全 文 ：飞龙掌血内生真菌的分离及其抑菌活性研究
郭婧玉1，孙越1，王禹锟1，刘学1，2
(1．牡丹江医学院 第二附属医院;2．牡丹江友搏药业股份有限公司，黑龙江 牡丹江 157000)
摘要:目的 研究药用植物飞龙掌血内生真菌的多样性及其次生代谢产物抑菌活性，旨在寻求新型抑菌
活性物质。方法 采用内生菌常规分离法对健康飞龙掌血植株的根、茎进行内生真菌的分离鉴定。采用
滤纸片法和菌饼法分别对内生真菌及其次生代谢产物进行抑菌试验。结果 所得 21 株飞龙掌血内生真
菌，其中有 18 株对至少 1 种实验菌有抑菌作用，占总分离菌株的 85． 7%。有 5 株内生真菌次生代谢产
物对至少 1 种实验菌有抑菌作用，占总分离菌株的 24． 0%。结论 飞龙掌血内生真菌的分离及其抑菌活
性研究，可为寻找新型抑菌物质提供资源。
关键词:飞龙掌血;内生真菌;抑菌活性
中图分类号:Ｒ284． 1 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2014． 04． 007
文章编号:1006-8783(2014)04-0422-05
Study on isolation of endophytic fungi from Toddalia asiatica and their antimicrobial activity
GUO Jingyu1，SUN Yue1，WANG Yukun1，LIU Xue1，2
(1． The Second affiliated Hospital of Mudanjiang Medical College;2． Mudanjiang Youbo Pharmaceutical
Co．，LTD，Mudanjiang 157000，China)
Abstract:Objective To investigate endophytic fungi from Toddalia asiatica and antimicrobial effect of their
secondary metabolites． Methods Endophytic fungi was isolated from the roots and stems of healthy
Toddalia asiatica and identified by conventional method． Antimicrobial tests of the endophytic fungi and
their secondary metabolites were carried out by colony disc method and filter paper disc method． Ｒesults
Among 21 strains of endophytic fungi isolated from Toddalia asiatica，18 strains(85． 7% of the total strains
isolated)showed the antimicrobial activity against at least one of 12 experimental bacteria，and the
secondary metabolites of 5 strains(24． 0% of the total strains isolated)presented antimicrobial activity
against at least one of experimental bacteria． Conclusion The study on endophytic fungi and their
secondary metabolites from Toddalia asiatica may provide resources for new antimicrobial products．
Key words:Toddalia asiatica;mycorrhizal fungi;antifungal activity
收稿日期:2014-03-27
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12541851)
作者简介:郭婧玉(1984—)，女，硕士研究生，医师，从事口腔疾病研究;通信作者:刘学(1985—)，男，硕士研究生，工程师，从
事中药提取技术及质量控制研究。
网络出版时间:2014-07-08 16:05 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /doi /10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2014． 04． 007． html
在自然界的长期进化中，一些真菌在植物体内
寻找到了适宜的生存环境，并与之和谐共存，形成了
植物体微生态系统。它们广泛存在于植物根、茎、叶
等组织器官内，可通过组织学方法或 DNA提取等方
法来证明其内生。由于存在内生真菌的植株并未在
表型特征上出现外在症状，所以内生真菌一直被人
们所忽视［1-3］。
飞龙掌血［Toddalia asiatica(L．)Lam．］别名见
血飞、大救驾等，属芸香科飞龙掌血属植物。味苦、
性温，具有活血散瘀、祛风除湿、消肿止痛之功
效［5］。枝干密布倒钩刺，新枝淡绿、黄绿色，老枝多
为褐色，广泛分布于陕西、湖北、湖南、浙江、福建等
地的小乔木、灌木次生林中［4］。
研究表明，植物内生真菌具有抗感染、抗菌、抗
肿瘤等作用，而中药飞龙掌血分布广泛、易于种植，
是新型抑菌活性物质的重要来源，因此研究飞龙掌
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Aug． 2014，30(4)
血内生真菌及其次生代谢产物对新兴抑菌活性药物
的开发具有重要意义。本研究拟从药用植物飞龙掌
血中分离内生真菌及其次生代谢产物，以期获得具
有优良抑菌活性的菌株，为寻找新型活性抑菌物质
提供基础。
1 仪器与材料
1． 1 仪器
HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器
厂);PL303 电子精密天平(有效量程 0． 001 g，梅特
勒-托利多仪器有限公司);DNP9082 电热恒温培养
箱(上海精密实验设备有限公司);DHG-9140 电热
恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司);
YXQ-SG46 手提式压力蒸汽灭菌锅(镇海金鑫医疗
器械有限公司);SW-CJ-ZFD超净工作台(苏州安康
空气技术有限公司);1810-B 石英自动双重高纯水
蒸馏器(金坛市康华电子仪器制造厂)。
1． 2 材料
飞龙掌血购自上海江莱生物科技有限公司，经
牡丹江医学院药学院生药教研室吴宜艳教授鉴定为
芸香科植物飞龙掌血。
供试菌种:大肠埃希菌(Escherichia coli)CMCC
44102、枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis)CMCC
63501、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)
CMCC 26003、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CMCC
63202、铜绿假单孢菌 (Pseudomonas aeruginosa)
CMCC 10104、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)
CMCC 54002、肺炎克雷伯菌(Klebsiella penumoniae)
CMCC 46117、鲍 曼 不 动 杆 菌 (Acinetobacter
baumannii)GIM 1． 650、酿脓链球菌(Streptococcus
pyogenes)CMCCB 32086、屎肠球菌 (Enterococcus
faecium)GIM 1． 388、粪肠球菌(Enterococcus facalis)
GIM 1． 202、白色假丝酵母菌(Candida albicans)
CMCC 98001。上述菌种均为标准菌株，分别购自中
国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、广东省
微生物菌种保藏中心(GIM)、中国医学细菌保藏管
理中心(CMCCB)。
试剂:葡萄糖(20130913)、琼脂(20130401)购
自天津市科密欧化学试剂有限公司;牛肉膏
(20110422)、蛋白胨(20120617)购自北京奥博星生
物技术有限公司。
马铃薯培养基(PDA):称取马铃薯 200 g，加水
煮沸 30 min 后滤过，取滤液。加入葡萄糖 20 g，溶
解煮沸，加入琼脂，溶化后补水至 1 000 mL，倒入锥
形瓶中高压 121 ℃灭菌 30 min，倒平板，检菌。
查氏培养基:取 NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4、
KCl各 0． 5 g，FeSO4 0． 01 g，蔗糖 30 g，加热煮沸后
加琼脂 20 g，溶化后补水至 1 000 mL，倒入锥形瓶中
高压 121 ℃灭菌 30 min，倒平板，检菌。
发酵培养基(PDB):称取马铃薯 200 g，加水煮
沸 30 min 后滤过，取滤液。加入葡萄糖 20 g，煮沸
溶解，补水至 1 000 mL，倒入锥形瓶中高压 121 ℃灭
菌 30 min。
抑菌试验培养基:称取牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，
NaCl 5 g，加水溶解，调 pH在 7． 0 ～ 7． 2 范围内。加
热煮沸后加琼脂 16 g，溶化后补水至 1 000 mL，倒入
锥形瓶中高压 121 ℃灭菌 30 min，倒平板，检菌。
实验用水为蒸馏水，其余试剂为分析纯。
2 方法
2． 1 内生真菌的分离、纯化［6-7］
选取飞龙掌血根、茎，清水洗净表面杂质，无菌
滤纸吸干表面水分，切成 1 cm 小段进行表面消毒。
依次用 75%(体积分数，下同)乙醇漂洗 1 min、10%
(体积分数)H2O2 漂洗 15 min、75%乙醇漂洗 1 min、
无菌水冲洗 3 次。将消毒后飞龙掌血置于 PDA 中，
28 ℃恒温培养 10 d，待周围长出菌丝后，及时挑取
菌丝转入平板并经多次划线分离纯化，保存，备用。
为确保表面彻底消毒，取最后 1 次无菌水冲洗液进
行平板培养，作为对照。另将消毒后的实验材料在
培养平板上滚动 1 周，培养，作为对照。
2． 2 内生真菌的鉴定［8］
菌属的分类鉴定主要是依据形态分类学方法，
根据真菌产生的孢子结构特征和孢子形态特征进行
归属划分。首先在 PDA上观察菌落特征，挑菌种于
查氏培养基中培养，待长成后参照《真菌鉴定手册》
进行菌株的鉴定。
2． 3 次生代谢产物的培养
将分离所得飞龙掌血内生真菌菌种分别接种于
PDB中，28 ℃，150 r·min －1摇床培养 7 d。无菌条
件下滤膜滤过，取滤液，即得。
2． 4 抑菌试验
采用菌饼法测定菌种抑菌活性，纸片法测定代
谢产物抑菌活性［9-10］。
2． 4． 1 菌饼法 用直径 8 mm的打孔器在培养 7 d
的内生真菌菌落上制备菌饼，并放于含实验菌的培
养基上，每菌株重复 3 次，PDA 作阴性对照。阳性
对照为含链霉素和氟康唑琼脂培养基，将制备好的
平板 37 ℃恒温培养 24 h，测量抑菌圈大小。
2． 4． 2 纸片法 将无菌滤纸片(r = 60 mm)浸于各
324第 4 期 郭婧玉，等．飞龙掌血内生真菌的分离及其抑菌活性研究
内生真菌次生代谢产物溶液中 20 min，取出放于含
实验菌的培养基上，每平板 2 点，每株内生真菌重复
3 次，PDA作阴性对照，阳性对照为含链霉素和氟康
唑的琼脂培养基，将制备好的平板 37 ℃恒温培养
24 h，测量抑菌圈大小。
以美国临床实验室标准化协会(CLSI)为标准，
抑菌环直径为依据，判断内生真菌及其次生代谢产
物的药物敏感性。
3 结果与讨论
3． 1 飞龙掌血内生真菌的多样性
从飞龙掌血根、茎中共分离出 21株内生真菌，从
根中分离得到 12 株，茎中分离得到 9 株，分别占内生
菌株总数的 57． 14%和 42． 86%。对其进行分类鉴
定，21株内生真菌分属于 5 个属，其中链格孢属和镰
刀菌属为飞龙掌血的优势菌属，共占分离总菌株的
90. 48%。飞龙掌血内生真菌菌株分布结果见表 1。
3． 2 飞龙掌血内生真菌的抑菌活性
21 株分离的内生真菌的抑菌活性试验结果表
明，有 18 株内生真菌对至少 1 种指示菌有不同程
度的抑菌活性，占所得菌株的 85. 7%;有 4 株内生
真菌对 12 种指示菌均产生不同程度的抑菌活性，
占所得菌株的 19. 1%。其中对枯草芽孢杆菌(A)、
短小芽孢杆菌(B)、金黄色葡萄球菌(C)、大肠埃希
菌(D)、单增李斯特菌(E)、鲍曼不动杆菌(F)、肺炎
克雷伯菌(G)、屎肠球菌(H)、铜绿假单孢菌(I)、酿
脓链球菌(J)、粪肠球菌(K)和白色假丝酵母菌(L)
具有抑菌活性的菌株分别占总分离菌株的 62． 0%、
6. 67%、66． 67%、71． 4%、57． 1%、81． 0%、66． 7%、
76. 2%、76． 2%、66． 7%、66． 7%和 57． 1%。飞龙掌
血内生真菌抑菌活性筛选结果见表 2。
表 1 飞龙掌血不同组织中内生真菌的种类和数量
Table 1 Distribution of endophytic fungi isolated from Toddalia
asiatica
编号 菌属
植物组织
根 茎
总数
所占
比例 /%
1 镰刀菌属 Fusarium 5 4 9 42． 86
2 青霉菌属 Penicillium 0 1 1 4． 76
3 链格孢属 Alternaria 2 4 6 28． 57
4 木霉属 Trichoderma 3 0 3 14． 28
5 毛壳菌属 Chaetomium 1 1 2 9． 52
表 2 飞龙掌血内生真菌对 12 种试验菌的抑菌活性筛选结果
Table 2 Antimicrobial activities of endophytic fungi isolated from Toddalia asiatica on the tested organisms
菌属 编号
抑菌效果
A B C D E F G H I J K L
镰刀菌属 Fusarium FX1 + + + + + － + + + + + + － + + + + + + + －
FX2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
FX3 － + + + + + + + + + － + + + + － － + +
FX4 + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
FX5 － － － － － － － － － － － －
FX6 + + + + + + + + + － + + + + + + － + + － +
FX7 － － + + － － + + － － － － + + +
FX8 + + － + + － + + + + + + + + + + + + + －
FX9 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
链格孢属 Alternaria FX10 － + + + + + － + + + + + + + + + － + + +
FX11 + + + + + + + + + + － + + + + + + + + + + －
FX12 + + － + + + + － + + + + + + + + + +
FX13 － － － － － － － － － － － －
FX14 － + + + + + + + － + － + + + + + + + － +
FX15 + + + + + － + + － + + + + + + + + + + + +
毛壳菌属 Chaetomium FX16 － － － － － － － － － － － －
FX17 + + + － + + + + + + + + + + + + + + + + －
木霉属 Trichoderma FX18 + + + + + － + + + + + + + + + + + + + + + +
FX19 － + + + + + － + + + + + + + + + + － －
FX20 + + － + + + + + + + + + － + + － + －
青霉菌属 Penicillium FX21 + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
链霉素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + －
氟康唑 － － － － － － － － － － － － + + +
注:“－”表示无活性;“+”表示抑菌圈直径 ＜ 11 mm;“+ +”表示抑菌圈直径 11 ～ 15 mm;“+ + +”表示抑菌圈直径 ＞ 15 mm。
424 广东药学院学报 第 30 卷
3． 3 飞龙掌血内生真菌次生代谢产物的抑菌活性
对 21 株内生真菌次生代谢产物进行抑菌活性
试验，结果显示，有 5 株内生真菌次生代谢产物至
少对 1 种指示菌有不同程度的抑菌活性，占总分离
菌株的 24． 0%;有 1 株内生真菌次生代谢产物对 12
种指示菌有不同程度的抑菌活性，占总分离菌株的
4． 8%，其中对枯草芽孢杆菌(A)、短小芽孢杆菌
(B)、金黄色葡萄球菌(C)、大肠埃希菌(D)、单增李
斯特菌(E)、鲍曼不动杆菌(F)、肺炎克雷伯菌(G)、
屎肠球菌(H)、铜绿假单孢菌(I)、酿脓链球菌(J)、
粪肠球菌(K)和白色假丝酵母菌(L)具有抑菌活性
的菌株分别占总分离次生代谢菌株的 14. 3%、
14. 3%、9. 5%、4. 8%、14. 4%、9. 5%、14. 3%、
4. 8%、9. 5%、14. 3%、9. 5%和 9. 5%。飞龙掌血内
生真菌次生代谢产物抑菌活性筛选结果见表 3。
表 3 飞龙掌血内生真菌次生代谢产物对 12 种试验菌的抑菌活性筛选结果
Table 3 Antimicrobial activities of the secondary metabolites of endophytic fungi isolated from Toddalia asiatica to the tested
organisims
菌属 编号
抑菌效果
A B C D E F G H I J K L
镰刀菌属 Fusarium FX1 － － － － － － － － － － － －
FX2 － － － － － － － － － － － －
FX3 － + － － + － － － － － － －
FX4 － － － － － － － － － － － －
FX5 － － － － － － － － － － － －
FX6 － － － － － － － － － － － －
FX7 － － － － － － － － － － － －
FX8 － － － － － － － － － － － －
FX9 + + + + + + + + + + + +
链格孢属 Alternaria FX10 － － － － － － － － － － － －
FX11 + － + － + － + + － + + － －
FX12 － － － － － － － － － － － －
FX13 － － － － － － － － － － － －
FX14 － － － － － － － － － － － －
FX15 － － － － － － － － － － － －
毛壳菌属 Chaetomium FX16 － － － － － － － － － － － －
FX17 － － － － － － － － － － － －
木霉属 Trichoderma FX18 + + － － － + + － － + + + +
FX19 － － － － － － － － － － － －
FX20 － － － － － － － － － － － －
青霉菌属 Penicillium FX21 － － － － － － － － － － － －
链霉素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + －
氟康唑 － － － － － － － － － － － － + + +
注:“－”表示无活性;“+”表示抑菌圈直径 ＜ 11 mm;“+ +”表示抑菌圈直径 11 ～ 15 mm;“+ + +”表示抑菌圈直径 ＞ 15 mm。
4 讨论
本研究表明分离出的内生真菌种群丰富，分布
广泛。从根、茎中分离出的各内生真菌数量间无明
显差异。
选用革兰阳性菌、革兰阴性菌以及真菌的代表
菌枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、
大肠埃希菌、单增李斯特菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克
雷伯菌、屎肠球菌、铜绿假单孢菌、酿脓链球菌、粪肠
球菌和白色假丝酵母菌共 12 种菌，用于从飞龙掌血
根、茎中分离到的内生真菌及其次生代谢产物的抗
菌作用研究。所得 21 株内生真菌分属镰刀菌属、链
格孢属、毛壳菌属、木霉属、青霉菌属及其次生代谢
产物，镰刀菌属和链格孢属为优势菌属，占分离内生
真菌的 71． 4 %。抑菌结果表明，飞龙掌血内生真菌
具有广泛的抑菌活性，大多数指示菌株都可以筛选
524第 4 期 郭婧玉，等．飞龙掌血内生真菌的分离及其抑菌活性研究
到抑菌效果较好的菌株。同一菌属的内生真菌对不
同供试菌的拮抗作用可能相同也可能不同，譬如:除
FX5 菌株外，镰刀菌属菌株对鲍曼不动杆菌均产生
拮抗作用;FX19 和 FX20 同属木霉属，但 FX19 对短
小芽孢杆菌、屎肠球菌、酿脓链球菌有拮抗作用，对
枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、粪肠球菌无拮抗作
用;而 FX20 对枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、粪肠
球菌有拮抗作用，对短小芽孢杆菌、屎肠球菌、酿脓
链球菌无拮抗作用。
菌株 FX2、FX4、FX9 和 FX21 对 12 种指示菌均
具有抑菌活性，内生真菌次生代谢产物 FX9 对 12
种指示菌具有抑菌活性。次生代谢产物对指示菌的
抑菌效果明显低于内生真菌菌体，可能是由于次生
代谢产物溶液的质量浓度较低，有效活性成分质量
分数较低的缘故。
试验证明，飞龙掌血内生真菌及其代谢产物具
有广谱抑菌作用，对植物内生真菌的深入开发可为
新型活性化合物的筛选提供新思路，对濒危药用植
物亦具有保护意义。
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(责任编辑:陈翔
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)
对抗癌药 MTX耐受的干细胞
急性淋巴细胞白血病为常见的儿童癌症，氨甲蝶呤(MTX)为治疗该疾病的药物。MTX 的主要毒副作用是长
期使用会使骨的矿物质密度降低，导致患者产生骨质疏松及骨组织受损症状。研究人员认为，对化疗药物耐受的
干细胞可以促进骨骼的生长，减免 MTX 的毒副作用。最近，一项新研究结果表明，由脂肪衍生的人类干细胞
(adipose-derived stem cells，ASCs))很可能会对 MTX 产生耐受。相关的研究结果于 6 月 30 日提前在线发表在
《Experimental Cell Ｒesearch》上。
研究人员进行大量的基础研究，寻找有助于使 ASCs 从混合细胞培养物中纯化的化合物，并让 ASCs 大量增
殖。同时，研究人员对化疗药物进行测试，看 ASCs对哪些药物具有耐受性。
研究人员将纯 ASC培养物、“间质血管碎片(SVF)”组织样本(为含 ASCs的多种细胞)、及人成纤维细胞培养
物暴露于治疗量的抗癌药物中，暴露时间为 24 h。接下来的 10 d，对这些细胞群的表现进行测定，并测定 MTX对
纯 ASC培养物和 SVF 中 ASCs的增殖及转化成其他组织的影响。
研究人员发现:阿糖胞苷、长春新碱和依托泊苷 3 种抗癌药物会使 3 组细胞受损;与人成纤维细胞相比，ASCs
能耐受一定剂量的长春新碱及 MTX;治疗量的MTX对 ASC活性，如细胞分裂、衰老、转化成骨、脂肪或软骨组织等
的影响很小或无影响。进一步研究发现，ASCs对 MTX耐受与二氢叶酸还原酶有关。
虽然研究人员已经发现 ASCs对 MTX具有耐受性，但要将该试验结果应用于临床还需要进行大量的试验，包
括延长 ASC暴露于 MTX的时间、建造相关的动物模型进行动物试验等。
(Experimental Cell Ｒesearch，2014;DOI:10． 1016 / j． yexcr． 2014． 06． 015 温玉琴 编译)
624 广东药学院学报 第 30 卷