据。
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Study on Optimization Technology of Vigna umbelata Germination by Orthogonal Test
REN Han-kun,LI Li,DONG Yin-mao,ZHANG Xiao-hui
(Colege of Food Science,Beijing Technology and Business University,Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development,
Beijing 100048)
Abstract:Taking 9origin of Vigna umbelataas materials,hyaluronidase inhibition rate that represent anti-alergic efect,
based on screening of origin,the factors of sunlight,temperature and moisture were investigated by L9(33)orthogonal
test,in order to optimize the technology for Vigna umbelata sprouts.The results showed that,under the conditions for
Vigna umbelata germination for at 30℃ with no ilumination and irrigation 3times/day,hyaluronidase inhibition rate
reached(90.67±4.82)%.The experiment method was reasonable and stable,could be provide reference for anti-alergic
activity extracted fromVigna umbelatasprouts.
Key words:Vigna umbelatasprouts;germination process;anti-alergic activity;hyaluronidase;orthogonal array design
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