全 文 ：本地早柑桔裂皮类病毒弱毒系的研究
杨 平 刘 勇 张奇亚 丁达明 严 森祥 程绍 南
(中国科学院武汉病毒研究所 ) (浙江省科学院柑桔研究所 、
引 言
柑桔裂皮病在世界柑桔产区普遍存在 ,
在长期无性繁殖的优良品系中尤为明显 。 此
病也为当今发现的 10 种 R N A 型的类 病毒 病
原之一 , 是最小的致病因子 。 其基因组大小
为 3 0~ 38 0个核普酸 , 虽不及编码蛋 白质基
因 , 但有较广的寄主范围 , 并在许多寄主 一上
产生强烈的症状 。 柑桔裂皮类病毒侵染柑桔
属的许多种 , 引起植株矮化 , 砧木部皮层开
裂或翘裂 , 烂根 ,最后植株死亡 。病原系机械
传播 , 耐高温 , 传毒强 , 蔓延快 , 严重威胁
生产 。
我们从甜橙的裂皮病植株分离到强毒系
( C E V
s
)
, 又从不表现明显症状的本地 早
植株分离到弱毒系 ( C E V 。 ) 。 本文报 导本
地早裂皮类病毒弱毒系的鉴定及其对甜橙裂
皮类病毒强毒系干扰效应试验的结果 。
材料和方法
一 、 病原 总 R N A 的制备 将本地 早 病
叶 、 卡特尼娜甜橙病叶以及 健树的叶组织 经
一加℃冷冻 ,加入 1 . 5体积 G P S缓冲 液 ( 0 . 1
M N a
。
H甲O ` , 0 . 6M N a C I , 1% S D S ,
0
.
5% 2一琉基乙醇 ) 和 1 . 5体积的水 饱 和酚
( 含 0 . 1% 8一经基喳琳 ) 一一三氯甲烷 ( 酚
: 氯仿 = 1 : 1 ) , 充分匀浆 , 8 0 0 0 r p m离
心幼分钟 ( o ℃ ) 。 取水相 , 再加入 1/ 4体
积的水饱和黔和 1/ 4体积的 氯仿 ,充分振动 ,
离心后取水相对蒸馏水透析过夜 <至少换水
一次 ) 。 加入醋酸钠使最终浓度为 0 . 2 M 。然
后加入 2 . 5体积的 95 % 冷乙醇沉淀核 酸 , 置
一 2 0 ℃ 2 小时 以上 , 1 0 0 0 0 r p m离心 3 0 分 钟
( 一 4 ℃ ) , 沉淀饼以真空干燥 , 得总 R N A 。
二 、 聚丙烯酸胺 凝胶电泳分析 采用 5%
聚丙烯酞胺和 T B E缓冲液系统 ( 90 m M T r -
15
,
9 0m M硼酸 , 3m M E D T A , P H S . 3 ) ,
管柱 1 . 0 火 12 (厘米 ) , 电流 4 ~ s m A /管 , 电
泳 3 小时 , 把胶取出浸入 0 . 05 纬甲苯胺兰的
7 %醋酸溶液 中染色 2一 3 分钟 , 然后置于
蒸馏水 中脱色 1 0小时以上 。
三 、 分子杂交 ( 一 ) 探针的合成 取
纯化的 C E V ( 0 . 1林g八 l ) 2:01 1抽干 , 加入磷酸
单醋酶于 37 ℃作用 20 分钟 , 然后在 80 ℃水浴
中保温一分钟 , 冰浴速冷 ,在 A T P底物存在
下加入 p o l y ( A ) , 3 0℃ 保温 4 0分钟 , 用
重蒸苯酚抽提 , 冷乙醇沉淀 , 真空干燥 , 加
入 d N T P ( S ) ( 含4 0 :: l a ” “ P 一 d 。 T P ) 和
R N
a s e , 于 37 ℃保温 3小时 , 用碱或核酸酶
除去模板 R N人 , 冷乙醇沉 淀 , 抽 干 后 为
c D N A
。
( 二 ) 杂交 把制备的总 RN A分
别点在处理过的硝酸纤维素膜上 ,予杂交后 ,
于 52 ℃与 。 D N A 杂交 16 小 时 , 杂 交结束后将
硝酸纤维素膜用 S S C及 S D S 溶液分别洗涤 ,
最后以放射性自显影进行杂交检查 。
四 、 生物侵染试验 以本地早病叶制备
的粗 R N A 及二次电泳纯的 R N A分别在爪哇
三七 ( G y 灯此 a a ur a nt i a 。 a ) 及美国蕃 茄
R扭馆 。 r ,植株上进行人工侵染试验 , 使 用换
种浓度为 1 0一 “ (1 0克鲜叶的总 R NA / 接种缓
冲液体积 ) , 按 S e犯 a n c i k及 H o r s t的 方 法
接种 , 以缓冲液为对照 。
五 、 C E V 千扰 C E V s效应试验 子 第
一次按种弱毒系 ( C E V ) , 12 天后 , 分别
再用弧毒系 ( C E V : ) 的总 R N A 及 纯化 的
R N A 进行第二次接种 ( 此时著茄 已长 成四
片叶子 ) , 置于室温28 一 35 ℃条件下培育 ,
增加人工光照 14一 1 6小时 , 每处理各 5一 12
株植物 , 试验历期 65 天 , 试验结束 , 测量各
处理植株的高度及株重 。
结 果
一 、 聚丙烯酞胺凝胶 电泳分析 从积砧
甜橙 健株及症状典型的卡特尼娜病株以及症
状不明显的构头橙砧本地早叶组织分别 提取
的总 R N A , 经 5 %聚丙烯酸胺 电泳 分析 结
果 , 上述两个毒系叶组织提取物中 , 均存在
健株所没有的低分子量核酸带 , 且两者特有
电泳带的位置无明显差别 , 均在宿主 7 一 9
5 R N A 之间 。 这种特异带核酸 溶 于 0 . 01 火
S S C缓冲溶液中 ( 0 . 1 5 M N a C I、 0 . 0 1 5 M柠
檬酸钠 , p H 7 . 5 )加入最终浓度为 2 ) g / m l的
牛胰核糖核酸酶 , 于 2 5℃保温 1 小时后 , 以
9 5% 冷乙醇回收 R N A , 再进行 电泳分析 ,结
果特异带完全消失 , 且随特异带的消失 , 其
侵染性也随同丧失 , 说 明这种特异带对核糖
核酸酶很为敏感 。
二 、 本地早 C E v ;一 R N A 与 c D N A 杂
交 将制备的本地早 C E V 一 R N A 点 在 经
过处理的硝酸纤维素膜上 , 先予杂交 , 再与
探针进行固相杂交 。 此外 , c D N A 探钎 还
与菊花矮化类病毒的 R N A 、 柑桔裂 皮 类病
毒强毒系的 R N A ,以及菊花褪绿斑驳类病毒
的 R N A 同时分别进行杂交试验 , 均 出 现健
株核酸制备物所没有的明显杂交斑 。
三 、 生物感染试验 以病株总核酸及纯
化的 C E V 。 .一 R N A侵染指示植物爪哇 三 七
和蕃茄 R ut g e r s , 以缓冲溶液接种作为 对照 ,
结果爪哇三七受卡特尼娜柑桔裂皮类病毒强
毒系侵染后 , 生长受到抑制 , 叶片卷曲 ( 偏
上性 ) , 叶面约褶 。 而本地早弱毒系 ,不论其
总 R N A或纯化R N A , 在爪哇三七植株上均
不显东症状 。 又卡特尼娜 C E V S 在爪哇 三七
上接种 18 天就出现症状 , 而本地早 C E V 在
两个月后仍无症状出现 。 这一结果与 iS n g h
报导 P S T V的强毒系及弱毒系寄主范 围试验
结果相似 。
C E V S及 C E V 均能浸染苦茄 R ut g o r s ,
C E V S在苦茄 R ut g e r s上表现为植株生 一长 阻
滞而严重矮化 , 叶片 给褶 ( 偏上性 ) , 接种后
16 天就出现明显症状 。 试验结束后 , 受试植
株株重平均 减 少 50 % ; 而 C E V 在 蕃 茄
R ut g e r s上呈现温和症状 , 叶片轻度约 褶 ,
病株略矮于对照植株 , 症状出现时间推延至
接种后 27 一 31 天 。 试验结束后植株平均减重
4 一 5 % 。
C E V 对 C E V s的干优效应 均以 纯 化
的 C E V s一 R N A 及 C E V 一 R N A 接种 蕃茄
R
u t g e r s , 以缓冲溶液接种作为对照 。 12 天
后分别将第一次的接种 C E V 植株及 缓冲溶
液接种作对照的植株各一半 , 再 用 C E V s接
种 。结果在指示植物上未能产生强烈的症状 ,
表明 C E V 能对寄主起保护作用 , 免 受第二
次接种的 C E V S的侵染 , 因 C E V S被预 先接
种的 C E V 所干扰 。 此与 F e r n o w 用 P S T V的
弱毒系在蕃茄上千扰强毒系的研究结果相一
致 。 在爪哇三七上试验的结果也相似 。
讨 论
一 、 经 1 9 8 3 ~ 1 9 8 4年的试验结果表明 ,
浙江黄岩本地早叶片组织中分离的裂皮类病
毒株系与甜橙类卡特尼娜 叶片 组织 中分 离
的裂皮类病毒株系是不同的两 个株 系 , 象
P S T V的弱毒系能干扰强毒系一样 , 前者能
干扰后者 。 关于本地早弱毒系干扰 强毒系的
田间试验在进行中 。 两种毒系的核普酸序列
分析 , 有待进一步研究 。
二 、我国种植柑桔历史悠久 , 品种繁多 ,
近几年又建立了好些商品性基地 。 一些柑桔
产区已发生裂皮病危害 , 其 中以湖南 、 湖北 、
四川 、 江西 、 广西等省较为严重 。 早年从美
国引入的脐橙和六十年代从摩洛哥引进的脐
血橙和卡特尼娜甜橙等品种 , 在我国分布较
广 。 这些品种的裂皮病已相当普遍 , 尤以积
和土黎檬为砧的易感此病 。 此外 , 一些老栽
培品种如新会橙 、 温州蜜柑也感染此病 。 因
此 , 防止裂皮病的蔓延刻不容缓 。 当前急需
解决的问题之一是确立一种准确 、 快速 、 简
易的诊断方法并制定有力的检疫措施 。 现行
的指示植物鉴定法是必要的 , 但需时间较长 ,
由于干扰因素多 , 影响其准确性 。 凝胶 电泳
法条件 绮刻 , 不易推广应用 。 分子探针方法
则准确 , 快速 , 一旦如能用生物素取代同位
素 , 使探针商品化 , 则将对控制裂皮病和其
他植物类病毒病的诊断提供可靠的途径 。
三 、 柑桔裂皮病的防治 , 国外借用病毒
脱毒的方法 , 正在进行茎尖微芽嫁接脱去裂
皮类病毒的试验 , 以期建立优 良的无毒母本
系 。 我国对茎尖嫁接脱毒已着手研究 , 但必
须注意到类病毒与病毒在寄主组织 中的分布
有所不同 , 类病毒R N A与寄主细胞核 染 色
体结合 , 更易在寄主分生组织中进行复制 。
据报导 , 经茎尖脱毒处理的 ,只有 50 %苗木未
能检出类病毒 , 何况后期难免不被感染 , 因
此对田间种植的植株必须定期检查 。 当前防
治柑桔裂皮病的另一措施 , 即对弱毒系干扰
保护作用的利用 。 如澳大利亚利用柑桔裂皮
病的弱毒系对寄主的保护作用 , 使寄主免受
强毒系的侵染 , 从而成倍地提高 柑 桔 的 产
量 。 弱毒系还可造就植株矮 化 , 有利于密植
和机械化操作 。 现在已知 , 类病毒中存在的
强毒系即致病性株系和弱毒系即非致病性株
系 , 两者在结构上有一定的差异 , 弱毒系较
强毒系少三个核普酸 。 这种结构上的差异不
仅与致病性有一定的关系 , 而 .且还表现出遗
传性的传递 。 为了防止柑桔裂皮病的蔓延 ,
必须加强对类病毒强毒系的控制和使弱毒系
得以延续的研究 。 这不仅是柑桔裂 皮 病 防
治 , 也是其他植物类病毒病防治的生物学途
径 , 在应用研究方面有着重要的意义 。
参考文献 ( 略 )
( 上接第 12 页 )
柑产量 、 树势 、 果实品质和贮藏性等诸方面均
有 良好的作用 , 主要 由于 :
仁一 ) 三种复合肥料均含有氮 、 磷 、 钾
不 同配比的养份 , 特别是磷 、 钾对弥补酸性
土壤中磷 、 钾养份的不足起着重要作用 , 由于磷对提高柑桔着花着果率有 良好的作用广月目因此磷 比率高的复合肥料着果率 明显地高于
其他处理 , 几 钾有促进果卖赓大的作用 , 所 以
钾比率高的产量也高 。
( 二 ) 凡经复合肥处理的桔树 , 长势普
遍 比单施尿素的对照好 , 其中尤以钾比率高
的为优 。 这是由于钾具有提高作物抗旱 、 抗
寒和抗病等抗逆能力 ,一 因而树势健壮 。 一 :
( 三 ) 果 实品质和贮藏性与果实的糖酸
含量较高有关 , 这是由于三种复合肥 中的较
高磷钾比率 , 尤以 工型复合肥料能有效地提
高糖酸含量 , 从而提高果实品质和贮藏性 。
四 、 小结
( 一 ) 三元复合肥料与单施尿素相比 ,
能显著增加产量 , 增强树势 , 提高果实品质
和贮藏性 。
( 二 ) 三元复合肥料的应用 , 应根据柑
桔对养份的需求和土壤养份的状 况 进 行 选
择 。 由凝灰岩发育的酸性红壤 , 用磷钾比率
高的复合肥料较为合宜 。