全 文 ：果 树 学 报 2008,25(2):254～257
JournalofFruitScience
本地早橘的AFLP标记
谭金娟,肖金平,陈力耕 *
(浙江大学农业与生物技术学院园艺系,杭州 310029)
摘 要:采用AFLP技术分析了来自浙江黄岩的 4个本地早橘材料 (3个无核材料,1个有核材料),共筛选了 72对
E+3/M+3引物组合,从中选用 12对多态性较好的引物进行最终扩增;最终得到 9条清晰稳定的标记片断,分别命名
为 SL1~SL9;克隆测序后将所得碱基序列提交 Genbank核酸序列数据库进行 BLAST比对分析,结果表明,特异片段
SL1与一种植物生长素输出蛋白编码基因 PIN9有 78%的一致性;特异片段 SL2与一种植物反转录转座子基因有
87%的一致性;特异片段 SL4与植物叶绿体基因有 94%的一致性;与功能基因较高的同源性为我们理解柑橘无核形
成的分子机制提供了有价值的信息。
关键词:本地早;无核;AFLP
中图分类号:S665.1 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2008)02-254-04
StudyonBendizaotangerine(Citrussuccosa)byAFLPanalysis
TANJin-juan,XIAOJin-ping,CHENLi-geng*
(DepartmentofHorticulture,ZhejiangUniversity,Hangzhou,Zhejiang310029China)
Abstract:Inthispresentresearch4Bendizaotangerinematerials(3seedlesscultivars,1seededcultivar)wereinvestigated
byusingAFLPtechnique.72pairsofE+3/M+3primercombinationswerescreenedand12pairsofgoodpolymorphism
primerswereselectedforfinalPCRamplication.9specificbandsweregeneratedandnamedasSL1toSL9respectively.These
markerbandswerecloned,sequencedandthentheobtainedsequenceresultsweresubmitedtoGenebankdatabasewith
runningBLASTnprogramme.TheresultshowedthatSL1had78%homologywithputativeauxinefluxcarierprotein9
(PIN9)gene,SL2had87%homologywithretrotransposonRtsp-1DNAsequenceandSL4had94%homologywithchloroplast
genomicDNAsequence.Thehighhomologywithfunctionalgeneprovidedusvaluableinformationaboutmoleculemecha-
nismofseedleestraitoncitrus.
Keywords:Bendizaotangerine;Seedless;AFLP
收稿日期:2007-09-02 接受日期:2008-01-14
作者简介:谭金娟,女,硕士。Tel:0571-86022749,E-mail:donger1103@163.com
>通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:0571-86971390,E-mail:lgchen@zju.edu.cn
本地早蜜橘 (CitrussuccosaHort.exTanaka),又
名天台山蜜橘,是原产于浙江一带的优质宽皮柑橘
品种。该品种11月上旬成熟,果实扁圆,果皮深橙黄
色,味甜少酸,汁多化渣,品质极好;耐寒性强,可鲜
食和加工橘片罐头。东江本地早,是在黄岩本地早蜜
橘园中发现的无核、早熟、优质变异株,由本地早珠
心胚发育而来。与普通本地早蜜橘相比,东江本地早
表现为果实无核,结果性能好,可溶性固形物含量
高,风味浓郁,果面更为光滑,成熟期略有提早,其综
合农艺性状得到明显改良,是本地早橘系的一个高
糖无核早熟类型,已被浙江省作物品种审定委员会
认定为新品种。
由于变异后代与亲本在遗传物质构成上存在很
微小的差异,传统的形态学和同工酶方法很难对其
进行区分和鉴别[1]。而分子标记技术能够从分子水平
上区分亲本和变异后代之间的遗传差异,从而达到
早期鉴定优良变异材料、缩短育种周期的目的。近年
来,各种类型的分子标记技术已经在改良作物品质、
培育新品种方面发挥了重要的作用。由Vos等[2]发明
的AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)技术
结合了RFLP和RAPD2者的技术优点,多态性高、重
复性好、结果可靠,是较为有效的分子标记方法。我们
采用AFLP方法对本地早橘无核和有核品种在分子
水平上进行了分析研究,本文报道相关研究结果。
1 材料和方法
1.1 材料
东江本地早、东江本地早无性系一代、实生无核
本地早以及普通本地早(有核对照),幼叶取自浙江黄
岩林特局东江本地早试验园。
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2008.02.014
图1 选择性扩增产物琼脂糖电泳图谱
1.东江本地早;2.东江本地早无性系一代;3.实生无核本地早;4.
普通有核本地早;M.DNAMark
Fig.1Agarosegelelectrophoresisofselective
amplifiedproducts
1.DongjiangBendizaotangerine;2.DongjiangBendizao tangerine
clonedV1;3.SeedlessBendizaoseedling;4.NormalseededBendizao;
M.DL2000DNAMarkers
表1引物组合及多态性条带数
Table1Primercombinationandnumber
ofpolymorphicbands
引物组合
Primer
combination
多态性
条带数
Numberofpoly-
norhicband
引物组合
Primer
combination
多态性
条带数
Numberofpoly-
norhicband
E-AGG/M-CAC
E-AGG/M-CTG
E-ACT/M-CGT
E-ACA/M-CGT
E-ACA/M-AAC
E-ACA/M-CAA
4
2
3
2
1
2
E-AGT/M-CTC
E-AGT/M-CAG
E-AGT/M-CAA
E-ACC/M-CGT
E-ACC/M-AAC
E-ACC/M-CAG
1
2
2
1
1
2
2期
DNA纯化试剂盒以及 PCR扩增试剂购自宝生
物工程有限公司(Takara),AFLP分析的接头和引物
以及银染所用试剂均购自上海生工生物工程技术服
务有限公司。引物序列参照Vos等[2],具体如下:M-
F:5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’;M-R:5’-TACT-
CAGGACTCAT-3’;E-F:5’-CTCGTAGACTGCGTA
CC-3’;E-R:5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’;E-
A:5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’;M-C:5’-GAT-
GAGTCCTGAGTAAC-3’;E-NNN:5’-GACTGCG-
TACCAATTCNNN-3’;M-NNN:5’-GATGAGTCCT-
GAGTAANNN-3’(N代表选择性碱基)。EcoRI和
MseI内切酶均购自NEB(NewEnglandBiolabs)公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及纯化 基因组总DNA的提取参
考熊光明等[3]的方法进行,DNA的纯化步骤按照
Takara公司的纯化试剂盒说明进行;DNA质量通过
琼脂糖凝胶电泳检测,DNA浓度用 Beckmancoulter
DU-800X型紫外分光光度计测定。
1.2.2 AFLP分析 AFLP酶切体系为 20μL,含250
ng模板 DNA,MseI和 EcoRI各 3U,37℃酶切 5h
后用 T4DNA连接酶(1U)16℃连接过夜,预扩增及
选择性扩增按优化后的体系进行;扩增产物加入变
性液后95℃加热变性5min,取3μL于6%聚丙烯
酰胺凝胶电泳分离 2h,银染显色;考虑到 AFLP条
带假阳性的可能性较大,实验共进行了3次重复。
1.2.3 特异片断的回收与克隆测序 将目的条带直
接从聚丙烯酰胺凝胶上割下,置于0.5mL离心管中,
加入10μLddH2O,室温下浸泡过夜,离心后取1μL
上清液做模板,用相应的选择性扩增引物进行 PCR
扩增,反应程序为:94℃5min;94℃40s,56℃40s,
72℃60s(40个循环);72℃延伸10min;4℃保存。扩
增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离,用 DNA
凝胶回收试剂盒 (TakaraAgaroseGelDNAPurifica-
tionVer.2.0)回收相应的DNA片断。
将回收片段连接到 pUC-mT载体(上海生物工
程公司),用热激法将其转入大肠杆菌 TGI,在含
0.05mg/L氨苄的 LB固体培养基上进行蓝白斑筛
选。挑取白色菌落,在液体LB培养基上扩大繁殖。
采用碱裂解法[4]从菌液中提取质粒,进行PCR扩增,
将目的片断正确插入的克隆质粒送上海生物工程公
司测序。
2 结果与分析
2.1 AFLP分析
以9个EcoRI和8个MseI引物,共72对引物
组合对 4个本地早材料的基因组 DNA进行 AFLP
分析,扩增反应结束后,取4μL扩增产物在1.5%琼
脂糖凝胶上电泳检测,产物片断长度集中在 100～
500bp,呈弥散状(图1),表明扩增结果良好,可以进
行下一步的分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,所有引
物组合均有扩增,片断长度集中在 100～500bp之
间,这与琼脂糖凝胶电泳检测结果一致,但不同的引
物组合在样品间的扩增能力并不相同,得到的条带
数差别很大;多数引物组合在各材料间无多态性,只
有12对引物出现多态性扩增,共检测到多态性条带
23条(表1),经过重复扩增,最终在7个引物组合中
发现 9条清晰稳定的无核材料独有或缺少的片断
(图2)。
2.2 特异片断的回收与克隆
将最终得到的9条稳定出现的特异片断编号为
SL1～SL9,分别由引物组合E-ACT/M-CGT,E-ACC/
M-CAG,E-ACA/M-CGT,E-AGT/M-CAA,E-
AGG/M-CTG,E-ACC/M-CGT,E-AGT/M-CAG,E-
AGT/M-CAG,E-AGG/M-CTG扩增得到,其中 SL1、
SL2为只在无核材料中出现的特异带,SL3~SL9为只
在有核材料中出现的特异带。由于从聚丙烯酰胺凝
胶上割下的目的片断DNA含量很少,且可能含有部
谭金娟等:本地早橘的AFLP标记
1 2 3 4 M
bp
500
100
255
果 树 学 报 25卷
bp
2000
1000
图3 再扩增产物于琼脂糖上的电泳图谱
Fig.3Agarosegelelectrophoresisofre-amplifiedproducts
1~6.SL1~SL6;M.DL2000DNAMarkers
图2 选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
1-12.分别表示引物组合:E-AGG/M-CAC,E-ACA/M-CGT,E-ACA/M-AAC,E-AGT/M-CAG,E-AGT/M-CAA,E-ACC/M-CGT,E-ACC/M-AAC,
E-AGG/M-CTG,E-AGT/M-CTC,E-ACT/M-CGT,E-ACA/M-CAA,E-ACC/M-CAG;a,b,c,d,e为各泳道的样品:东江本地早,东江本地早无性
系一代,实生无核本地早,普通有核本地早,a、b、c均量混合样品;*箭头所指处为7个引物组合产生的9个特异带
Fig.2TheAFLPfingerprintingmapofselectiveamplifiedproducts
1-12.Representedprimercombinations:E-AGG/M-CAC,E-ACA/M-CGT,E-ACA/M-AAC,E-AGT/M-CAG,E-AGT/M-CAA,E-ACC/M-CGT,
E-ACC/M-AAC,E-AGG/M-CTG,E-AGT/M-CTC,E-ACT/M-CGT,E-ACA/M-CAA,E-ACC/M-CAG;a,b,c,d,eweresamples:Dongjiang
Bendizaotangerine,DongjiangBendizaotangerineclonedV1,seedlessBendizaoseedling,NormalseededBendizao,mixtureofa,b,c;*Ninespecific
bandsamplifiedby7primercombinationswerearowed
分杂质,难以满足后续的克隆和连接需要。因此,以
回收的DNA为模板,用相对应的选扩引物和选扩程
序进行重扩增,产物用 1.5%琼脂糖电泳检测,结果
显示与要回收的特异片断大小一致(图3),割胶回收
后克隆测序。
2.3 特异片断测序与比对分析
克隆测序得到9条特异带的碱基序列,从序列
中找出相应的MseI和EcoRI引物的位置,2引物中
间的序列即为所要克隆的目的片断。将目的序列输
入 Genbank数据库运行 BLAST与已知基因碱基序
列进行同源性分析。结果表明,9条特异带中有3条
分别与已知功能基因有较高的一致性,其中特异片
段 SL1与一种植物生长素输出蛋白编码基因 PIN9
有78%的一致性,特异片段SL2与一种植物反转录
转座子基因有87%的一致性,特异片段SL4与植物
叶绿体基因有94%的一致性;其它特异片段由于同
源区域太短,只能作为本地早无核的特异AFLP标
记。标记片段SL1、SL2、SL4的碱基序列见图4。
3 讨 论
近来有许多研究表明种子和果实的发育与激素
尤其是生长素的积累和运输密切相关[5-8]。从生理上
说,激素是诱导单性结实和伪单性结实 (种子败育
型)最主要的因素,就是授粉和低温刺激也一般是通
过激发产生生长素或赤霉素从而诱导无核的[7]。本研
究中获得的特异片段SL1与植物生长素输出的一种
载体蛋白 PIN9的编码区序列有较高的一致性
(78%),据此推测SL1可能与调控生长素运输的基
因密切相关,但由于其片断长度较短,有待于片段的
延长和全基因的克隆验证。
反转录转座子在高等植物中是普遍存在的,研
究表明,位于基因附近或基因内的反转录转座子可
能是具有转座潜能的转座子,可对物种变异起重要
作用[9-10],还可能是芽变产生的原因之一[11-12]。这些反
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
abcde abcde abdc abdcabcdeabcde abdc abdc abcde abcde abcdeedcba
M 1 2 3 4 5 6 M
750
500
200
100
256
2期
图4 标记片段SL1、SL2、SL4的碱基序列
方框内为引物序列
Fig.4PartialsequenceoftheSL1,SL2,SL4markefragment
Primersequenceinframe
转录转座子当被一定的刺激 (包括各种生物和非生
物因子)激活后,可转座造成植物的遗传变异。因为
许多反转录转座子广泛分布在染色体的常染色质区
内,因此,就有可能产生与农业重要基因相连锁的标
记。Kenward等[13]利用反转录转座子 Tnd-1在烟草
中已找到了一个与黑根抗性相连锁的标记。目前,反
转录转座子转座插入导致果实无核已有报道,Yao
等[14]发现苹果RaeIme单性结实突变体的MdPI基因
(与花发育相关)在第4个内含子中插入了一个反转
录转座子,而SpencerSeedless和WilingtonBloom-
less是在第6个内含子中插入转座子,破坏了 MdPI
基因的正常表达而导致了单性结实。本试验中得到
的 SL2特异片断与一种植物反转录转座子基因有
87%的一致性,为本地早无核变异的一个特异AFLP
标记,对其功能需作进一步研究。
特异片段SL4与植物叶绿体基因组具有高同源
性(94%)。研究表明,柑橘无核品种或变异的新叶淡
色斑或黄、白、绿嵌合体多表现雄性不育,其叶片的
色素变异可能与育性一样受到同一部分基因的控
制,与无核具有相关性。研究者普遍认为,导致植物
细胞质雄性不育的主要因素与细胞质中线粒体或叶
绿体基因组有关。但目前尚没有植物的叶绿体基因
组变异产生细胞质雄性不育的确切证据[15]。
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