全 文 ：1 95 7年 12月
第 9卷第 4期
西 南 农 业 大 学 学 报 vo ` 地 . 4
J o ur n a l o f So ut h we s t Ag r i e ul t ur a l Un i v e
r s i t yD e e一 9 5 7
柳橙胚愈伤组织耐盐性研究 ` ”
陈 . 春 张进仁 吴安仁 离 峰
( 中国农业科学院柑桔研 究所 )
〔提要 〕柳橙 ( C诬t r s us 玄。 e 。 。 15 Os b e e k )胚细胞无 性 系 ( L 6 7一 I细胞系 )的
生长量 随培养基中N a C I浓度的升高而 降低 。 0 . 5肠N a CI时 , 生 长童 约 为 时 照 的
50 肠 。 时盐临界浓度 为 2帕 。 巨型 细胞数量 与N a C I浓度呈 负相关 。 L 76 一 I细 胞系
外渗液 电导率与N a C I浓度呈 显著 负相关 。 N a C I造成细胞内N a + 积 军 , K 十 、 C a ’ 十 、
M g
’ + 、
M n
’ ` 、
Z n
’ +含量减少 , 并对过乳化物醉 同工膝酶语产生明显的影响 ; 过 乳化
物晦活性受到抑制 , 且随 N a C I浓度升高 , 活性相应下降 。 蛋白质氛基酸分析衣 明 ,
N a C I时其种类 几乎没有影响 , 8种主要蛋白质氛基酸含童与N o C I浓度呈 负相 关 。
过氛化物酶活性和 几种主要的蛋白质氛基酸含量可作 为抗盆细胞系筛选和 评 价 的
生理 生化指标 . 试验所得 L 86 一 I 细胞系的衬盆性比 L 76 一 1 细胞系高 .
主题词 : 胚 ; 耐盐性 : 愈伤组织 : / 柳橙 。
柑桔类果树对盐分相当敏感 , 盐分可导致柑桔焦叶 、 枯枝 、 生长抑制和品质变劣等 ; 砧木
对盐也很敏感 , 土壤中可溶性盐的存在和增加 , 往往成为柑桔栽培峋限制因子 。随着我国某些
柑桔生产区土壤盐渍化加剧和海涂柑桔生产的发展 , 选育抗盐品系已成为一 个急待解决的问
题 。 为此 , 本文探讨了盐对柳粗 ( C i t r u : : 认 ` 。 15 O sb ce k ) 胚 细 胞无性系的生长特性和生
理生化指标的影晌以及耐盐性和盐容原理 , 试图为通过组织和细胞培养法筛选相桔杭盐细胞
系提供理论依据 。
一 、 材 料 与 方 法
试材来 自1 9 76 年 4月柳橙胚培养 〔 ` ’ 获得的胚性愈伤组织细胞无性系 ( 简称 L 76 一 I细胞
系 ) , 继代培养达 10 年和 45 代以上 。
若本培养基为 M T , 另加 o . s p p m n引噪 乙酸 ( I B 入 ) 和 s o o p p m酪蛋白水 鲜 物 ( C H ) ,
蔗糖 5肠 。 再分别加入 。 、 0 . 5帕 、 l 肠 、 2肠 、 3帕和 5肠 ( w / v ) 的N a C I。 消毒前调节 p H至 5 . 5 ,
,
. ` k g / c m ’
、 ` 2 1℃热压灭声 2 0分钟 。 培养室温度 2 5士 2℃ , 光照 1 4 h / d , 光 强 2 0 0 o l x ( 荧
光灯 ) 。
培并 : L 76 一 I细胞经 20 天连续代 3次后 ,称重并接入上述培养基 , 每处理 25 管 . 25 和 50 天后 ,
. 今加 木项工作的还有张永芳 、 井康同志 .
, . 19 8 1年1月皿` 日收川 ,
DOI : 10. 13718 /j . cnki . xdzk. 1987. 04. 023
调查各处理愈伤组织增重 、 颇色和致密度等 , 并进行细胞活体观察 、 计数。
( 一 ) 以 o . l m o l , p H s . 5的 T r i s一 H C I缓冲液冰冻提
取 , 按 K oc h b “ 等 ` ” 的方法 , 以愈创木酚作供氢体 , 72 1型分光光度计 4 7 0 n m波长比色侧定
过载化物酶活性 ; ( 2 ) 按张进仁等 r ” 的方法 , 用 7肠不连续系统聚丙稀酞胺凝胶垂直板电
泳检验过氧化物酶同工酶谱 : ( 3 ) 以盐酸水解 B E C K M A N 1 2 1M B型氛基酸自动分析仪侧
定蛋白质氛基酸含量 : ( 4 ) 用硝酸一高抓酸消化 , 日本岛津 A A一 64 6型原子吸收光谱仪测
定离子含最 , 并以 0 0 5一 1 1八型电导仪测定愈伤组织外渗液电导率。 重复 3 次 , 取其 平 均
值。
二 、 结 果 与 分 析
( 一 ) L 7 6一 I细胞系的耐盐性
长期继代培养的柳橙胚 L 7 6一 I细胞系已完全 ` 驯化 ” , 具有较好的遗传稳定性和再 分化
能力 , 是筛选抗盐细胞系的理想试材 。 用不同浓度的N a cl 进行试验 , 接种后几天 , 各 处 理
间差别不大 , 约 15 天后开始出现差异 , 30 天后更明显 。 2肠以上的 , 先停止生长 , 愈伤 组 织
变致密 , 逐渐萎缩 , 最后全部褐变死亡 ; 1肠的生长缓慢 , 同时逐渐揭变 、 致密 ,丧失再分化
能力 ; 0 . 5肠增 殖 明 显 ( 图 3 ) 。 培养 25 和 50 天后 , 0 . 5 肠N a C I的愈伤组织生长量 ( 增重 )
分别为对服的 57 . 。呱和 45 . 1肠 , 1帕的分别为 26 . 2肠和 1 . 8铂 , 2肠的 25 天为 2 . 3肠 , 5。天 全
部葵缩死亡 。 可以看出 , 培养时间越长 , 细胞受伤容越严 , ( 图 1 ) 。
衰 1 N a cl 对 L 8 6一 I细脸系生长的影晌
N a C I浓度
(肠 , W / V )
每管接入愈伤组织鲜重
(m g )
’
培养 25 天后 , : 愈伤组织 } 与对照的
每耸彝代粤织 ! 增 , 奥 } 百 ,兮、 比,缈 g) 一 i里州竺竖 {一竺三一
, 5 2 9 ” 0 7 7
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△艺爪 胶
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\ 认 f t浓 度
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己JnJ月口.月`目`粗二n舀月`91,妇`只ùnù心口,山份Jc,曰心`,d
。 2 5带的平均位 圈 I N a cl 对 L 7 6一 I细脸系生长的形晌
N a C 、浓度为。 . 5务时 , 培养 10 天后愈伤组织即开始增殖 , 20 天后 , 愈伤组织颜色比对照
深 , 疏 松度 不 如对照 ; 到 30 天时 , 出现有少量与对照相同的白色疏 松 愈 伤 组 织 ( 简 称
8L 6
一 I 细胞系 ) , 但与上述愈伤组织有明显的区别 。 将其转入前述培养基中 , 再 分 别 加 入
不同浓度的N a C I , 经 25 天测其增重表明 ( 表 1 ) , 。 . 5肠 N a cl 的生长量为对照的6 9 . 6 肠 , 比
L 76 一 I 细胞系 25 天时 ( 57 . 0 帕 ) 多 12 . 6肠 ; 1 . 0肠为对照的 38 . 1肠 , 比L 76 一 I 细胞 系 ( 26 . 2%)
多 1 1 . 9帕。 可见 , N a a 对 L 86 一 I 细胞系生长的抑制作用远 比对 L 76 一 I 细胞 系为小 .
4母4
张进仁等发现 , r 射线辐照愈伤组织后 , 会产生一种形态特别 、 比正常细胞大 3一 4倍 的
巨型细胞 , 并认为它是愈伤组织受伤害的表现形式之一 。 本试验镜检也发现巨型 细 胞 ( 图
3 )
, 在 25 和 50 天时计数 , 0 . 5% N a C I中 , 巨型细胞最多 , 分别占观察细胞总数的 9 . 毗 和
, .7 6眠 随 N aC墩度增加 , 巨型细胞数减少 , 50 天比 25 天少 。 L 8 6一 l 细胞系镜检未发现 巨型
细胞 。 我们认为 , 巨型细胞是一种变态细胞 , 它的形成不能简单地以渗透压的影响来解释 。
生长抑制与巨型细胞数有相关性 , 盐对生长的抑制越严重 , 巨型细胞越少 。 巨型细胞并不是
抗盐细胞 , 进一步的伤害 ( 如增加 N a CI 浓度和延长培养时间 ) 会导致它的死亡和解体 。
综上所述 , L 76 一 I 细胞系对盐比较敏感 , 0 . 5肠 N a cl 即衰现症状 , 生长 t 约为 对 瓜的
I2/
;
2肠为其耐盐临界浓度 . 因此 , 若进行筛选 , 应从 0 . 5帕为基本浓度 。 试验所得 L 8 6一 I 细
胞系的耐盐性比 L 76 一 I 细胞系高 。
奋
( 二 ) N a C I对L 7 6一 I 细胞系生理生化指标的影响
细胞膜的透性是评定不良环境下细胞受盐害的生理指标之一 。 L 7 6一 I 细胞系外渗液 电导
率测定表明 ( 表 2 ) , N a C I对细胞膜有严重的伤害作用 ,在 0 . 5肠下 , 电导率几乎为对照的 l倍 ,
随N a CI 浓度增加 , 电导率越大 。这与细胞系的可见受害症状和生长量 变化趋势是 一 致 的 。 因
此 , N a CI 明显地使细胞膜透性增大 , 破坏了细胞膜的选择透性机制和细胞的渗 透 平 衡 。 对
7L 6
一 I 细胞系的 6种金属离子分析结果 ( 表 3 ) , 。 . 5肠的 N +a 含量比对照高 , 且 K + 、 C “ ’ + 、
衰 2 N a cl 对 L了6 一 I 衰 3 不 同N a cl 浓度下 L了6一 I 细胞系离子含 l 比较
….`lselse..weN a C I 离子含量口白泊` 月` 、 网一ùùō黑+、尸rK肠(肠 , W / v ) N a +(帕 ) . M g , + { M n J +(肠 )…!lsele卫lew,e
4 4 0
6 7 0
7 6 2 4
1 2 6 5
1 1 1 7
9 4 3 4
8 6 9 4
4 2 7 1
C a
Z +
(肠 )
0
.
5 3 5 8
0
.
3 3 3 1
0
.
3 0 9 7
0
.
2 3 0 4
0
.
! 6 0 4
0
.
1 1 3 7
0
.
1 2 6 6
0
.
0 9 8 1
0
.
0 5 5 3
0
.
0 4 3 2
0
.
0 4 2 5
0
.
0 3 2 7
Z n Z +
( P P m )
3 9
.
6 3
3 7
。
1 0
2 7
.
9 8
2 4
.
0 0
1 9
.
3 0
1 7
.
4 2
二 三次洲定的平均位 · 占总干 重的百分率
M g
’ + 、
M n
’ 十和 z n ’ 十含量降低 , 随N a CI 浓度的增加 , 这一趋势更加明显 。 可 以看出 , N . cl
引起了细胞内离子浓度变化 , N o t积票 , 其他离子含 t 减少 , 破坏了细胞的营养平衡 , 形 晌
共正常代谢 .
酶水平作为细胞生长的生化特征之一 , 与细胞生长呈因果关系 。 B o r sn et i n 〔 ” 指 出 ,
有人论证过 : “ 在盐溃条件下较慢的生长速度 , 必然是因为生长所需的酶被限制所引起 ” 。
W ie m b
e
gr 测定了含高浓度的各种 盐的培养基中 , 豌豆苗 18 种酶的活性都不受培养 基 中 盐
的影响 。 但本试验测定 ( 表 4 ) 表明 , 醉活性随 N a cl 浓度增加而减弱 , 这与愈伤组织生长 t
变化趋势一致 . 过氧化物酶是植物呼吸代谢的末端氧化酶之 一 , 其主要作用是控制 细 胞 代
谢 , 可 以认为 , N a CI 至少影响了细胞的代谢水平 。
4 6每
衰4 N a cl对 L 76 一 I细胞系
过级化物醉活性的璐晌
N a C I浓度
(劳 , W / V )
O
。
5
1
。
O
酶 活 性 卜
( 0
.
D加婿白m/ 通n )
0
.
1 9 2
O
、
1 7 4
0
.
0 7 8
O
、
0 3 6
0
.
0 3 2
{ ( )
·
0 2 6
. 三次侧定的平均但 _
人 : 对照 B : 0 . 5肠N a C 乙 C : 1肠 N a c l
D : 2肠N a c ” “ : 3呱 N Q C 乙 F : 5务N a C艺 奋
图 Z N : cl 对 I J 76 一 I 细胞系过氛化物碑同工阵碗漪的璐 .
1
. 。 巨型细胞 b正常细胞 ( x r 0 0 0 )
2 不同浓度下愈伤组织生长情况 ( 自左至右 : 0 , 。 . 5肠 , 2嗬 )
3
. 过氧化物酶同工酉翻斌怜( N a cl 浓度 : A : O , B : 。 . 5肠 , C : 1肠
D
:
2肠 , E : 3肠 , F : 5临 )
圈 3 不同浓度 N a a 对 L 76 一 I 细胞系的形晌 ( 培养 5 0天 )
同工酶酶谱变化往往代表生物的不同代谢途径或水平 , 从而反映了生物不同遗传特征 、 遗
传物质的变化或基因表达的调控差异 。 因此 , 同工酶分析对于评价细脚的抗盐特 性 和 培 育
46 6
奋抚盐作物都具有一定的意义 。 本试验对各处理的过氧化物酶同工酶酶谱的分析 (图 2、 图3 )发
现 , 盆对同工醉醉谱带数和谱带强弱都有影晌 . F xl 、 2无任何变化 , P x 4 、 了随盐浓度墩高而减肠
消失 , 各种盐浓度下均出现 了对照所没有的 P x s 、 6两条谱带 , P x 3随盐浓度增加而加强 . 这支
持 了 P a u : 。 ac :、 a只 等 提 出的 “ 过氧化物酶同工酶系具多态性 , 易受外界条件影响而变动 。 这
种自我调节 , 保证了植物对不 良环境的适应 ” 的论断 , 其变化机制可按陈永强等的 观点来解
释 : ( 1 ) 基因的诱发突变 ; ( 艺 ) 反馈调节作用导致调控水平变化 ; ( 3 ) 高 浓 度 盐对翻译
后醉分子构象的影响。
本试验测定了愈伤组织蛋白质氨基酸含量。 结果表明 , 对照和各处理蛋白质橄甚吸种挑
若本上没有区别 , 均含有天门冬氨酸 、 苏氨酸 、 丝氨酸 、谷氨酸 、 甘氨酸 、 亮氨酸 、异亮氮酸 、 ,
丙纸酸以及甲硫氮酸 、 苯丙氮酸、 酪氨酸 、 撷氛酸 、 赖氨酸 、 组氨酸和精氨酸 。 其中 , 前 8
种在蛋白质代谢中占主导地位 , 其含量随N a CI 浓度增加 而减少 : 仅在对照和 0 . 5肠 N a C I处
理中检出脯氨酸 , 。 . 6帕时其含量约为对照的 2 . 5倍。 可 以看出 , 由 于 N a CI 抑制了某些蛋 白
质的代谢水平 , 致使一些蛋 自质氨基酸含量减少 ; 另外一些蛋 白质氨基酸含量变化无规律可
循 , 可能意味着蛋 白质某些代谢途径被改变 。 虽然很多报道认为 , 在盐演条件下 , 普遍存在
游离脯氨酸积累现象【` j , 但本试验测定的是蛋 白质脯氨酸 , 其含量变化 规律与游离脯氮酸
不一致。 似可用 S et u ar d等的 “ 游离氨基酸的相对比例绝不反映它们在蛋白质中 的 结 合 频
率” 的论断来解释 。
三 、 讨 论
本
细胞的盐害主要是由水分胁迫产生的所谓 “ 渗透效应 ” 所引起 ` , ’ 。 细胞正常生长 稿要
维持一定的渗透压 , 以满足它对水分的需求。 当环悦的盐分过多时 , 水势降低 , 造成细胞的
水逆境 , 致使原生从脱水 , 细胞生长受抑制甚至死亡 . 另外 , 盐分可导致细胞的性质产生适
应性变化 ( 即脂类一蛋白质一 A T P酶系统变化 ) , 使细胞膜对离子的主动运转受影响 , 膜透
性增大 ( 本试验结果 ) , 其选择透性机制被破坏 。 `由于环境中N +a 和lC 一相对含量 高 , 造 成
了细胞内N +a ( 或许还有C I一 ) 的积累。 在这种情况下 , 细胞要被动地维持渗透平衡 , 对 其
他离子 ( 如 K + 、 C a ’ + 、 M g ’ 十等 ) 的吸收必然会减少 , 致使细胞内离子种类和浓度 发 生 变
化 , 营养失去平衡 , 造成某些缺素症状 , 这就是 “ 专一离子效应 ” 。 本试验结果表明 , 上述
两种效应可能影响到细胞的呼吸代谢水平 ( 酶水平 ) 、 蛋白质代谢 、 遗传物质对曲的调控和
. 因襄达等 , 因而表现出盐害症状 。 B er n s t ie n认为 , 柑桔类果树盐害主要由 N +a 和 C I一 引
起。 P at il 等 测定 了 在各种盐浓度下 , 印度酸桔实生苗叶片的离子含量 , 都是N +a 积 累 , K 十 、
C扩 + 、 M g ’ +含量减少 , w . 鲁瑟等认为 , 在柑桔栽培中 , N +a 积累尤为不利 , 它引起根 、 叶吸
收和积累的差异以及营养不平衡 ; C I一也有较明显的毒害作用 。本试验结果与上述结论一致。
说 . 大田植株的盐害与组织培养细胞系盐容的原理是一致的。 为培育抗盐品种而进行抗盆细
. 系的 . 涟 , 应以N a cl 为主要选择荆 。
在盐害中 , 植物生理生化 J扮标文化的研亢 已逐渐引起人们的注 .点。 K “ s ler 等分析了 在
加盐的培养基中 , 甜莱檬小苗叶片的脱氧核粘核酸儿乎不受盐的纷响 , 而核糖核 酸 和 蛋 白
4 6 7
质对盐高度敏感。 因此 , 将它们作为盐度影响的指标 , 鉴别出印度酸桔抗盐 性 高 , 甜 莱檬
抗盐性低 。 本试验结果表明 , L 76 一 I 细胞系蛋白质代谢对盐很敏感 , 8种 主要 蛋 白 质 氮基
酸含量与N a C I浓度呈负相关 ; 过氧化物酶水平对盐也相当敏感 。 因此 , 过妞化物映 水平和
几种主要蛋白质奴基酸含 t 可作 为抗盐细胞系筛选和评价的生理生化指标 . 过氧化物酶 同工
酶酶谱的改变表明 , 盐可能引起基因调控差异或基因诱发突变 。 这可能是抗盐突变体的来源
之一 。
组织和细胞培养中 , 细胞有遗传的保守性 , 也有其变异性。 S e r r a测定 , 基因的自然突
变率为 10 一 ’ 。 N a b or 等认为 , 在含 1 0 ’ 个 以上未经诱变剂诱变细胞的细胞系中 , 存在 “ 自发
显性 ” 或 “ 等显性” 突变。 目前 , 在烟草抗盐细胞系筛选工作中 , 有经诱变剂诱变和不经诱
变两种 , 以N a C I作选择剂 , 后者利用基因的自然突变 , 能避免诱变剂诱变时多个基 因突 变
引起的某些优良性状改变 ; 有人 以同一浓度重复筛选 〔 ` ’ ,也有人认为在筛选过程中抗盐性有
所提高 , 因 而 采用梯度增加的盐浓度反复筛选 〔 ” 一 这些方法可能对柑桔抗盐细胞系的筛选
有一定的参考价值 。 本试验证 明 , 用柑桔细胞无性系进行杭盐性筛选 , 可利用甚因自然突变
或选择剂引起的变异 , 不必用诱变荆诱变 . 以 N a cl 为选择荆进行筛选 , 0 . 5帕为起给浓度时 ,
有部分愈伤组织生长较好 ( 如 L “ 一 I 细脸系 ) , 将其转入 N a CI 浓度梯度增加的培养基中 ,
盆筛选 , 可获褥抗盐性较离的细胞系 .
今 考 文 橄
(一〕 王大元 、 张进仁 : ( 遗传学报 ) , 1 0 7 5 , 5 ( 2 ) , 1 3 3一 1 3 7
〔幻 张进仁等 : 《中国柑桔 ) , 1 9 5 3 , 1 3一 1 5
〔3〕 B e r n s t e i n著 、 张承圭译 : 《植物生理学通讯 》 , 1 9 5 1 , 5 , 4 7一 4 9
(们 汤章城 : 《植物生理学通讯 》 , 1 9 8 4 , 1 , 15 一 2t
〔5〕 K o e h b a , J . 、 L a v e e , 5 . , S p i e 明 l一 K o 丫 , p . : p l a n t & C e l l P h丫 5 1 0 1 . , 10 7 7 , 15 : 4 6 3一 ` 6 7
〔6〕 H a s e s a v a , p . M . e t a l : p l a n t & C e l l p h y s l o l . , 1 9 8 0 , 2 : 13 4 7一 135 5
〔7〕 W a t a d , A . A . e t a l : P l a n t p h y s i o l . 19 5 3 , 7 5 ( 3 ) : 6 2 4一6 2 9
4 6 8
S T U Y DO NT HE S A LT E N DU RA NC E O FC A L LU S F RO M T HE
EM Y B RO O F LIU C E H NG (C 派 t r“ :s ` , 。 n s i s O s b e c k )
C h e n S h a n e h u n
, Z h a n g J i n r e n
,
W
u A n r e n
,
G a o F e n g
弘
( C i t r u s R e s e a r
c
h I n s t i t u t e
,
C h i n e s e A e a d e m y o f A g r i e u l t u r a l S e i e n e e s )
A b 3 t r . C t
幸
分
T h e g r o w t h y i e ld o f L 7 6一 1 e e l l 矛 e l o n e d e r i v e d f r o m e m b r y o s o f L i u 一 C h e n g
( C 诬t r u s 5 1” e , : 应5 O s b e e k ) d e e r e a s e d a s t h e N a C I e o n e e n t r a t i o n i n e r e a s e d i n
m
e d i u m
.
A t t h e e o n e e n t r a t i o n o f 0
.
5呱 N a C I , t h e g r o w t h y i e ld w a s 5 0肠 l e s ,
t h a n t h e e o n t
r o l o n e
.
T h e e r i t i e a l e o n e e n t r a t i o n o f s a l t e n d u r a n e e w a s
2肠 . “ H u g e e e l l s ” w e r e o b s e r v e d u n d e r m i e r o s e o P e . T h e n u m b e r s o f t h e m
w e r e n e g a t i v e l y e o r r e l a t e d w i t h t h e N a C I e o n e e n t r a t i o n
.
T h e e x u d a t e e l e e 一
t r i e a l e o n d u e t i v i t i e s o f L 7 6一 1 e e l l e l o n e w e r e n e g a t i v e l y e o r r e l a t e d弓w i t h
t h e N a C I
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i n h i d i t e d t h e a e t i v i t y o f p e r o x i d a s e
.
T h e a e i v i t y o f p e r o x id a s e d e e r e a s e d
a s t h e N a C I e o n e e n t r a t i o n i n e r e a s e d
.
T h e
`
e o n t e n t s o f a m i n o a e i d s o f
p r o t e i n w e r e n o t i n f l u e n e e d b y N a C I
.
T h e s p e e i e s o f 8 m a i n a m i n o a e i d s o f
P r o t e i n w e r e n e g a t i v e l y e o r r e l a t i v e w i t h t h e N a C I e o n e e n t r a t i o n
.
T h e P e r -
o x id a s e a e t i v i t y a n d t h e e o n t e n t s o f二s e v e r a l m a i n a m i n o a e i d s o f p r o t e i n
e a n b e u s e d a s t h e P h y s i o l o g i e a l a n d b i o e h e m i e a l i n d e x f o r e v a l u a t i n g a n d
s e l e e t i n g s a l t t o l e r a n e e e e l l e l o n e s
.
I n a d d i t i o n
, t h e s a l t e n d u r a n e e o f t h e
e e l l e l o n e L s 6一 1 i n t h i s e x P e r i m e n t w a s
`
h i g h e r
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t h a n L 7 6 一1
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