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石海椒组织培养研究



全 文 :·生物技术· 北方园艺2012(05):130~132
第一作者简介:古玉(1981-),女,四川成都人,硕士,实验师,现主
要从事药用植物资源的开发利用研究工作。E-mail:guyu632@
qq.com。
基金项目:四川农业大学教学质量推进计划资助项目。
收稿日期:2011-12-14
石海椒组织培养研究
古   玉,李   龙,许   强
(四川农业大学 生命理学院,四川 雅安625014)
  摘 要:以石海椒愈伤组织为试材,研究不同培养基和激素配比对不定芽分化和不定根诱导的
影响,以建立石海椒快繁体系。结果表明:石海椒愈伤组织不定芽分化最佳配方为MS+1.5mg/L
6-BA+0.3mg/L NAA,不定根诱导最佳培养条件为1/2MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L VB1。
关键词:石海椒;不定芽分化;不定根诱导
中图分类号:S 567.79 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2012)05-0130-03
  石海椒[Reinwardtia trigyna(Roxb.)Planch.]为亚
麻科石海椒属多年生常绿半灌木,别名金雀梅、黄亚麻、
迎春柳,在《全国中草药汇编》中亦名过山青,产于中国
四川、云南、贵州、湖北等地。喜生于石灰岩形成的土
壤,常见于路旁、山坡、岩石或沟边。因其叶片四季常
青,花数多、花期长,花色金黄典雅,香气淡雅、观赏性极
高,目前在热带亚热带园林中广为种植,也作为盆景栽
培。始载《四川中药志》,其嫩枝、茎和叶供药用,性寒味
甘,能清小肠湿热、利尿。用于黄疸型肝炎、肾炎、小便
不利、鼻衄[1]。据初步研究,其含有强心苷、酚类、三萜皂
苷等,可作为药用植物进一步研究。石海椒以扦插和分
株繁殖,大面积和产业化栽培受到限制。目前国内外关
于石海椒的报道很少,仅在观赏价值、栽培方法和生物
学特性[2]等方面有报道,而对其组织培养仅古玉等[3]进
行了愈伤组织诱导和增殖研究。该试验旨在前期试验
基础上,研究建立和完善石海椒快速繁育体系的条件,
为利用生物技术实施品种繁育、种苗工厂化生产及有效
成分获取奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
石海椒幼嫩叶片,于6月中旬采至四川雅安老板山
(海拔约500m)。
1.2 试验方法
1.2.1 愈伤组织诱导及增殖 按照试验前期筛选出的
最优愈伤组织培养及增殖条件[3]对幼嫩叶片进行培养,
获得生长良好的愈伤组织。
1.2.2 不定芽的分化 将生长良好的愈伤组织以 MS
为基本培养基,附加不同浓度细胞分裂素6-BA(1.0、
1.5、2.0mg/L)和生长素NAA(0.3、0.6、0.9mg/L),采
用随机区组试验设计。共9个处理,5次重复,每重复20
个材料。每天观察芽开始分化的时间,20d时统计分化
成芽的数量,观察芽增殖情况。计算芽分化率。用Spss
软件进行方差分析。采用单因素方差分析(One-Way
ANOVA)的LSD多重比较法(Multiple Comparisons)分
析筛选最优配方培养基。芽分化率(%)=成芽个数/接
种愈伤组织数×100。
1.2.3 生根培养 当无菌苗生长到2cm左右时,将其
转入生根培养基中诱导生根。以1/2MS为基本培养基,
添加不同浓度生长素NAA(1.0、1.5、2.0mg/L)或IAA
(2.0、3.0、4.0mg/L),附加VB10.5mg/L,于25℃进行
生根培养。共6个处理,3次重复,每重复10个材料。
5d后开始观察根分化的时间,15d时统计生根的数量
及生长情况。计算生根率。用Spss软件进行方差分析。
采用单因素方差分析的LSD多重比较法进行差异显著
性分析,以筛选最优配方培养基。生根率(%)=生根无
菌苗数/接种无菌苗数×100。
1.2.4 练苗与移栽 当大部分根长达4cm以上时,将
培养瓶置于温棚中练苗1周,取出生根苗,洗净根部附
着的培养基,移入花卉土中。保持温度25℃左右、空气
湿度85%以上和光照强度为70~110μmol·m
-2·s-1。
2 结果与分析
2.1 不定芽的分化
接种后的4d内,愈伤组织变绿,增大;第8天左右
有小突起,持续到第14天左右出现小芽孢,第16天左右
长出微透明的绿色幼芽,幼芽生长缓慢,8d左右生长到
约2cm(图1)。由表1可知,在6-BA 1.5mg/L,NAA
0.3mg/L,即6-BA∶NAA=5∶1时芽的分化率最高,达
92%,极显著高于其它处理组。NAA为0.3mg/L低浓
度时,6-BA在1.5mg/L达到最高分化率,浓度过高、低
031
北方园艺2012(05):130~132 ·生物技术·
浓度时都会降低分化率。NAA为0.6和0.9mg/L中
高浓度时,随着6-BA浓度增加,分化率升高。根据
6-BA∶NAA的比值,随着比值减小,不定芽分化率呈现
先升高后降低的趋势;故细胞分裂素与生长素的比例过
大或过小都会影响芽的分化。总体来看,6-BA的浓度对
芽分化的影响较NAA大。
表1 各处理组间芽分化率差异显著性分析
处理
组合
6-BA
/mg·L-1
NAA
/mg·L-1
6-BA∶NAA
平均芽分
化率/%
方差齐性
检验
差异显著性
95% 99%
1  1.0  0.3  10∶3  78.00 Sig.=0.064 b B
2  1.5  0.3  5∶1  92.00 Sig.>0.05, a  A
3  2.0  0.3  20∶3  78.00 差异不显著 b  B
4  1.0  0.6  5∶3  29.00 e E
5  1.5  0.6  5∶2  64.00 c C
6  2.0  0.6  10∶3  79.00 ab  B
7  1.0  0.9  10∶9  9.00 f F
8  1.5  0.9  5∶3  30.00 e E
9  2.0  0.9  20∶9  56.00 cd  D
2.2 生根诱导
在接种后6d诱导出透明嫩白色的根,9d时根长
入培养基,此时根长约1.5cm,根数较多(图2),15d左
右根长能达到4cm。石海椒在NAA中生根较快,不定
芽生长健壮,在IAA中生根相对较慢,且植株生长瘦弱。
由表2可知,NAA对石海椒生根诱导效果极显著优于
IAA。由表3可知,NAA 为1.5mg/L时生根率为
95%,极显著高于其它各处理。NAA浓度过高和过低
都不利于生根。IAA在2.0~4.0mg/L浓度间,浓度与
生根率呈正相关,在4.0mg/L时达到63.33%。
表2 激素类型对生根的影响
激素 平均生根率/% 方差齐性检验 差异显著性
NAA  73.89 Sig.=0.587>0.05, Sig.=0.006<0.01,
IAA  41.11 差异不显著 差异极显著
  表3 各处理组间生根率差异显著性分析
处理 激素
浓度
/mg·L-1
平均生根率
/%
方差齐性检验
差异显著性
95% 99%
1 NAA  1.0  45.00 Sig.=0.674, d  D
2 NAA  1.5  95.00 Sig.>0.05, a  A
3 NAA  2.0  81.67 差异不显著 b  B
4 IAA  2.0  16.67 e E
5 IAA  3.0  43.33 d D
6 IAA  4.0  63.33 c C
2.3 无菌苗的驯化与移栽
试管苗移栽到基质中,经历绿色、稍微变黄、再变绿
的过程,到12d左右长出新叶(图3、4),生根的石海椒组
培苗经过练苗移栽后,1周内不浇水,成活率可达81%。
移栽2周后可进行正常的水、肥、药等人工管理。
3 讨论与结论
石海椒为西南地区分布广泛的药用植物,观赏性极
高,全国多有栽培。但对其的研究和开发利用程度不
足,组织快繁的研究为其药理、毒理、栽培的深入研究提
供条件。初次分割愈伤组织时,在无菌滤纸上进行,发
现滤纸吸收大量愈伤组织水分,导致材料接种到培养基
中后极易枯萎。后改用在无菌报纸上分割材料,吸收水
分大大降低,材料未出现枯萎现象,且报纸价格低廉易
得、硬度较大,更好分割材料。不定芽的诱导过程中,有
些未用来做不定根诱导的材料长期生长在不定芽诱导
培养基中,较长一段时间后也长出了根,可能是因为在
芽诱导培养基中细胞分裂素大量被消耗,而生长素消耗
较慢,以至一段时间后生长素的浓度适合诱导出根。也
可能是石海椒幼芽产生的次生代谢产物能诱导生根。
该试验采用幼叶为外植体诱导出愈伤组织,然后分
化出芽、根的方法,此法好处是培养量大,能长期获得材
料,可大大降低生产成本,故工厂化生产时,可考虑用此
法[4]。试管苗要顺利完成从试管内到外界的适应过程,
移栽前的练苗非常重要[5]。练苗能提高试管苗对外界
环境的抵抗力,使其从一个完全封闭的无菌环境中进入
完全开放的环境中间过渡,适宜的练苗过程,能增强植
株的抵抗力,对移栽后的成活至关重要。该试验在移栽
前将封口膜打开2~3d后才将其移栽到灭菌的花卉土
中,以让其慢慢适应外界环境条件。移栽的前2周尽量
保持较高的空气湿度。
根据试验结果石海椒愈伤组织的不定芽诱导最佳
培养条件为MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA,无
菌苗不定根诱导的最佳培养条件为1/2MS+1.5mg/L
NAA+0.5mg/L VB1,所有的培养基均附加1.0%的琼
脂,3%的蔗糖,pH 6.2。培养室温度为(25±2)℃,光照
强度为70~110μmol·m
-2·s-1,光照时间8h/d。
参考文献
[1] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(下册)[M].北京:人民卫
生出版社,1996:230.
[2] 彭世逞.野生花卉石海椒的生物学特性观察和栽培[J].西昌学院学
报(自然科学版),2008,22(2):1-3.
[3] 古玉,许强,李龙.石海椒愈伤组织诱导与增殖研究[J].北方园艺,
2011(9):130-134.
[4] 陈耀峰.植物组织与细胞培养[M].北京:中国农业出版社,2007:58-64.
[5] 张敏,张曙光,孙红绪.重瓣矮牵牛的组织培养和快速繁殖[J].植物
生理学通讯,2003,39(2):144.
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·生物技术· 北方园艺2012(05):132~134
第一作者简介:余丽莹(1974-),女,硕士,副研究员,现主要从事药
用植物资源学研究和药用植物保育工作。
基金项目:广西药用植物园青年基金资助项目(桂药基200810);
广西自然科学基金资助项目(桂科自0447040)。
收稿日期:2011-12-05
铁皮石斛幼苗壮苗培养的研究
余 丽 莹1,周 雅 琴1,韦   莹1,余 海 霞1,谭 小 明1,2
(1.广西药用植物园,广西 南宁530023;2.中国医学科学院-北京协和医学院 药用植物研究所药用植物菌根研究室,北京100094)
  摘 要:以铁皮石斛无菌幼苗为外植体,研究不同基本培养基、生长激素、天然添加物、蔗糖
浓度和活性炭浓度对幼苗壮苗的影响。结果表明:苗龄4个月的铁皮石斛幼苗最佳的壮苗培养
基为:1/2MS+1.0mg/L NAA+30%椰汁+30g/L蔗糖+2g/L活性炭+8g/L琼脂,pH 5.8。
关键词:铁皮石斛幼苗;壮苗培养基;椰汁;NAA
中图分类号:S 682.31 文献标识码:B 文章编号:1001-0009(2012)05-0132-03
  铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)
属兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草
本。常生长在海拔达1 600m的山坡半阴湿的岩石上,
在我国主要分布云南东南部(石屏、文山、麻粟坡、西畴)、
广西西北部(天峨)和浙江东部(天台、仙居)等地[1];是
《中国药典》2010版收录的铁皮石斛药材的原植物,是石
斛药材中最珍贵的品种,具有滋阴清热、益胃生津的功
效,用于热病津伤、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕、病后
虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明、筋骨痿软[2]。
近年来化学和药理研究表明铁皮石斛中含有丰富的多
糖类成分[3],这种多糖成分具有增强人体免疫力、防癌
抗癌、恢复嗓音等功效[4-5]。加工后的铁皮石斛俗称为
“铁皮枫斗”[2],市场价格昂贵,是一种医用价值和经济价
值都很高的名贵中药[6-7]。近年来由于过度采挖、原始
森林生态环境破坏等原因,铁皮石斛野生资源逐年减
少,而其对生境要求苛刻、自身繁殖率低等生理因素,导
   
致了铁皮石斛濒临灭绝[8],现已被列入《中国植物红皮
书》[9]。为了保护这一濒危的名贵中药,国内的学者开
展了铁皮石斛的组培快繁、种子萌发及菌根方面的研
究[10-13],取得了一定的进展。但在铁皮石斛幼苗壮苗培
养方面研究得还不够细致,目前铁皮石斛试管苗弱、移
栽成活率低、壮苗周期长还是铁皮石斛大规模生产的障
碍。为此,该试验探讨了基本培养基、生长激素、天然添
加物和蔗糖及活性炭等对铁皮石斛幼苗壮苗的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
铁皮石斛(D.officinale)蒴果,采自云南西双版纳
(图1左)。将铁皮石斛蒴果用70%的乙醇消毒1min,
2.5%次氯酸钠消毒10min,无菌水冲洗3次。然后,用
无菌的手术刀切开果皮取出种子,播种在N6培养基上。
然后在25℃光暗交替培养4个月,即可获得该研究所需
的无菌幼苗(图1右),幼苗有1~2条根,真叶2~3片。
1.2 试验方法
1.2.1 基本培养基对幼苗生长的影响 研究1/2MS
(大量元素减半)、MS、B5、KC、WT等5种不同基本培养
基对幼苗生长的影响。分别添加NAA 1.0mg/L、30%
椰汁和30g/L蔗糖


Study on Tissue Culture of Reinwardtia trigyna(Roxb.)Planch.
GU Yu,LI Long,XU Qiang
(Colege of Biology and Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an,Sichuan 625014)
Abstract:With R.trigynaas material,influence of adventious bud diferentiation and adventitious root induced that efect by
diferent medium and auxin ratio were studied,to establish Reinwardtiatrigyna(Roxb.)Planch.rapid propagation system.
The results showed that the best condition for R.trigynaadventitious bud diferentiation was MS+1.5mg/L 6-BA+0.3
mg/L NAA,and the best culture conditions for adventitious roots induced was 1/2MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L VB1.
Key words:Reinwardtia trigyna(Roxb.)Planch.;adventitious bud diferentiation;adventitious roots induced
231