全 文 ：收稿日期:2004 - 07 - 01　　修回日期:2004 - 09 -22
基金项目:校青年教师科研基金(03A03).
作者简介:马翠兰(1970 -),女 ,副教授 ,博士.研究方向:果树逆境生理生态.
盐胁迫对坪山柚 、福橘幼苗叶片蛋白质合成的影响
马翠兰 , 刘星辉 , 潘锦山 , 陈发兴 , 庄伟强
(福建农林大学园艺学院 ,福建 福州 350002)
摘要:以坪山柚和福橘幼苗为材料 ,研究不同浓度 NaC l胁迫 8 d后叶片中可溶性蛋白质的变化 .结果表明 ,盐胁迫下 , 坪山
柚和福橘幼苗叶片中可溶性蛋白质含量增加并随 NaC l浓度的增高而增至较高水平.相同浓度 N aC l胁迫下 , 坪山柚叶片可
溶性蛋白质含量增加幅度比福橘大 ,因此 , 可能是蛋白质的增加幅度而不是其绝对含量对坪山柚的耐盐性起作用. 十二烷
基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)图谱分析显示 ,盐胁迫后 , 分子质量为
80、67、54、 32、28、18、17和 16 ku蛋白质不受影响而稳定表达.福橘叶片中 80、67、 32、28、21、18、17、 16和 15 ku蛋白质为稳
定表达的蛋白质. 当 NaC l浓度≥40 mmo l L -1时 ,诱导坪山柚叶片新产生 35和 24 ku 2种蛋白质;当 NaC l浓度≥80 mmo l
L - 1时 , 诱导福橘叶片新产生 72、43和 24 ku 3种蛋白质 ,且它们的活性均随盐胁迫强度的增大而增强.
关键词:坪山柚;福橘;盐胁迫;可溶性蛋白质;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
中图分类号:S666. 3;S666. 2;Q946. 1 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2005)04-0450-04
E ffects of salt stress on the protein synthesis in seedlings ofC itrus grand isO sbeck and
C. reticu lata B lanco
MA Cu i-lan, LIU X ing-hu i, PAN Jin-shan, CHEN Fa-xing, ZHUANGW ei-qiang
(Co llege of Ho rticulture, Fujian Ag ricu ltu re and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, Ch ina)
Abstrac t:Change s of so lub le prote in in leaves o fCitrus grand isO sbeck cv. P ingshanyou andC. reticulata B lanco cv. Fu ju seed-
ling s we re stud ied under different NaC l concentra tion stre ss fo r e igh t day s. The results show ed that the contents of solub le pro te in in
leaves of P ingshanyou and Fuju seed lings increased under NaC l stre ss, and the contents reached a highe r leve l w ith the inc rease in
the concentra tion o fNaC .l The increment of so luble protein in P ing shanyou leave sw as h igher than in Fuju unde r the sam eNaC l con-
centration stress. So it is the increm ent but no t the abso lu te content o f so lub le protein took a role on the sa lt to le rance of P ingshany-
ou. Sod ium dodecy l su lfate po ly acry lam ide gel e lec tropho resis(SDS-PAGE) ana ly sis indicated tha t the 80, 67, 54, 32, 28, 18,
17 and 16 ku prote ins we re unaffe cted by NaC l stress and expressed stab ly in leaves o f P ingshanyou seed lings;the 80, 67, 32, 28,
21, 18, 17, 16 and 15 ku prote ins we re the stably expre ssed pro teins in Fuju. 35 and 24 ku p ro te ins we re new ly induced as specific
prote in in P ing shanyou leavesw hen they we re treated w ith >40 mmo l L- 1 NaC l, w hile 72, 43 and 24 ku pro teinsw e re induced in
Fu ju’ s when they we re trea ted w ith >80 mmo l L - 1 NaC .l The activ ities of all these new ly induced specific pro teins increased w ith
the NaC l concentration.
K ey words:Citrus grandisO sbeck cv. P ing shanyou;C. reticula ta B lanco cv. Fuju; sa lt stress;so luble pro tein;sodium dodecy l
sulfa te po lyacry lam ide ge l e lectropho re sis(SDS-PAGE)
土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题.提高植物的耐盐性是改良和利用盐渍化土壤的
一个重要生物学措施.采用传统的方法选育耐盐的植物品种虽然简便可行 ,但进展缓慢. 随着分子生物技
术的发展 ,人们寄希望于基因工程育种. 1983年 Singh e t al[ 1]首次发现 N aC l诱导烟草悬浮培养细胞产生
盐胁迫蛋白 (salt-stress pro te in).作为基因表达变化的一个侧面 ,盐胁迫蛋白是指植物在受到盐胁迫时新
合成的或合成增强的蛋白质 ,某些盐胁迫蛋白可能增强了植物的抗逆性. S ingh et a l[ 2, 3]指出 ,烟草盐适应
细胞中合成分子质量为 26 ku的盐胁迫蛋白 ,其含量占蛋白质总量的 10. 2% - 12. 7%. 由于该蛋白质的合
成总伴随着渗透调节的开始 ,因而又被称为渗调蛋白. 盐胁迫蛋白的发现开辟了耐盐机理研究的新领域.
迄今为止 ,已在大麦 [ 4] 、小麦 [ 5] 、苜蓿[ 6] 、萝卜 [ 7] 、大米草 [ 8] 、木榄[ 9] 、柽柳 [ 10]等植物叶片或根系中发现了
盐胁迫蛋白.但在果树上对盐胁迫蛋白的研究鲜见报道.关于盐胁迫对柚和福橘种子萌发及幼苗生长的耐
盐性方面已有报道[ 11] .本试验用不同浓度的 N aC l胁迫处理坪山柚和福橘幼苗 ,检测叶片蛋白质含量及其
福建农林大学学报(自然科学版) 第 34卷 第 4期
Journa l o f Fu jian Ag riculture and Fo re stry Unive rsity (Natura l Sc ience Edition) 2005年 12月
DOI牶牨牥牣牨牫牫牪牫牤j牣cnki牣j牣fafu牗nat牣sci牣牘牣牪牥牥牭牣牥牬牣牥牨牨
组分的变化 ,探讨盐胁迫下坪山柚和福橘蛋白质行为与其耐盐性的关系 ,为进一步纯化与耐盐性有关的特
异蛋白并克隆相关基因奠定基础 ,为柑橘耐盐品种选育及耐盐栽培提供理论依据.
1　材料与方法
1. 1　材料培养
供试品种为坪山柚(Citrus grandisO sbeck cv. P ingshanyou)(福建省华安县农技站提供 )和福橘(C. re-
ticu lata B lanco cv. Fu ju).种子经质量分数为 0. 1%的 KMnO 4消毒 、冲洗 ,分别播于装有洗净河沙的木箱
中 ,用全营养液(pH为 6. 2±0. 2)浇灌. 其中 ,大量元素采用 1 /2Hoag land营养液 ,微量元素采用 1 /2 A rnon
营养液.当幼苗正常生长到 4片真叶时 ,取出洗净 ,用滤纸吸干水分 ,移入 120mL黑纸遮壁的三角瓶中 ,瓶
内分别盛 40、80、120、160和 200 mmo l L- 1等 5种不同浓度的 NaC l处理液 (在全营养液中分别加入质量
不等的分析纯 NaC l),以全营养液中不加入 NaC l为对照 ,每瓶 2株苗 ,重复 9次.将苗置于 LRH-250GS型
人工气候箱中培养 ,每天照光 12 h,白天温度为 (25±0. 5) ℃,夜间为 (18±0. 5) ℃.第 4天更换 1次培养
液 , 8 d后 ,胁迫结束 ,取出幼苗. 叶片用湿纱布擦净 ,剪碎 ,称取 0. 5 g左右 ,装入塑料管中经液氮速冻后置
冰箱( - 80 ℃)保存 ,用于测定可溶性蛋白质含量及其组分.
1. 2　可溶性蛋白质的提取 、含量测定及组分分析方法
1. 2. 1　蛋白质的提取　参照李振国 [ 12]方法并稍加改进.冰冻叶样准确称重后 ,加入 3 mL预冷的蛋白质
提取液 [含 75 mmo l L -1 PBS (pH 7. 8)、体积分数为 0. 1%的 PVP] ,冰浴中研磨成匀浆;于 0 - 4 ℃、12
000×g离心 10m in,上清液即为蛋白质粗提液.一部分用于可溶性蛋白质含量测定;另一部分用于蛋白质
组分分析.步骤为:加 4倍体积冷丙酮 ,于冰箱 (0 ℃)沉淀过夜;取出后于 12 000 ×g离心 10m in,弃上清
液;所得蛋白质沉淀用蛋白质溶解液 [含 62. 5 mmo l L -1 T ris-HC l(pH 6. 8)、质量分数为 2%的 SDS、体积
分数为 5%的巯基乙醇 、体积分数为 5%的甘油 、2 mmo l L- 1 EDTA 、1mmo l L -1苯甲基磺酰氟 、质量分数
为 0. 1%的溴酚蓝 ]匀浆 ,调节 pH至 7. 0,水浴中煮沸 3 m in;于 12 000×g离心 10 m in,上清液用于十二烷
基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析.
1. 2. 2　可溶性蛋白质含量测定　用考马斯亮蓝法[ 13] ,以牛血清蛋白 (BSA)作标准蛋白质.每样品重复 3次.
1. 2. 3　SDS-PAGE蛋白质电泳　采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,电泳仪型号为 DYY-Ⅲ 8B. 浓缩
胶质量分数为 4%,分离胶质量分数为 12%,进样量 30 μL. 电泳开始时 ,电流为 15mA ,当样品进入分离胶
后 ,电流增至 30mA ,指示剂距胶底 1 cm时 ,停止电泳.标准蛋白为上海丽珠东风生物技术有限公司生产
的低分子质量标准蛋白 ,其组成为:兔磷酸化酶 B(分子质量为 97. 4 ku)、牛血清白蛋白(66. 2 ku)、兔肌动
蛋白(43. 0 ku)、牛碳酸酐酶 (31. 0 ku)、胰蛋白酶抑制剂(20. 1 ku)、鸡蛋清溶菌酶(14. 4 ku).
1. 2. 4　蛋白质染色　凝胶用水漂洗后 ,置于体积分数为 45%的甲醇 、体积分数为 20%的冰乙酸和 0. 5 g
L
- 1考马斯亮蓝 G-250的混合液中染色.于摇床上缓慢摇动染色 3 h后 ,用体积分数为 5%的甲醇和体积分
数为 7. 5%的冰乙酸混合成的脱色液反复脱色直至蓝色酶带清晰.
　图 1　盐胁迫对坪山柚和福橘幼苗叶片可溶性蛋白
质含量的影响
　Fig. 1　Ef fect ofNaC l stress on solub le p rotein con ten t in leaves
of P ingshanyou and Fu ju seed lings
2　结果与分析
2. 1　盐胁迫对坪山柚和福橘幼苗可溶性蛋白质含量
的影响
随着 N aC l浓度的增高 ,坪山柚和福橘幼苗叶片可溶
性蛋白质含量呈上升趋势 (图 1).在 40、120和 200mmo l
L -1 N aC l胁迫下 ,坪山柚叶片可溶性蛋白质含量分别
为 6. 7、9. 9和 13. 4mg g-1 ,分别比对照增加了 24. 1%、
83. 3%和 148. 1%;福橘叶片可溶性蛋白质含量分别为
13. 7、17. 2和 19. 7 mg g- 1 , 分别比对照增加 12. 3%、
41. 0%和 61. 5%.由此可见 ,盐胁迫后 ,坪山柚叶片可溶
性蛋白质含量比福橘低 ,但增加幅度比福橘大.
451 第 4期 马翠兰等:盐胁迫对坪山柚 、福橘幼苗叶片蛋白质合成的影响
2. 2　盐胁迫对坪山柚和福橘幼苗可溶性蛋白质组分的影响
坪山柚幼苗叶片 SDS-PAGE图谱(图 2)分析显示 ,分子质量为 80、67、54、32、28、18、17和 16 ku的蛋
白质为对照和盐胁迫后共有的蛋白质.其中 , 80、67和 28 ku蛋白质在盐胁迫后 ,活性有不同程度的增强;
分子质量为 58和 14 ku蛋白质只存在于对照叶片中 ,盐胁迫后 ,这 2种蛋白质消失. 35和 24 ku蛋白质是
盐胁迫后新诱导合成的 ,且随盐胁迫强度的增大 ,它们的活性增强 (表 1).
从图 2还可以看出 ,对照和盐胁迫后的福橘叶片中都有分子质量为 80、67、32、28、21、18、17、16和 15
ku的蛋白质产生 ,其中 32、28和 21 ku 3种蛋白质在盐胁迫后 ,活性有不同程度的增强 (表 2). 盐胁迫诱
导了 72、43和 24 ku 3种蛋白质的产生 ,但 40和 80mmol L -1 NaC l胁迫不诱导 43 ku蛋白质产生. 盐胁
迫后 , 13 ku蛋白质消失.
M.蛋白质分子质量标准;1.对照;2 - 6分别经 40、 80、120、 160、200 mm ol L- 1 NaC l胁迫.
图 2　盐胁迫下坪山柚和福橘幼苗叶片可溶性蛋白质的 SDS-PAGE图谱
Fig. 2　 SDS-PAGE of solub le proteins in leaves of Pingshanyou and Fu ju seed lings under NaC l s tress
表 1　不同浓度 N aC l胁迫下坪山柚幼苗叶片可溶性蛋白质组分的差异 1)
Tab le 1　D ifference of so lub le p rotein s in leaves of P ingshanyou seed lings under d ifferent NaC l concen tration stress
c(NaC l)
mm o l L- 1
分子质量 /ku
80 67 58 54 35 32 28 24 18 17 16 14
0 + + + + - + + - + + + +
40 + + - + + + + + + + + -
80 + + - + + + + + + + + -
120 ++ + - + + + ++ ++ + + + -
160 ++ ++ - + ++ + ++ ++ + + + -
200 ++ ++ - + ++ + +++ +++ + + + -
　　1) +表示存在 ,数量越多表示该蛋白质活性越强;-表示不存在.
表 2　不同浓度 N aC l胁迫下福橘幼苗叶片可溶性蛋白质组分的差异 1)
Tab le 2　D ifference of so lub le p rotein s in leaves of Fu ju seed lings under d ifferentN aC l con cen tration stress
c(NaC l)
mm ol L - 1
分子质量 /ku
80 72 67 43 32 28 24 21 18 17 16 15 13
0 + - + - + + - + + + + + +
40 + + + - + + + + + + + + -
80 + + + - + ++ + + + + + + -
120 + + + + + ++ ++ + + + + + -
160 + + + + + ++ ++ ++ + + + + -
200 + + + + ++ ++ ++ ++ + + + + -
　　1) +表示存在 ,数量越多表示该蛋白质活性越强;-表示不存在.
3　讨论
盐胁迫蛋白是普遍存在的. 植物中的耐盐基因可能也普遍存在 ,它的表达活性因植物种类和环境而
452 福建农林大学学报(自然科学版) 第 34卷
异 ,耐盐与否将取决于这些基因的表达效率.首先 ,盐调节蛋白质的含量.盆栽无花果经 150和 300mmo l
L
- 1
NaC l处理后 ,叶片可溶性蛋白质含量明显增加;经 300mmol L -1 NaC l处理 1 d后 ,可溶性蛋白质含
量增加 58. 75%,且可溶性蛋白质积累在内源 ABA和游离脯氨酸之前 ,因此蛋白质的合成是逆境激素及渗
透调节的基础[ 14] .贺志理等 [ 6]指出 ,盐胁迫下苜蓿叶片中蛋白质的合成受抑制 ,而其离体叶绿体中蛋白质
合成增加.本试验结果表明 ,盐胁迫增加了坪山柚和福橘叶片可溶性蛋白质含量 ,且随 N aC l浓度的增高 ,
坪山柚和福橘叶片可溶性蛋白质含量增多. 在 40 - 200 mmo l L -1 NaC l胁迫下 ,坪山柚叶片可溶性蛋白
质含量比对照增加 24. 1% - 148. 1%,福橘比对照增加 12. 3% - 61. 5%,即盐胁迫后 ,坪山柚叶片可溶性蛋
白质含量增加幅度比福橘大.由于坪山柚幼苗的耐盐性比福橘强 [ 11] ,因此 ,可能主要是蛋白质的增加幅度
而不是其绝对含量对坪山柚的耐盐性起作用.
植物的耐盐性是受多基因控制的 [ 6, 10] . 盐胁迫下一些蛋白质合成受阻 ,而另一些蛋白质合成不受影
响.盐胁迫后柽柳叶片中分子质量为 26 ku的蛋白质 、大麦叶片中 20和 12 ku的蛋白质及大麦根系中 24
ku的蛋白质活性增强 ,而苜蓿和番茄叶片及根系中蛋白质没有发生明显变化 [ 10] . 本试验中分子质量为
80、67、54、32、28、18、17和 16 ku的 8种蛋白质及 80、67、32、28、21、18、17、16和 15 ku的 9种蛋白质分别
为坪山柚和福橘的对照及盐胁迫后共有的蛋白质 ,说明这些蛋白质不受盐胁迫的影响 ,可能是植株生长发
育过程中持续稳定表达的蛋白质.盐胁迫后 ,坪山柚幼苗叶片新产生 35和 24 ku 2种特异蛋白质 ,福橘幼
苗叶片新产生 72、43和 24 ku 3种特异蛋白质. 特异蛋白质可增强植物的抗逆性 ,但与特异蛋白质的数量
无关 ,这与 Ramagopal[ 15]对大麦及贺志理等 [ 6]对苜蓿的研究结果一致. Ramagopa l[ 15]指出 ,耐盐性强的大
麦 CM72根系和地上部产生较少的盐胁迫蛋白质 ,而耐盐性弱的大麦 P ro to根系和地上部产生较多的盐胁
迫蛋白质.耐盐性弱的松江苜蓿产生 4种新多肽 ,而耐盐性强的肇东苜蓿仅产生 2种新多肽 [ 6] .马翠兰
等 [ 11]指出 ,坪山柚幼苗地上部及根部较低的 N a+和 C l-含量及保持较高的根冠比是坪山柚幼苗比福橘幼
苗耐盐胁迫的原因.根据本试验结果 ,盐胁迫后 ,坪山柚叶片中新产生的 35 ku特异蛋白质的表达可能是
坪山柚比福橘耐盐的主要原因.
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(责任编辑:施晓棠 )　　
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