全 文 ：2012 年第 9 期 1281
收稿日期:2012-05-11
作者简介:黄 峰 (1988 －) ，江西黎川人，硕士生，植物病理学专业。E-mail:rm12407@ 126. com。
文献著录格式:黄峰，朱丽，侯欣，等 ． 瓯柑褐斑病病原鉴定 ［J］． 浙江农业科学，2012 (9) :1281 － 1282.
瓯柑褐斑病病原鉴定
黄 峰，朱 丽，侯 欣，李红叶
(浙江大学 生物技术研究所，浙江 杭州 310058)
摘 要:为鉴定温州和丽水地区所发生的柑橘病害类型，本研究从当地多个果园进行采样，检查和分离培
养获得大量的链格孢菌株 (Alternaria)。致病性试验证明这些链格孢菌中大部分能够引起类似褐斑症状。对其菌
株进行形态学和培养性状的观察，并扩增其多聚半乳糖醛酸酶 (endoPG)基因的部分序列进行分析，确定该病
害的病原为交链格孢菌 (A． alternata (Fr．)Keissler) ，该病害系柑橘褐斑病。
关键词:瓯柑;褐斑病;病原鉴定;交链格孢菌
中图分类号:S 436. 66 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2012)09-1281-02
瓯柑 (Citrus suavissima Hort． ex Tanaka)是温
州瓯海地区的传统栽培品种，至今已有 1 000 多年
的栽培历史，主产浙江温州，近年浙江丽水也有较
大规模的种植，在当地素有 “有林皆橘树，无水
不荷花”的诗句。此外，福建、广西等地也有少
量栽培［1］。2011 年 5 月中旬，温州和丽水瓯柑普
遍突发落叶、落果和枯梢现象，严重果园，株发病
率几乎是 100%，当年抽发的春梢顶部发黑、枯
死，仅留下基部少量叶片，幼果脱落所剩无几。实
地考察了温州市永嘉县上塘镇柯师湾村瓯柑示范基
地、瓯海区泽雅镇丰伟瓯柑种植场以及丽水市莲都
区老竹镇丽新畲族自治乡双坑村 3 个瓯柑园，发现
病害的田间症状与最近在重庆万州发现的红橘褐斑
病极为相似［2］。为证实这个推测，本文从这 3 个果
园采集发病的叶片、枝梢和果实，带回实验室鉴
定，证实了田间诊断。现将鉴定结果报道如下。
1 材料与方法
1. 1 病菌的分离培养
用手术刀片从发病叶片的病斑上刮下分生孢
子，制备成孢子悬浮液，根据方中达植病研究方法
进行单胞分离［3］，培养基为添加 50 μg·mL － 1的链
霉素和氨苄青霉素的 PDA，枝梢和果实病斑上产
生的分生孢子较少，则使用组织分离［3］，培养获
得分生孢子后再进行单胞分离。纯化菌株培养在
PDA 斜面，4 ℃保存。
1. 2 致病性测定
选取 代 表 菌 株 yjogy23 (永 嘉， 瓯 柑 )、
lslxogy21 (丽水，瓯柑)和 lslxpgy21 (丽水，椪
柑)进行接种试验。采集健康幼嫩的椪柑 (C．
reticulata Blanco cv． Pankon)叶片，用自来水冲洗
干净，再用 75% 的酒精擦拭 3 ～ 5 次，晾干，置
于垫有吸水纸的托盘中，以备接种。向已产生分生
孢子的培养皿 (12 h 光暗交替，10 d)加入 3 mL
无菌水，用灭菌玻璃棒刮擦菌落，获得带菌丝的粗
孢子悬浮液，经双层纱布过滤、离心 (10 000 r·
min － 1，1 min) ，弃上清液，加适量无菌水悬浮孢
子，配制成 105 ～ 106个·mL － 1的孢子悬浮液 (血
球计数板) ，吸取 2. 5 μL 滴在幼叶上。同时，接种
空白无菌水作为对照。托盘口封上保鲜膜保湿，置
27 ℃的培养箱中诱导发病。
1. 3 病原菌的鉴定
经致病性测定证实上述菌株具致病性后，通过
培养性状和子实体的形态学以及基因序列鉴定病原
种类。具体为:肉眼观察分离物在 PDA 培养基上
的菌落特征，测量菌落直径、计算生长速率;显微
镜 (Nikon Microscope ECLIPSE80i 显微镜)下观察
病斑或培养条件下产生的分生孢子梗和分生孢子，
记录形态特征，测量大小 (每菌株 30 个以上) ;
提取基因组各菌株的基因组 DNA，扩增、克隆和
测定多聚半乳糖醛酸酶 endoPG 基因部分序列［2］。
获得的序列到 http: / /www． ncbi． nlm． nih． gov
进行比对。
2 结果与分析
2. 1 田间症状
DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.2012.09.026
1282 2012 年第 9 期
发病树当年抽发的春梢顶部发黑枯死，仅留下
基部少量叶片，幼果脱落所剩无几。所调查的永嘉
县上塘镇柯师湾村基地的株发病率达 100%，瓯海
区泽雅镇基地的株发病率也在 50% 以上，丽水老
竹镇丽新畲族自治乡瓯柑园发病率也达 100%。幼
叶发病，初生褐色至黑色、油渍状的小点，扩大后
直径 0. 1 ～ 0. 5 cm，病斑无明显的黄色晕圈。近成
熟叶片发病，病斑较大，不规则，外围有明显的黄
色晕圈，褐色病变常沿叶脉扩展，形成具尾须状的
病斑。枝梢病斑与叶片类似。受害叶片极易脱落，
重病树常见大量无叶片，自上而下枯死的枝梢。刚
落花的幼果发病，果面产生针头状大小，凹陷的黑
色小点，以靠近果柄部的为多，受害幼果很快脱
落，稍大果实发病，病斑深褐色，周围有明显的黄
色晕圈，后病斑中央凹陷，变灰白色，病果常脱
落。田间所观察到的症状与红橘褐斑病［2］较相似。
2. 2 致病性测定
接种试验表明，菌株 yjogy23、 lslxogy21 和
lslxpgy21 均能感染椪柑的幼叶，48 h 内即可以形成
褐色小点，病斑逐渐扩大，周围黄色晕圈明显，与
自然条件下发病症状一致，3 个菌株接种后的发病
率分别为 87. 5%，40% 和 100%，而对照 (无菌
水)接种则不表现任何症状。从接种发病的叶片
病斑上可以检查到与接种菌株一致的链格孢菌分生
孢子和分生孢子梗，对发病叶片进行回分，同样也
可得到与接种菌株一致的菌落。
2. 3 病菌的鉴定
在 PDA 培养基上生长 7 d 后，菌落呈灰色至
橄榄色或青褐色，平均生长速率 9. 55 mm· d － 1。
分生孢子梗单生或数根簇生，直立或顶端微弯曲，
有分隔，未见分枝，色泽从基部到顶部深褐色渐变
为浅褐色，大小 (30. 4 ～ 70. 8) μm × (6. 8 ～
10. 7)μm，平均 51. 5 × 9. 0 μm。分生孢子单生或
链生，倒棍棒形、倒梨形或近椭圆形，淡褐色至褐
色，具纵横隔膜，大小 (16. 4 ～ 38. 6) μm ×
(5. 5 ～ 14. 4)μm，平均 (26. 0 × 10. 1)μm。采用
PG3 和 PG
［4］
2 扩增获得约为 500 bp 的多聚半乳糖醛
酸酶基因 (endoPG)部分序列，3 个菌株间的序列
完全 一 致，以 菌 株 lslxogy21 的 endoPG 序 列
(JN380920 ) 到 http: / /www． ncbi． nlm． nih．
gov 进行比对，发现其序列与红橘褐斑菌的相应基
因序列 (HQ641564、HQ641565)［2］完全一致;与
Peever 等［4］报道的柑橘褐斑病菌 (A． alternata)
菌株 AC325 的多聚半乳糖醛酸酶基因 (aapg-1)
(AB047682)的相应序列一致性为 99. 9%。因此，
根据分子鉴定所提供的信息，结合病原菌的形态学
特征和培养性状，认为菌株 yjogy23， lslxogy21 和
lslxpgy21 均 为 交 链 格 孢 菌 (Alternaria alternata
(Fr．)Keissler)。
3 小结和讨论
尽管国外柑橘褐斑病在 1903 年已经发现，如
今在南非、以色列、土耳其、西班牙、巴西、阿根
廷、秘鲁等多个国家的柑橘产区都发生为害，但我
国直到 2010 年首次正式报道该病害［5］。据 2010 年
在重庆万州和 2011 年田间观察发现，该病害的危
害性十分严重，重病果园几乎绝收，带病斑果实也
无法上市销售，而且对树势构成严重的影响［2］。
本实验也证实，褐斑病菌可以为害椪柑，在云南瑞
丽的椪柑上发生非常普遍，是局部地区的最主要病
害。有关柑橘褐斑病在我国橘区的发生规律和防治
措施缺乏研究，而包括椪柑、红橘、瓯柑在内的橘
类是我国栽培柑橘中的一个大类，还有很多问题有
待进一步研究。
参考文献:
［1］ 邓秀新，彭成绩，陈竹生 ． 中国柑橘品种 ［M］． 北京:
中国农业出版社，2008.
［2］ 陈昌盛，黄峰，程兰，等 ． 红橘褐斑病病原鉴定 ［J］． 植
物病理学报，2011，41 (5) :449 － 455.
［3］ 方中达 ． 植病研究方法 ［M］． 3 版 ． 北京:农业出版
社，1998.
［4］ Peever T L，Su G，Carpenter-Boggs L． Molecular systematics
of citrus-associated Alternaria species ［J］． Mycologia，2004
(96) :119 － 134.
［5］ Ang X F，Li Z A，Tang K Z． First report of Alternaria brown
spot of citrus caused by Alternaria alternata in Yunnan
Province，China ［J］． Plant Disease，2010 (94) :375.
(责任编辑:张瑞麟)