全 文 ：第29卷第9期　　　　　　　　 　西南 大学学 报 (自然科学版)　　　　　　　　　　　2007年 9月
Vol. 29　No. 9 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) Sep. 　2007
文章编号:1673 - 9868(2007)09 - 0095 - 06
金柑属 ISSR反应体系的建立及优化①
朱文碧 , 　张连峰 , 　何　桥 , 　郭启高 , 　梁国鲁
西南大学 园艺园林学院 , 重庆 400716
摘要:以融安金弹(F. crassi f olia Swingle)为试材 , 利用正交设计和单因素试验相结合的方法 , 对 ISSR反应体系
中各个主要影响因子进行了优化筛选 , 结果表明 , 20 μL 的 ISS R反应体系中各组分的最适浓度分别为:Mg2+
1. 60 mmo l/ L , dNTPs 0. 15 mmol /L , TaqDNA 酶 1. 0 U , 引物 0. 2 μmo l/ L模板 1. 2 ng /μL. 并利用该优化对金弹
等 21 份金柑属材料进行了 ISS R扩增 , 证实了该体系稳定和可靠性.
关　键　词:ISSR;融安金弹;体系优化
中图分类号:S666. 9;S603. 6 文献标识码:A
金弹 (Fortunel la crassi f ol ia Sw ingle)为芸香科柑橘亚科金柑属(Fortunel la Sw ing le)植物 , 其果实食
用方便 , 外形美观 , 营养丰富 , 深受消费者的欢迎 , 是我国著名的水果之一. 同时 , 金弹还是柑橘抗寒育种
的优质材料[ 1] . 1915年施文格确立了金柑属的地位 , 并认为金弹可能是罗浮和圆金柑的杂种或金柑属与柑
橘属的杂种经反复和金柑属植物回交得到的杂种. 而曾勉则根据栽培和形态学差异 , 提出将金弹和长寿金
柑划分为金弹亚属. 由于金柑属植物属内和属间的易杂交及杂种可孕性 , 形态复杂[ 2] , 目前还没有公认统
一的分类标准 , 所以有关该属的分类 , 特别是种的划分一直存在较大分歧[ 3] , 因此有关金柑属起源和分类
的研究具有重要的研究价值. 本研究选取金柑属中最具代表性的融安金弹进行研究 , 以筛选出具有代表性
的反应体系 , 为下一步研究做好基础.
ISSR(Inter Simple Sequence Repeat , 简单序列重复间区)是 Zietkiewicz 等人于 1994年提出的一种
DNA 分子标记技术[ 4] , 兼有 RA PD操作简单和 SSR多态性好的优点 , 同时它的重复性和稳定性较高 , 成
本较低. 目前 , ISSR分子标记广泛应用于作物遗传多样性分析 、遗传图谱绘制 、品种鉴定及数量性状基因
座(Q TL)定位等多个方面. 在果树上 , 柑橘 、苹果 、李 、芒果 、杏 、杨梅 、莲雾等均有报道涉及[ 5 - 11] , 而金
弹上未见报道.
由于 ISSR技术也是基于 PCR的一种分子标记技术 , 所以同其他分子标记一样 , 模板 DNA 、 Taq
DNA 聚合酶 、 dN TPs 、引物以及 Mg2+等都能影响扩增结果 , 因此在研究时都应先针对这些影响其 PCR反
应的因子建立起合适的反应体系.
本试验利用正交设计均衡分散 、综合可比及可伸可缩 、效用明确等特点[ 12] , 对影响 ISSR反应条件的
主要因素进行筛选 , 并且结合单因子试验方法 , 对金柑 ISS R反应条件进行优化 , 对各因子的最佳反应条件
进行了探索 , 建立了适合于金柑属的 ISSR反应体系 , 为金柑属植物的 ISSR分子标记研究奠定了基础.
① 收稿日期:2006 - 08 - 10
作者简介:朱文碧(1982 -), 女, 江苏常州人 , 硕士研究生 , 主要从事果树育种方面的研究.
通讯作者:梁国鲁.
DOI牶牨牥牣牨牫牱牨牳牤j牣cnki牣xdzk牣牪牥牥牱牣牥牴牣牥牥牰
1　材料与方法
1. 1　材　料
1. 1. 1　供试材料及来源
本研究以融安金弹(F. crassi f ol ia Swing le)为试材 , 采自中国农业科学院柑橘研究所国家种质重庆柑
橘资源圃.
1. 1. 2　试剂及仪器
所用 Taq DNA 聚合酶 、 dN TPs 等均购于上海生工生物工程有限公司;λDNA M arker (EcoR Ⅰ +
Hind Ⅲ)购自华美生物工程公司;ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供序列由上海生工生物工
程有限公司合成;琼脂糖购自西班牙 Biowest公司;PCR仪为 Eppendo rf 公司产品.
1. 2　方　法
1. 2. 1　基因组 DNA 的提取
采用改良的 CTAB法[ 1 3] 取嫩叶提取基因组 DNA. 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳 , 并与已知浓度的λDNA
Marker进行对比检测纯度及完整性 , 调整浓度至 10 ng /μL.
1. 2. 2　PCR扩增及检测
扩增程序为:94 ℃预变性 4 min , 1个循环;94 ℃45 s , 50 ℃1 min , 72 ℃2 min , 40个循环;72 ℃
10 min , 1个循环;4 ℃保存.
PCR扩增反应结束后 , 每管各加 6×溴酚蓝 3 μL , 离心混匀后 , 取 15 μL 扩增产物用 1. 5%的琼脂糖
凝胶电泳分离 , 电压不超过 5 V /cm , 电泳结束后经溴化乙锭(EB)染色 10 ～ 20 min后 , 在紫外透射仪上观
测并照相 , 并对图像进行进一步分析.
1. 2. 3　PCR反应体系的正交试验
本试验反应体系的建立参考李钧敏等[ 14]的研究结果 , 采用 L16(45)正交试验设计 , 选取了影响 PCR反
应的 5个因子(DNA 模板的浓度 , Mg 2+浓度 , 引物浓度 , dNTPs浓度和 Taq DNA聚合酶浓度), 进行5个
因素 4个水平筛选(如表 1).
表 1　正交供试因子和水平
编　号
因　　　　素
Mg2+
/(mmol L - 1)
Taq 酶
/ U
dN TPs
/(mmo l L - 1)
引物
/(μmo l L - 1)
模板 DNA
/(ng μL - 1)
1 0. 5 0. 5 0. 05 0. 1 0. 5
2 1. 0 1. 0 0. 10 0. 2 1. 0
3 1. 5 1. 5 0. 15 0. 3 1. 5
4 2. 0 2. 0 0. 20 0. 4 2. 0
1. 2. 4　退火温度的筛选
在确定的最佳反应体系基础上 , 利用梯度 PCR 对退火温度进行优化筛选. 设定退火温度为:48. 0 ,
48. 5 , 49. 0 , 49. 5 , 50. 0 , 50. 5 , 51. 0 , 51. 5 , 52. 0 , 52. 5 , 53. 0 , 53. 5 ℃. 每个梯度设 2个重复 , 其他反应
程序均与 PCR正交试验设计的相同.
1. 2. 5　PCR反应体系的单因子试验
参照正交试验体系优化的结果 , 对 DNA 模板的浓度 、Mg2+浓度 、引物浓度 、dNTPs浓度和 Taq DNA
聚合酶浓度等从筛选出的 20条引物中随机选取 ISSR引物编号为 836的 ISSR引物 , 进行了交叉实验. 反
应体系的参数设置如下:
引物浓度设置 0. 1 , 0. 2 , 0. 3 , 0. 4 , 0. 5 μmol /L 5 个浓度梯度;dN TPs浓度设置 0. 04 , 0. 08 , 0. 12 ,
0. 16 , 0. 2 mmo l /L 5个浓度梯度;Taq酶浓度设置 0. 5 , 1. 0 , 1. 5 , 2. 0 , 2. 5 U 5个浓度梯度;模板 DNA
浓度设置 0. 4 , 0. 8 , 1. 2 , 1. 6 , 2. 0 ng /μL 5个浓度梯度;Mg2+浓度设置 0. 4 , 0. 8 , 1. 2 , 1. 6 , 2. 0 mmo l /L
5个浓度梯度 , 1×PCR buffer(不含 Mg2+), 补充 ddH 2O 至 20 μL.
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1. 2. 6　体系稳定性检测
从筛选出的 20条引物中随机选择 ISS R引物编号为 807的 ISS R引物对 21份金柑材料进行扩增 , 以检
测确定的金弹 ISSR-PCR反应体系及反应参数的稳定性.
2　结果与分析
2. 1　ISS R反应体系的正交优化
由图 1可以看出 , 在 16个处理组合中 , 由于 dN TPs 、引物 、模板 DNA , Mg2+浓度和 Taq酶等 5大影
响因素浓度组合的不同 , 扩增效果存在着明显的差异. 第 1 , 2组合扩增的谱带较弱;第 3 , 4组合扩增的谱
带不太清晰且背景弥散 , 造成无法区分;第 5 , 7 , 8 , 9组合扩增效果较差;第 10组合扩增的谱带清晰 , 但
强度稍差且有弥散背景;第 11 ～ 14组合扩增效果较差 , 几乎扩增不出条带;第 15 , 16组合扩增的谱带较
强 , 但由于背景弥散 , 造成无法区分;第6组合扩增的谱带清晰. 最佳组合应选择谱带清晰且谱带较稳定的组
合 , 故本试验选择第 6组合为最佳组合 , 即 20 μL 反应体系中含引物 0. 2 μmol /L , dN TPs 0. 15 mmol /L ,
Taq酶 1. 0 U ,模板 DNA 1. 2 ng /μL ,Mg2+1. 5 mmo l /L .
图 1　ISSR反应体系优化的扩增结果
2. 2　不同退火温度对 ISS R-PCR反应的影响
图 2表明 , 退火温度对 ISSR-PCR扩增也有明显的影响. 从图中可以看出 , 退火温度较低时(48. 0 ～
49. 0 ℃), 除主带外 , 杂带较多;随着退火温度升高(52. 0 ～ 53. 5 ℃), 引物与模板结合的特异性增强 , 但是
扩增条带减少. 在退火温度为 49. 5 ～ 51. 5 ℃扩增效果较好 , 同时由于退火温度在 50. 0 ℃时条带的稳定性
和重复性较好 , 因此 ISS R的退火温度选择了 50 ℃, 比理论上的 T m值(52. 7 ℃)低 2. 7 ℃.
1～ 12对应温度为 48. 0 , 48. 5 , 49. 0 , 49. 5 , 50. 0 , 50. 5 , 51. 0 , 51. 5, 52. 0 , 52. 5 , 53. 0 , 53. 5 ℃, 引物为 836.
图 2　退火温度对 ISSR反应的影响
2. 3　PCR反应体系的单因子试验
2. 3. 1　DNA模板浓度的优化
由图 3结果表明 , 模板浓度在 0. 4 ～ 1. 6 ng /μL 时都能扩增出条带 , 在 0. 4 ～ 0. 8 ng /μL 时 , 扩增条带
数减少 , 而在高于 1. 2 ng /μL 时背景加深 , 尤其当模板浓度达到 2. 0 ng /μL 时得到的主要是一些小的DNA
片段. 因此浓度在 1. 2 ng /μL 左右时扩增条带数目相对比较稳定 , 扩增效果较好.
2. 3. 2　Mg2+浓度优化
在一般的 PCR反应中 , 1. 5 ～ 2. 0 mmol /L M g2+是比较适合的[ 15] . 从图 4可以看出 , Mg2+浓度在0. 4
～ 1. 2 mmol /L 时 , ISS R 扩增产物量不足或扩增不出条带 , 在 1. 6 mmol /L 时扩增条带清晰 , 而在
2. 0 mmol /L时点样孔及其附近区域背景加深且无扩增产物. 因此浓度在 1. 6 mmo l /L 左右时扩增条带数目
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相对比较稳定 , 扩增效果较好.
2. 3. 3　dNTPs浓度优化
由图 5可以看出 , dN TPs的浓度在 0. 04 ～ 0. 16 mmol /L 均有扩增产物. 在 0. 04 ～ 0. 08 mmol /L 时 ,
扩增产物的条带数和清晰度不及 0. 12 ～ 0. 16 mmol /L , 而在 0. 2 mmol /L 时无扩增产物. 浓度在
0. 16 mmol /L时扩增产物效率最高 , 条带也较为清晰.
从左至右各泳道的浓度为 0. 4 , 0. 8 , 1. 2 , 1. 6 , 2. 0 ng /μL.
图 3　不同模板 DNA浓度下的 ISSR扩增结果
从左至右各泳道的浓度为 0. 4 , 0. 8 , 1. 2 , 1. 6 , 2. 0 mm ol /L.
图 4　不同 Mg2+浓度下的 ISSR扩增结果
2. 3. 4　Taq DNA聚合酶浓度优化
由图 6可以看出 , 在 20 μL 的反应体系中 , 使用 0. 5 ～ 2. 0 U Taq酶含量均有扩增产物出现 , 但高于
1. 5 U 时 , 非特异性扩增增强 , 背景也加深. 故 Taq酶浓度在 1. 0 U时扩增反应效果最佳.
从左至右各泳道的浓度为 0. 04 , 0. 08 , 0. 12 , 0. 16 , 0. 2 mm ol /L.
图 5　不同 dNTPs浓度下的 ISSR扩增结果
从左至右各泳道的浓度为 0. 5 , 1. 0 , 1. 5 , 2. 0 , 2. 5 U.
图 6　不同 Taq DNA聚合酶浓度下的 ISSR扩增结果
2. 3. 5　引物浓度优化
由图 7可以看出 , 引物浓度 0. 1 ～ 0. 4 μmol /L 时 , 均有扩增产物出现. 而随着引物浓度的升高 , 泳道
背景加深甚至无扩增条带. 因此 , 认为引物浓度在 0. 2μmol /L 时较合适.
2. 4　ISS R-PCR反应体系及反应参数的稳定性结果检测
利用编号为 807的 ISS R引物对 21份金柑属材料进行扩增. 结果如图 8所示. 所选择的引物能扩增出
清晰 、重复性好的谱带. 因此 , 在结合正交试验设计方法和单因子试验方法 , 对金弹 ISS R反应条件进行优
化 , 结果表明 , 20μL 的金弹 ISS R反应体系中各组分的最适浓度分别为:1×PCR buffe r(不含 Mg 2+)、
Mg 2+ 1. 60 mmol /L 、dNTPs 0. 15 mmol /L 、 TaqDNA 酶 1. 0 U 、引物0. 2μmo l/L 模板1. 2 ng /μL. 表明优
化确立的 ISSR-PCR反应体系及反应参数是稳定可靠的 , 可应用于金弹亲缘关系分析等研究.
3　讨　论
PCR扩增容易受到诸多因素的影响:模板 DNA的含量也是制约扩增产物得率及特异性的一个重要因
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子 , 模板含量过低 , 分子碰撞的几率低 , 偶然性大 , 扩增产物无或不稳定;模板含量过高 , 又会相应增加非
特异性产物的扩增 , 导致电泳背景加深 , 不利于读带 , 本研究试验表明 , 模板的浓度在 1. 2 ～ 1. 6 ng /μL 之
间时 , 条带比较清晰 , 尤其是浓度为 1. 2 ng /μL 时最清晰 , 而 2. 0 ng /μL 则不能很好的进行扩增 , 因此本
研究选择的模板浓度为 1. 2 ng /μL.
从左至右各泳道的浓度为 0. 1 , 0. 2 , 0. 3 , 0. 4 , 0. 5μmol /L.
图 7　不同引物浓度下的 ISSR 扩增结果 图 8　引物 807 在样品中的扩增结果
　　Taq DNA 聚合酶是 Mg 2+依赖性酶 , 对 Mg 2+浓度非常敏感 , 选择合适的 Mg2+浓度 , 对 PCR反应至
关重要 , 结合正交设计与单因子试验均表明 Mg 2+浓度过低 , 不能有效的进行 PCR扩增 , Mg2+浓度过高 ,
则电泳背景加深 , 出现非特异性扩增. 同时 , 引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的
影响 , 特别是其中的 Mg2+浓度能影响反应的特异性和扩增片断的产率[ 16] . 在正交设计的优化体系中
Mg
2+浓度在低于 1. 5 mmol /L时 , 不能有效的进行扩增 , 单因子试验中 Mg 2+浓度低于 1. 2 mmol /L时 , 不
能扩增出带纹 , 2. 0 mmol /L 时 , 背景加深 , 在 1. 6 mmol /L 时扩增效果最好 , 因此综合正交设计和单因子
试验 , 选择金柑最适 ISS R-PCR反应体系的 Mg2+浓度为 1. 5 ～ 1. 6 mmol /L.
底物 dN TPs浓度过低 , 会影响合成效率 , 甚至会因 dNTPs过早消耗而使产物单链化 , 影响扩增结果 ,
过高 , 会导致非特异性扩增 , 当 dN TPs浓度高于 50 mmo l /L 还会抑制 Taq DNA 聚合酶的活性[ 17] . 本研
究结合前人的研究结论 , 利用正交设计表及单因子试验分别设计了 4个和 5 个浓度梯度 , 对金弹最适 IS-
SR-PCR反应体系进行了探讨. PCR产物电泳结果表明 , dNT Ps浓度在 0. 12 ～ 0. 16 mmol /L 时 , 具有 较
好的扩增结果.
Taq酶使用浓度过高不仅容易产生非特异性扩增产物 , 而且成本高[ 15] ;Taq酶使用浓度过低则会导致
产物合成效率下降 , 本研究通过正交设计及单因子试验 , 发现在 20 μL 反应体系中 , Taq酶在 1. 0 U 时 ,
扩增的条带最为清晰 , 重复性也最好.
引物与模板 DNA结合程度和结合量是影响 PCR扩增产率和稳定性的主要因子. 引物浓度太低 , 导致
扩增产物减少 , 甚至不能通过电泳检测出;浓度太高 , 则容易形成引物二聚体 , 或者导致非特异性扩增 , 严
重影响试验结果. 本研究的正交设计优化反应体系以及单因子试验结论均表明 , 引物浓度在 0. 2 ～
0. 4 μmo l/L时 , 扩增条带较清晰 , 以引物浓度为 0. 3μmol /L 时 , 扩增条带最为清楚 , 背景最少.
在柑桔类 ISSR研究中 , 大多添加 1. 6%～ 2. 0%的甲酰胺 , 有的还添加 10 mM ol /L 的硫酸氨 , 以降低
扩增产物的背景干扰 , 其机理可能是加入甲酰胺影响了引物和模板的退火和结合温度[ 5 , 18] . 本研究中未添
加这 2种试剂 , 得到的扩增图谱效果较佳. 由此说明 , 在保证了高纯度模板 DNA和适宜的扩增体系后 , 不
添加甲酰胺 、硫酸氨等化学试药剂也能得到较好的实验结果.
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Establishment and Optimization of the
ISSR Reaction System for Fortunella Swingle
ZHU Wen-bi , 　ZHANG Lian-feng , 　HE　Qiao ,
GUO Qi-gao , 　LIANG Guo-lu
School of Horticulture and Landscape Architecture , Southwest Universi ty , Chongqing 400716 , China
Abstract:The o rthogonal design experiment and the sing le-factor expe riment w ere combined , in w hich
Fortunel la crassi folia Sw ing le genome DNA was used as the template , to screen for the optimum combi-
nations o f the main inf luencing facto rs of the ISSR react ion system of the f ruit . The opt imum concentra-
tions of M g2+ , dN TPs , Taq DNA polymerase , primer , template DNA in 20 μL react ion sy stem w ere
1. 60mmo l /L , 0. 15 mmol / L , 1. 0 U , 0. 2 μmol /L , 1. 2 ng /μL , respectively. Ampli ficat ions of 21 varie-
ties of Fortunella were made w ith this sy stem , the results o f w hich confi rmed its stabi lization and reliabili-
ty .
Key words:ISSR;Fortunel la;optimizat ion
责任编辑　陈绍兰　　　　
100 西南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　第 29卷